CH636128A5 - Verfahren zur bestimmung pathogener mikroorganismen in einer fluessigkeitsprobe und vorrichtung zur konzentrierung pathogener mikroorganismen aus der fluessigkeitsprobe. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen in einer Flüssigkeitsprobe durch Zentrifugieren einer die Flüssigkeitsprobe enthaltenden geschlossenen sterilen Zone. Die Erfindung betrifft ausserdem eine Vorrichtung zur Konzentrierung pathogener Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe.

Blutvergiftung oder Sepsis, d.h. die Gegenwart pathogener Mikroorganismen im Blut, stellt eine der ernsthaftesten Infektionen dar. Obgleich in der modernen Medizin eine Vielzahl von Antibiotika und von gegen Pilze wirksamen Arzneimitteln zur Verfügung steht, beträgt die Sterblichkeitsziffer bei der Blutvergiftung etwa 25%. Wenn bei der Blutvergiftung ein Schock hinzukommt, steigt die Sterblichkeitsziffer auf über 60%. Entkräftende Krankheiten, grössere chirurgische Eingriffe und die Verabfolgung von die Immunreaktion unterdrückenden Arzneimitteln machen die Patienten gegen Blutvergiftung besonders empfindlich.

Bei der Bekämpfung der Blutvergiftung ist die frühzeitige Verabreichung geeigneter Antibiotika sehr wichtig. Dementsprechend ist es von grösster Bedeutung, dass der Arzt so schnell wie möglich nicht nur weiss, dass der Patient eine Blutvergiftung hat, sondern auch die die Blutvergiftung hervorrufenden Mikroorganismen und ihre Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika kennt. Damit hängt die richtige und schnelle Diagnose der Sepsis von der raschen und wirksamen quantitativen Analyse des Bluts des betroffenen Patienten ab. Ausserdem ist wichtig, dass während der quantitativen Analyse des Bluts die Blutprobe nicht mit pathogenen Stoffen aus der Laborumgebung verunreinigt wird.

Bisher kennt man drei Analysensysteme für die Feststellung von Mikroorganismen in einer Körperflüssigkeit. Diese herkömmlichen Systeme umfassen die Brühen-Kultivierungstechnik, die sogenannte Giessplattenmethode und die Filtrationsmethode unter Verwendung einer festen Filtermatrize. Jedes dieser Systeme hat seine Nachteile und keines ermöglicht die rasche Feststellung der Mikroorganismen in der Blutprobe. Allgemein ausgedrückt, die Brühen-Kultivierungsmethode ist nicht quantitativ, und die Giessplattenmethode und die Filtrationsmethode unter Verwendung einer festen Filtermatrize stellen offene Systeme dar, die einer Verunreinigung von aussen, z.B. der Einführung pathogener Stoffe in die Kultur durch die Laboratmosphäre und das Personal unterworfen sind.

Vor kurzem wurde eine verbesserte Methode und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Mikroorganismen in einer Flüssigkeitsprobe, z.B. Blut, entwickelt. Diese Methode ist in der US-Patentschrift 3 928 139 beschrieben.

Nach dieser verbesserten Methode wird eine rasche und quantitative Feststellung pathogener Mikroorganismen in einer Körperflüssigkeitsprobe durch Verwendung eines flüssigen Filtermediums ermöglicht. Die Flüssigkeitsprobe wird innerhalb 5 einer geschlossenen sterilen Zone auf das flüssige Filtermedium aufgebracht. Das flüssige Filtermedium hat eine grössere Dichte als die Flüssigkeitsprobe und besteht aus einer sterilen wässrigen Lösung, die selektiv pathogene Mikroorganismen aus der Flüssigkeitsprobe aufnimmt. Die geschlossene sterile 10 Zone wird darauf zentrifugiert, um die Flüssigkeitsprobe gegen das flüssige Filtermedium zu pressen und damit zu verursachen, dass die pathogenen Mikