DE2455981A1

DE2455981A1 - Verfahren und vorrichtung zur feststellung von pathogenen mikroben

Info

Publication number: DE2455981A1
Application number: DE19742455981
Authority: DE
Inventors: Gordon Lee Dorn; Joseph Macglashan Hill
Original assignee: Wadley Res Inst & Blood Bank
Current assignee: Wadley Res Inst & Blood Bank
Priority date: 1974-01-30
Filing date: 1974-11-27
Publication date: 1975-07-31
Also published as: CA1036055A; FR2264593A1; JPS51105891A; AU7511974A; DE2455981C2; GB1475015A; US3875012A; JPS5812061B2; FR2264593B1; IT1029614B

Description

UEXKÜLL & STOLBESG PATENTANWÄLTE

2 HAMBURG 52

BESELERSTRASSE «

DR. J.-O. FRHR. von UEXKÜLL DR. ULRICH GRAF STOLBERG

DIPL.-ING. JÜRGEN SUCHANTKE

J.K. and Susie L. Wadley (Prio: 30. Januar 1974

Research Institute and Blood Bank US 437 890 - 11622) 9000 Harry Hines Boulevard

Dallas, County of Dallas, Texas, U.S.A.

Hamburg, den 26. November 1974

Verfahren und Vorrichtung zur Feststellung von pathogenen

Mikroben

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtung zur Feststellung von pathogenen Mikroben in Körperflüssigkeitsproben.

insbesondere betrifft die Erfindung einen neuartigen Behälter zur selektiven Extraktion von Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe, zur Diagnose von Septikämie.

Ssptikämie, also die Anwesenheit von pathogenen Mikroorganismen im BIu'., gehört zu den schwersten Infektionskrankheiten. Trotz einer großen Zahl von Antibiotika und Fungiziden beträgt die Mortalität für Septikämie etwa 25 %. Wenn darüber hinaus_<rdie")' .„ Septikämie von einem Schock begleitet ist, steigt die Mortalität auf über 60 % an. Patienten mit zehrenden Krankheiten, oder nach schweren Operationen, oder Patienten, die Immunsuppresiva oder Zytostatika erhalten, sind besonders anfällig gegenüber Septikämie.

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Zur Bekämpfung der Septikämie ist die frühzeitige Anwendung von geeignetem Antibiotika besonders wichtig. Es ist daher für den Arzt unbedingt notwendig, nicht nur so früh wie möglich zu erfahren, ob Septikämie vorliegt, sondern ebenfalls die Art der auslösenden Mikroorganismen und die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegenüber Antibiotika kennenzulernen. Die genaue Diagnose der Septikämie hängt daher von einer möglichst schnellen und wirksamen quantitativen Analyse des Patientenblutes ab.

Bisher wurden im wesentlichen drei analytische Verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen in KörperflÜDsigkeiten durchgeführt. Das. üblichste Verfahren ist das Züchten einer Kultur im flüssigen Brühmedium. Andere übliche Verfahren sind die sogenannte Gießplattenmethode und die sogenannte Filtrationsmethode. Jedes dieser Verfahren weist jedoch Nachteile auf, und nach keinem dis Verfahren kann ein schneller Nachweis von Mikroorganismen in der Blutprobe erfolgen. Das Verfahren der Untersuchung einer Kultur im flüssigen Brühmedium ist nicht quantitativ, während das Gießplattenverfahren und das Filtrationsverfahren offen durchgeführte Verfahren sind, die einer externen Verseuchung, beispielsweise von der Laboratiumsluft oder dem Personal her unterliegen.

Darüber hinaus wurde gemäß DT-OS 2 406 362 ein verbessertes quantitativ und schnell durchzuführendes Verfahren so zum Nachweis der Anwesenheit von pathogenen Mikroben in einer Flüssigkeitsprobe sowie eine hierfür geeignete Vorrichtung

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vorgeschlagen. Nach diesem Verfahren wird eine Körperflüssigkeitsprobe beispielsweise Blut, auf ein Flüssigfiltermedium in einer umschlossenen, sterilen Zone aufgebracht. Das Flüssigfiltermedium hat eine größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe und stellt eine sterile, wäßrige Lösung dar, die selektiv pathogene Mikroben aus der Flüssigkeitsprobe aufnimmt. Anschließend wird die umschlossene, sterile Zone zentrifugiert, wobei die Flüssigkeitsprobe gegen das Filtermedium gedrückt wird, wodurch die pathogenen Mikroben

veranlaßt werden, selektiv in das Filtermedium überzugehen und sich von der Masse der Flüssigkeitsprobe abzutrennen. Dann wird das flüssige Filtermedium mit den darin enthaltenen p<rthogenen Mikroben vom Rest der Flüssigkeibsprobe abgetrennt und Pr¹ oben von flüssigem Filtermedium werden den üblichen Kulturbedinungen unterworfen.".

Das oben beschriebene verbesserte Verfahren stellt ein sehr schnelles und wirksames Verfahren zum Abtrennen pathogener Mikroben aus einer Flüssigkeitsprobe dar. In diesem Verfahren wird jedoch der Probeflüssigkeit vor dem Injizieren in die das flüssige Filtermedium enthaltende Zone ein Lyse-- und Antikoagulationsmittel beigemischt. Manche flüssigen Filtermedien sind mit einigen Vorbehandlungs- und/oder Lysemitteln unverträglich. Bislang war es nicht möglich, diese zwei Stoffe in einem sterilen Zentrifugierröhrchen über längere Zeiträume vermischt zu halten. Daher mußte die Probeflüssigkeit einer möglichen externen Verseuchung durch den zusätzlichen Mischvorgang unterworfen werden, der natürlich einen zusätzlichen Eingriff in das geschlossene System bedeutet.

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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Behälter zur Durchführung des oben beschriebenen verbesserten Verfahrens vorzuschlagen, bei dem das Lysemittel aseptisch in das flüssiges Filtermedium enthaltende evakuierte Zentrifugierröhrchen eingebracht werden kann und dadurch die Möglichkeit besteht, die Blutprobe oder die Probeflüssigkeit unmittelbar vor dem Zentrifugieren einzubringen.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Behälter zur Aufnahme von zu mischenden und zu zentrifugierenden Stoffen vorgeschlagen, der gekennzeichnet ist durch ein verschlossenes, längliches Zentrifugierröhrchens mit einem ersten und einem zweiten Ende und einer auf weniger als Atmosphärendruck evakuierten Kammer, durch zv/ei jeweils das erste und das zweite. Ende des Zentrifagierröhrchen dichtend verschließende Durchstichkappen, durch eine an dem Zentrifugierröhrchen angebrachte, eine injizierbare Flüssigkeit enthaltende und mit der zweiten Durchstichkappe in Verbindung stehende geschlossene Endkammer, und durch eine in der Endkammer angeordnete Injektionsnadel zum übergang der Flüssigkeit aus der Endkammer durch die zweite Durchstichkappe in die evakuierte Kammer.

In einer Ausfuhrungsform ist die Injektionsnadel als Hohlnadel hin und hsr bewegbar in der Endkammer angebracht und weist eine erste öffnung an ihrer Spitze und eine zweite Öffnung in ihrem Schaft auf. Wird die Nadel gegen die zweite Durchstichkappe gedruckt, dann durchsticht sie diese und ihre erste öffnung dringt in die evakuierten Kammer, während die zweite öffnung

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- 5 in der Endkammer liegt*

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die evakuierte Kammer ein wäßriges Filtermedium mit einer größeren Dichte als die Probeflüssigkeit und dient zur selektiven Aufnahme von pathogenen Mikroben, die Endkammer enthält eine wäßrige Lösung eines Lysemittels, beispielsweise aufgeschlämmten Saponinextrakt und wahlweise andere Stoffe wie Antikoagulantien und/oder ein Sauerstoffspülmittel wie Ascorbinsäure und/oder ein thyoglykolsaures Salz. Vorzugsweise sind solche Stoffe stabil genug gegen Zersetzen oder Aufbrechen im Autoclaven.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der zur Aufnahme von zu mischenden und zu zentrifugierenden Stoffen geeignete Behälter eine Spritze zur Entnahme der wäßrigen Filterlösung aus der evakuierten Kammer auf, deren Nadel so lang ist, daß sie nur die Stärke der ersten Durchstichkappe durchdringt und im wesentlichen nicht in das^ wäßrige Filtermedium eindringt.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen im einzelnen näher erläutert. Es zeigen:

Figur 1 einen Querschnitt einer bevorzugten erfindungsgemäßen

Ausführungsform des Zentrifugier- und Mischröhrchens; Figur 2 einen Querschnitt des Zentrifugierröhrchens aus Figur 1, wobei die in der Endkammer angeordnete Nadel die zweite Durchstichkappe durchsticht;

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Figur 3 einen Querschnitt des Zentrifugierröhrchens aus Figur 1, wobei eine Flüssigkeitsprobe durch die erste Durchstichkappe in die Kammer injiziert wird;

Figur 4 einen Querschnitt des Zentrifugierröhrchens aus Figur 3, wobei das wäßrige Filtermedium mittels einer die erste Durchstichkappe durchstechenden Nadel entnommen wird;

Figur 5 ein Querschnitt einer anderen erfindungsgemäßen Ausführ ungsform; und

Figur 6 ein Querschnitt der in Figur 5 dargestellten Ausführungsforrc, wobei die in der Endkammer liegende Nadel die zweite Durchstichkappe durchsticht.

Mit dem erfindungsgemäßen Zentrifugierröhrchen läßt sich das in der deutschen Patentanmeldung P 24 06 362.5 vorgeschlagene verbesserte Verfahren zum Nachweis von pathogenen Mikroben in verbesserter Weise durchführen.

Figur 1 zeigt den Behälter 10 zur Aufnahme von zu mischenden und zu zentrifugierenden Stoffen mit einem länglichen, ringförmigen Zentrifugierröhrchen 12, mit einer das untere Ende des 1 isntrifugierröhrchens verschließenden Durchstichkappe 14 und einer das obere Ende des Zentrifugierröhrchens dichtend verschließenden Durchstichkappe 16. Darüber hinaus wird das obere Ende der Durchstichkappe 16 durch eine Kappe 18 umschlossen. Die Kappe 18 trägt ein Innengewinde 20, und kann über das obere Ende des Zentrifugierröhrchens 12 und mit dem Außengewinde 22 verschraubt werden.

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Das Innengewinde 20 der mit einem zylindrischen Körper ausgebildeten Kappe 18 erstreckt sieh anschließend an die Schulter 24, die den Außenrand der Durchstichkappe 16 aufnimmt. Die Außenkante der Schulter 24 bildet auch die öffnung des Hohlraumes 26, der vorzugsweise kurz und zylindrisch ausgebildet ist. Das obere Ende des Hohlraums 26 wird durch eine'Abschlußwand 28 verschlossen. Die Stange 30 eines Druckknopfelementes 32 läuft durch die in der Abschlußwand 28 vorhandene öffnung 33. IJiLe Stange 30 trägt auch an ihrem Vorderende eine Hohlnadel 34. Die Hohlnadel 34 v/eist auch eine scharfe, abgeschrägte Spitze 36 und eine öffnung' in ihrem Schaft auf. Eine Federscheibe 40 liegt dicht um das obere Ende der Hohlnadel 34, um den Innenraum des Hohlraumes 2G oberhalb der öffnung 38 der Hohlnadel 34 zu verschließen.

Das Zentrifugierröhrchen 12 kann aus Glas oder hartem Kunststoff, wie PoiykohlenwassersLoff oder Polypropylen gemacht sein. Die Kappe 18 kann ebenfalls aus einem harten Kunststoff geformt s-2in. Die Durchstichkappe 14 kann ein selbstdichtender Guirtmistopfen sein. Das Vorderende der Durchstichkappe 14 weist eine kegelstumpf förrnige Ausnehmung 14a auf. Die durchstechbare Einlage 14b bildet den Boden der kegelstumpfförmigen Ausnehmung 14a. Die Durchstichkappe 16 kann ebenfalls ein durchstechbarer, selbstdichtender Gummistopfen sein. Das obere Ende der Durchstichkappe 16 weist eine Ausnehmung 16a und das untere Ende eine Ausnehmung 16b auf. Die Ausnehmungen 16a und 16b werden durch eine durchstechbare Einlage 16d voneinander getrennt. Falls gewünscht, können die Durchstichkappen 14 und 16 auch die gleiche Form haben. Es ist lediglich wünschenswert, daß die Durchstichkappe 16

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eine Ausnehmung 16a in ihrem oberen Teil und die Durchstichkappe eine kegelstumpfförmige Ausnehmung 14a in ihrem unteren Bereich aufweist. Ein flüssiges Filtermedium 42 und eine evakuierte Kammer bilden den sterilen Inhalt des Zentrifugierröhrchens 12. Die Kammer 44 kann ein hoch- oder nur gering evakuiert sein. Sie wird auf einem vorgegebenen Wert bei unteratmosphärischem Druck gehalten, so daß das Zentrifugierröhrchen eine bekannte Flüssigkeitsmenge durch Injektion durch die Durchstichkappen 14 und 16 aufnehmen kann, ohne daß ein überdruck innerhalb dec Zentrifugierröhrchens aufgebaut wird, der die Durchstichkappen und 16 aus den öffnungen des Zentrifugierröhrchens 12 herausdrücken würde.

Das flüssige Filtermedium 42 kann irgendeines der flüssigen Filtermedien sein, die in der deutschen Patentanmeldung P 24 06 362 zum Nachweis von pathogenen Mikroben vorgeschlagen wurden und enthält im allgemeinen eine wäßrige Lösung eines beliebigen gelösten Stoffes, der gegenüber den darin suspendierten Mikroorganismen nicht toxisch ist und eine ausreichende Dichte aufweist, um rote und weiße Blutkörperchen oder Zellreste zu suspendieren. Der gelöste Stoff ist vorzugsweise nicht-ionisch. Das flüssige Filtermedium hat daher eine größere Dichte als Blut, beispielsweise mehr als 1,06 g/cm und suspendiert Blutzellen oder Blutzellreste, kann aber pathogene Mikroben aufnehmen. Ferner enthält das flüssige Filtermedium.vorzugsweise eine geringe Menge eines thermisch empfindlichen Geliermittels.

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Als geeignete, in Lösung befindliche Stoffe für das flüssige Filtermedium können Zucker eingesetzt werden wie Saccharose, Glucose, Maltose, Fruktose, Manitol, Sorbitol und ähnliche. Das flüssige Filtermedium 42 enthält mindestens etwa 40 Gew.% Zucker und kann gegebenenfalls den Zucker bis zur Sättigungsgrenze enthalten. Vorzugsweise beträgt der Gehalt an Zucker etwa 40 bis 50 Gew.% des flüssigen Filtermediums 42. Im'allgemeinen werden Zucker und insbesondere Saccharose bevorzugt als flüssiges Filtermeidum 42 eingesetzt, da diese Lösungen bei einem physiologischen pH-Wert wie 6,0 bis 7,0 gehalten werden und in Verbindung mit Gelatine im Autpclaven behandelt werden können.

Als gelöste Stoffe können aber auch andere Verbindungen eingesetzt werden, solange die Lösung eine höhere Dichte als Blut aufweist und Blutkörperchen und insbesondere rote Blutkörperchen und Zellreste von roten Blutkörperchen zurückhalten und suspendieren kann und. gegenüber den pathogenen Mikroben nicht toxisch ist. Zu anderen geeigneten Verbindungen gehört beispielsweise "Hypaque"-Natrium C₁₁HgJ₃N₃NaO₄ (3,5-Diacetamido-2,4,6-trijod-benzoesäure als Natriumsalz) . Diese Verbindung kann in wäßriger Lösung in gleichen Konzentrationen wie die oben angegebenen Zucker verwendet werden. Andere in Lösung vorliegende und als wäßrige Filtermedien geeignete Verbindungen sind makromolekulare Stoffe, die im wäßrigen Medium ein flüssiges Gel aufbauen können, das eine so geringe Porendichte aufweist, daß rote Blutkörperchen oder deren Zellreste nicht eindringen können, wobei aber die Porengröße groß genug ist, um pathogene

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Mikroben durchzulassen. Geeignet zu diesem Zweck als gelöster Makromolekularstoff ist beispielsweise ein wasserlösliches vernetztes Polymeres, das im löslichen Netzwerk mikroporenartige Öffnungen aufweist. Ein derartiges wasserlösliches Polymeres ist beispielsweise das Copolymere aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren. Molekulargewicht von 300 000 bis 500 000, einer Strukturviskosität von etwa 0,17 dl/g,

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einer spezifischen DrehungL^J D von + 56,5° und enthält dialysierbaren Stoff in Mengen von weniger als 1 Gew.%.

Eine derartige Verbindung wird unter der Marke "FICOLL" von der Pharmacia FINE Chemicals Inc., 800 Centennial Avenue, Piscastaway, N.J.', auf den Markt gebracht. Andere geeignete Polymeren sind Dextrane mit mittleren Molekulargewichten von 10 000 bis 2 000 000 und vorzugsweise etwa 50 000. Nach dem Auflösen in Wasser wirken diese Polymeren als flüssige Filtermedien für pathogene Mikroben, da sie in dem wasserlöslichen Netzwerk Mikroporenöffnungen mit einer Größe von etwa 1 bis 7 ,um zu haben scheinen.

Die wasserlöslichen Polymeren oder die gelösten Makromolekularstoff*! liegen in der wäßrigen Lösung in Konzentrationen von etwa 10 bis 40 und vorzugsweise etwa 20 bis 30 Gew.% vor.

Unter dem Begriff "thermisch empfindliches Geliermittel" wird jede Verbindung verstanden, die in der wäßrigen Lösung des Filtermediums 42 bei einer unter Zimmertemperatur liegenden Temperatur geliert, aber bei höheren Temperaturen wieder flüssig wird, und zwar bei solchen, die für pathogene Mikroorganismen

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unschädlich sind, wie beispielsweise unter 50⁰C und vorzugsweise nicht über 42°C. Geeignete thermisch empfindliche Geliermittel sind jeweils solche, die gegenüber der Lösung oder der Analysenprobe keine nachteiligen Wirkungen ausüben. Derartige Verbindungen sind beispielsweise die Gelatinen,, d.h. also aus Collagen durch Kochen von Haut, Bändern, Sehnen, Knochen oder ähnlichen im Wasser enthaltene: Proteine. Es kann jede geeignete Menge eines thermisch empfindlichen Geliermittels verwendet werden, beispielsweise etwa 0,5 bis 5 Gew.% des Filtermediums 42.

Der Hohlraum 26 kann jede beliebige Form haben, vorzugsweise ist er als kurzer zylindrischer Hohlraum ausgebildet und bezüglich der Ausnehmung 16a der Durchstichkappe 16 ausgerichtet. So ist die von der Stange 30 des Druckknopfelementes 32 getragene Hohlnadel axial in den Hohlraum 26 bewegbar, während eine Federscheibe 40 den oberen Bereich des Hohlraumes 26 oberhalb der öffnung 38 in der Hohlnadel 34 dichtend verschließt. Der /vbctand zwischen der öffnung 38 und dem abgeschrägten Ende der Hohlnadel 34 ist etwas größer als die Stärke der durchstechbaren Einlage 16c, so daß bei vollständig niedergedrücktem Druckknopf 32 die an dem abgeschrägten Ende 36 liegende öffnung durch die durchstechbare Einlage 16c tritt und in der Kammer des Zentrifugierröhrchens 12 zu liegen kommt, während die öffnung 38 weiterhin in dem Hohlraum 26 liegt, wie es Figur 2 darstellt. In dieser Lage kann in der Ausnehmung 16a enthaltene Flüssigkeit 46 durch die Hohlnadel 34 aus dem Hohlraum 26 durch den in der Kammer 44 vorhandenen Unterdruck in das Zentrifugierröhrchen

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12 treten. In dieser Lage wird also die Verbindung zwischen dem Hohlraum 26 und der Kammer 44 durch die Öffnung 38, die Hohlnadel 34 und die Öffnung an der abgeschrägten Spitze 36 gebildet.

Die Lösung 46 kann irgendeinen geeigneten Zusatz oder Zusätze enthalten, mit der die Probeflüssigkeit vor dem Abtrennen der pathogenen Mikroben behandelt werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Lösung 46 eine wäßrige Lösung eines Lysemittels zur Lyse von Blut. Als Lysemittel kann jedes Mittel in wäßriger Lösung verwendet werden, das für Mikroorganismen nichttoxisch ist. Ein in solcher Weise geeignetes Lysemittel ist beispielsweise eine nicht-toxische wäßrige Saponinlösung. Es wird aber darauf hingewiesen, daß man die meisten Saponine gegenüber pathogenen Mikroben für toxisch hält. Es wurde jedoch gefunden, daß die toxischen Bestandteile aus bisher für toxisch gehaltenen Saponinen entfernt werden können. Im allgemeinen können derartige toxische Saponinmaterialien nach einem neuen Verfahren der Anmelderin göreinigt werden, so daß das gereinigte Material im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann. Einige im Handel erhältliche Saponinzubereitungen sind nicht-toxisch, so daß auch diese Verbindungen mit dem erfindungsgemäßen Eehälter zur Durchführung des verbesserten Verfahrens Anwendung finden können. Zusätzlich kann die wäßrige Lösung ein Anticoagulantium und/oder ein Sauerstoffreinigungsmittel enthalten. Vorzugsweise findet als Anticoagulantium Natrium-Polyanätholsulfonat (SPS) oder Heparin Verwendung. Natrium-Polyanätholsulfonat wird deswegen vorzugsweise verwendet, da es nicht nur als Anticoagulantium wirkt, sondern auch die phagozytische

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Aktivität von Granulocyten und Monocyten und die normale antibakterielle Aktivität des Serums hindert.

In Figur 1 bis 4 kann das flüssige Filtermedium 42 1,5 ml einer wäßrigen Lösung mit beispielsweise 50 Gew.% Saccharose und 1,5'Gew.^! Gelatine sein.

Die Lösung 46 kann irgendeinen geeigneten Bestandteil wie ein Lysemittel und/oder ein Anticoagulantium und/oder ein Sauerstoffreinigungsmittel in jeder gewünschten Konzentration enthalten. Es kann jede für die Blutprobe ausreichende. Menge an Anticoagulantium und jede zur Lyse dieser Blutprobe ausreichende Lysemittelmenge Verwendung finden, beispielsweise 0/3 ml einer wäßrigen Lösung mit etwa 12 Gew.% von nicht-toxischem Saponin und etwa 2 Gew.% Natrium-Polyanätholsulfonat. Anfänglich wird das Zentrifugierund Mischröhrchen in die in Figur 1 gezeigte aufrechte Lage gebracht, um das flüssige Filtermedium 42 nach unten gegen die Durchstichkappe 14 laufen zu lassen. Danach wird das Zentrifugierröhrchen 10 in eine Kühlvorrichtung gebracht und soweit abgekühlt, daß die Gelatine das flüssige Filtermedium zum Erstarren bringt. Beispielsweise kann das Zentrifugierröhrchen auf 4°C abgekühlt werden. Danach wird das Druckknopfelement 32 in der in Figur 2 gezeigten Weise niedergedrückt, um das abgeschrägte Ende 36 der Hohlnadel 34. durch die Einläge 16c zu drücken, so daß die an der abgeschrägten Spitze 36 liegende Öffnung in der evakuierten Kammer 44 zu liegen kommt, während die Öffnung weiterhin in dem Hohlraum 26 liegt. Durch den auf diese Weise im Hohlraum 26 von der evakuierten Kammer 44 gebildeten Unterdruck strömt die Lösung. 46 durch die Öffnung. 38, die Hohlnadel 34 und

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die an der abgeschrägten Spitze 36 liegende öffnung in die evakuierte Kammer 44 und bildet eine Schicht 46a auf dem erstarrten flüssigen Filtermedium 42. Nun wird eine Probeflüssigkeit/ beispielsweise Blut (etwa 8 ml) mit einer Spritze 50 mit Injektionsnadel 52 aufgezogen. Die Blutprobe wird hierauf auf die in Figur 3 dargestellte Weise in das Zentrifugierröhrchen 12 injiziert. Die Injektionsnadel 52 durchsticht die Einlage 14b der Durchstichkappe 14, dringt durch das erstarrte wäßrige, flüssige Filtermedium 42, danach wird der Spritzenkolben niedergedrückt, um die Blutprobe auf dem erstarrten flüssigen Filtermedium 42 abzulegen und dabei ein turbulentes Vermischen mit dar Lösung 46 zur Ausbildung einer Mischung 48 zu bewirken. Es wird darauf hingewiesen, daß die Lösung 46 nach dem Injizieren der Blutprobe in das Zentrifugierröhrchen 12 zugesetzt werden-kann; verzugsweise wird sie jedoch zuvor eingebracht, um ein besseres Mischen mit der Blutprobe zu erzielen. Die durch das Injizieren der Blutprobe in die evakuierte Kammer 44 bewirkte Turbulenz und die Vermischung mit der Lösung 46 beeinflußt das flüssige Filtermediuni 42 nicht, das als feste Grundschicht verbleibt, wie es Figur 3 zeigt. Nach Abschluß dieses Vorganges kann die Kappe 18 ,abgeschraubt und vom Oberteil des Zentrifugierröhrchens entfernt werden, wie es Figur 4 darstellt.

Das Vermischen der Blutprobe mit der das Lysemittel enthaltenden Lösung 46 führt zu einer Lyse der roten Blutkörperchen, wodurch ein mögliches Einfangen von Erithrocyten und/oder Lymphocyten minimiert wird. Durch dieses Einfangen würden die Erithrocyten. oder'Lymphocyten während des Zentrifugiervorganges oben auf dem

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Filtermedium abgelegt werden und die pathogenen Mikroben bei ihrer Abwärtsbewegung während des Zentrifugierens eingefangen werden, was sie daran hindern würde, das flüssige Filtermedium zu erreichen. Darüber hinaus wirkt das Natrium-Polyanätholsulfonat mit der Lösung 46 als Anticoagulantium und verhindert die phagocytische Aktivität von Granulocyten und Monocyten und die normale antibakterielle Aktivität des Serums, wenn dieses der Blutprobe beigemischt wird. a

Anschließend wird die Injektionsnadel 52 aus der Durchstichkappe herausgezogen und das Zentrifugierröhrchen 12 mit dem erstarrten flüssigen Filtermedium 42 und der mit der Lösung 46 vermischten Blutprobe (als Schicht 48 in Figur 3 eingezeichnet) in aufrechter Stellung erwärmt, bis die Gelatine weich wird und sich das flüssige Filtermedium 42 verflüssigt. Das Zentrifugierröhrchen 12 wird auf eine Temperatur erwärmt, die nicht zu einer Zerstörung der gegebenenfalls.in der Blutprobe vorhandenen pathogenen Mikroben führt, aber andererseits ausreicht, die Gelatine zu verflüssigen. Beispielsweise kann das Zentrifugierröhrchen in der in den Zeichnungen dargestellten Lage durch Eintauchen in ein Wasserbad auf etw 37° bis 42°C erwärmt werden. Durch die Verflüssigung der Gelatine in dem flüssigen Filtermedium 42 bildet sich so eine flüssige wäßrige Filterlösung, die nun als Flüssigfilter für pathogene Mikroben dienen kann.

Die Abtrennung der pathogenen Mikroben aus der Blutprobe erfolgt durch Einsetzen des Zentrifugierröhrchens 12 in eine geeignete Zentrifuge, in der es zur Trennung der pathogenen Mikroben von

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anderen Bestandteilen der Blutprobe einer ausreichenden Zentrifugalkraft unterworfen wird. Geschwindigkeit und Zentrifugierzeit können je nach Konstruktionsmaterial des Zentrifugierröhrchens 12 und nach Art der Zentrifuge im weiten Umfang variieren. Ein ausreichendes Zentrifugieren wird erzielt/ wenn das Zentrifugierröhrchen 12 einer 100- bis 6000-fachen und vorzugsweise etwa 1400- bis 5000-fachen Schwerkraft unterworfen wird. Ein geeignetes Verfahren wird unter Verwendung einer Schwingzentrifuge durchgeführt, bei welcher etwa 10 bis 20 Minuten eine 2000- bis 4000-fache Schwerkraft aus das erfindungsgemäße System einwirkt.

Nach der Behandlung des Zentrifugierröhrchens 12 in der Zentrifuge wird eine sterile Spritze 54 mit einer gekürzten Injektionsnadel 56 durch die Einlage 14b der Durchstichkappe 14 gestochen/ v.ie es Figur 4 zeigt. Die Injektionsnadel 56 trägt eine Begrenzung 56a, wodurch die Nadel nur bis in das flüssige Filtermedium 42 durch die Durchstichkappe 14 dringen kann. Nun kann flüssiges Filtermedium 42 aus dem Zentrifugierröhrchen 12 mit der Spritze 54 aufgezogen werden, wobei der Rest der Probelösungsmischung 48 im Zentrifugierröhrchen 12 verbleibt.

Es wird darauf hingewiesen, daß auch eine längere Injektionsnadel in Verbindung mit der Spritze 54 verwendet und die Nadel in das Zentrifugierröhrchen 12 bis zu einem knapp hinter der Ubergangsschicht des flüssigen Filtermediums 42 und der Probeflüssigkeitsschicht 48 geführt und die Probeflüssigkeit zuerst aus dem Zentrifugierröhrchen entfernt werden kann.

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In dem Fall sollte in der Spritze der Kolben zuerst zurückgezogen und die Spritze mit steriler Luft gefüllt werden, damit die sterile Luft beim Entnehmen der Probeflüssigkeit zusätzlich in das Zentrifugierröhrchen 12 gedrückt wird. Anschließend kann das flüssige Filtermedium 42 entfernt werden.

Durch das Aufziehen des flüssigen Filtermediums 42 mit der Spritze werden das flüssige Filtermedium 42 und die pathogenen Mikroben kräftig vermischt und im allgemeinen gleichmäßig verteilt. Das flüssige Filtermedium 42 mit den verteilten pathogenen Mikroben wird dann auf einen geeigneten Nährboden für Bakterien aufgebracht . .'.-.'■ ·'

Beispielsweise kann im Falle von 1,5 ml flüssigem Filtermedium mit pathogenen Mikroben eine Blutagarplatte 0,2 ml des Mediums aufnehmen und bei 37°C aerob inkubiert werden. Eine weitere Blutagarplatte kann 0,2 ml der wäßrigen Lösung aufnehmen und bei 37°C in einem Kerzenglas inkubiert werden. Eine andere Blutagarplatte kann 0,2 ml der wäßrigen Lösung aufnehmen und bei 37 C in einer anaeroben Umgebung inkubiert werden./ Weitere 0,2 ml der Lösung können auf eine Sabouraud-Agarplatte aufgebracht und bei 25°C iri einer aeroben Umgebung inkubiert werden. Wiederum 0,2 ml der Lösung können auf eine EMB-Platte (Eosinmethylenblaiifarbstoff) aufgebracht und bei 37°C in einem Kerzenglas inkubiert werden. Weitere 0,5 ml der Lösung können in ein flüssiges Thioglykolatmedium gebracht und bei 37°C inkubiert werden. Die. Nährböden können täglich auf Anwesenheit von Kolonien untersucht werden. Die Anzahl der Mikroben in 1 ml Blut kann durch Multiplizieren

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der Anzahl der Kolonien unter Berücksichtigung eines Korrekturfaktors bestimmt werden. Dieser Korrekturfaktor zieht die Teilungsgeschwindigkeit eines bestimmten Keimes, die eingesetzten Volumina an Blut und Filterflüssigkeit und die auf die Platte aufgebrachte Menge der endgültigen Mischung ein. In dem oben angegebenen allgemeinen Beispiel beträgt der Korrekturfaktor 1,56.

Die Figuren 5 und 6 zeigen eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zentrifugierröhrchens. Bis auf die Kappe 70 ist es vollständig gleich aufgebaut, wie das in den Figuren 1 bis 4 dargestellte Zentrifugierröhrchen. Die Kappe 70 bildet eine geschlossene zylindrische Kappe mit Innengewinde 72 und einer am Kappenboden 75 fest angebrachten Hohlnadel 74. Die Hohlnadel 75 hat den selben Aufbau wie die Hohlnadel 34, sie weist eine abgeschrägte Spitze 76 mit einer Öffnung und eine zweite öffnung 78 etwa in der Mitte ihres Schaftes auf. Bei der in Figur 5 gezeigten Lage der Kappe 70 sitzt die abgeschrägte Spitze 76 der Hohlnadel 74 in der in der Ausnehmung 16a der Durchstichkappe liegenden Lösung 46. Vorzugsweise wird in dieser Lage ein Klebestreifen 80 um den Unterrand der Kappe- 70 gelegt. Der Klebestreifen 80 kann irgendein thermoplastisches oder temperaturhärtbares Material sein, das sich unter Wärmeeinwirkung zum Anschmiegen an den Unterrand der Kappe 70 und den unteren Teil des von dem Zentrifugierröhrchen 12 getragenen Außengewindes 22 verformt. Dadurch wird die Kappe 70 in ihrer in Figur 5 gezeigten ersten Lage während der Lagerung und Handhabung gesichert. Soll die Lösung 46 auf das flüssige Filtermedium 42 aufgebracht werden, dann

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wird die Kappe 70 nach unten geschraubt, zerstört das Klebeband 80 und drückt die abgeschrägt Spitze 76 der Hohlnadel 74 durch die.Durchstichkappe 16 auf die in Figur 6 dargestellte Weise. Dadurch wird eine Verbindung zwischen dem von der Ausnehmung 16a der Durchstichkappe 16 und dem Boden 75 gebildeten Hohlraum und der evakuierten Kammer 44 hergestellt und die Flüssigkeit 46 kann durch die öffnung 78, durch die Hohlnadel 74 in das Innere des Zentrifugierröhrchens 12 übertreten. _A.

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Claims

- 20 Ansprüche

Vorrichtung zur Feststellung von pathogenen Mikroben sowie Behälter zur Aufnahme von zu mischenden und zu zentrifugierenden Stoffen, gekennzeichnet durch ein verschlossenes, längliches Zentrifugierröhrchen (12) mit einem ersten und einem zweiten Ende und einer auf weniger als Atmosphärendruck evakuierten Kammer (44) , durch zwei jeweils das erste und das zweite Ende ' des Zentrifugierröhrchens (12) dichtend verschließende Durchstichkappen (14, 16), durch eine an dem Zentrifugierröhrchen (12) angebrachte, eine injizierbare Flüssigkeit enthaltende und mit der zweiten Durchstichkappe (16) in Verbindung stehende geschlossene Endkammer (26) und durch eine in der Endkammer (26) angeordnete Hohlnadel (34) zum übertragen der Flüssigkeit aus der Endkammer (26) durch die zweite Durchstichkappe (16) in die evakuierte Kammer (44).
2. Behälter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlnadel (34) in der Endkammer (26) zwischen einer ersten hochgezogenen und einer zweiten niedergedrückten Lage axial bewegbar ist und eine erste Öffnung an ihrer Spitze (36) und eine zweite Öffnung (38) in ihrem Schaft aufweist.
3. Behälter nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Endkammer (26) zwischen der zweiten Durchstichkappe (16) und einer Hohlkappe (18) liegt, die lösbar mit dem zweiten Ende des Zentrifugierröhrchens (12) verbunden ist.

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4. Behälter nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlkappe (18) schraubbar mit dem zweiten Ende des Zentrifugierröhrchens (12) verbunden ist.
5. Behälter nach einem der Ansprüche 1 bis 4,-dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlnadel (34) von der Hohlkappe (18) in Ausrichtung mit der Endkammer (26) und der zweiten Durchstichkappe (16) nach unten ragt und in ihre niedergedrückte Lage durch Drehen der auf das zweite Ende des Zentrifugierröhrchens (12) aufgeschraubten Hohlkappe (18) bewegbar ist.
6. Behälter nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die" Hohlnadel (34) auf einem Druckkolben (32) in der Endkammer (26) in Ausrichtung mit der zweiten Durchstichkappe angebracht ist.
7. Verfahren zum Nachweis von pathogenen Mikroben in Körperflüssigkeiten unter Verwendung des Zentrifugierröhrchens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß a) ein wäßriges Filtermedium (42) zwischen die erste (14) und zweite (16) Durchstichkappe in ein Zentrifugierröhrchen (12) eingebracht wird, wobei das wäßrige Filtermedium ein thermisch empfindliches Geliermittel enthält und eine wäßrige Lösung eines Stoffes mit größerer Dichte als die Probeflüssigkeit ist, jedoch pathogene Mikroben selektiv aus der Probeflüssigkeit aufnehmen kann;

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b) daß die Kammer (44) über dem wäßrigen Filtermedium (42) auf unteratmosphärischem Druck gehalten wird;

c) daß das Zentrifugierröhrchen (12) in eine solche Lage gebracht wird, daß das wäßrige Filtermedium auf der ersten Durchstichkappe (14) zu liegen kommt und daß in dieser Lage das Zentrifugierröhrchen (12) gekühlt wird, um mittels des thermisch empfindlichen Geliermittels das wäßrige Filtermedium (42) zum Erstarren zu bringen;

d) daß ein Lösungsmittel für die Körperflüssigkeit auf das erstarrte wäßrige Filtermedium (42) durch Durchstechen der zweiten Durchstichkappe (16) mittels einer Hohlnadel (34) und nachfolgendes Injizieren der Lösung (46) in das Zentrifugierröhrchen (12) auf das erstarrte wäßrige Filtermedium (42) aufgebracht ,wird;

e) daß eine Körperflüssigkeitsprobe auf das erstarrte wäßrige Filtermedium (42) aufgebracht und mit der Lösung (46) vermischt wird, in dem eine Injektionsnadel (52) durch die erste Durchstichkappe (14) und durch das erstarrte v.'äßrige Filtermedium (42) gestochen und anschließend die Körperflüssigkeit durch die Injektionsnadel in das Zentrifugierröhrchen (12) injiziert wird;

f) daß das Zentrifugierröhrchen (12) zum Verflüssigen des thermisch empfindlichen Geliermittels und damit zum Verflüssigen des wäßrigen Filtermediums (42) erwärmt wird;

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g) daß das Zentrifugierröhrchen (12) Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Körperflüssigkeitsprobe (48) gegen das wäßrige Filtermedium (42) gepreßt wird und die pathogenen Mikroben zum selektiven übergang in das wäßrige Filtermedium (42) und zur Abtrennung aus der übrigen Menge der Körperflüssigkeitsprobe (48) veranlaßt werden; und

h) daß das wäßrige Filtermedium (42) mit den pathogenen Mikroben von der übrigen Menge der Körperflüssigkeit (48) abgetrennt

wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man kleinere wirksame Menge von thermisch empfindlichem Geliermittel in einer Menge von etwa 1 bis 5 Gew.% des wäßrigen Filteimediums (42) zusetzt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als thermisch empfindliches Geliermittel Gelatine verwendet.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man· als wäßriges Filterraedium'(42) eine wäßrige Zuckerlösung verwendet.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zucker Saccharose verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet,

daß man ein wäßriges Filtermedium (42) mit mindestens 40 Gew.% Saccharose verwendet.

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13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßriges Filtermedium (42) eine wäßrige Lösung eines makromolekularen gelösten Stoffes mit über das gesamte gelöste Netzwerk verteilten mikroporösen Öffnungen verwendet, wobei die Größe der Öffnungen ausreicht, um die pathogenen Mikroben aus der Probeflüssigkeit selektiv übertreten zu lassen.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet-, daß man als makromolekular gelösten Stoff ein Copolymeres aus Sacharose und Epichlorhydrin mit einem Molekulargewicht von etwa 300 000 bis 500 000 und einer spezifischen Drehung von

— 2O

^L -* D von + 56,5 verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polymeres Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10 bis 2 000 000 verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Körperflüssigkeit Blut und als Lösung (46) ein Blutlysemittel verwendet. . ;
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als flüssiges Filtermedium eine wäßrige Lösung eines nicht-ionischen Zuckers verwendet.

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18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung mit etwa 10 bis 40 Gew.% des Copolymeren verwendet.
19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man das wäßrige Filtermedium (42) mit einem Dextrangehalt von etwa

10 bis 40 Gew.% des Filtermediums verwendet.
20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse des flüssigen Filtermediums (42) durch Vermischen des flüssigen Filtermediums (42) zur gleichmäßigen Verteilung

der darin enthaltenden pathogenen Mikroben und durch quantitatives Auftragen dieser Mischung auf Nährböden für pathogene Mikroben durchgeführt wird.

ue:hu:bü

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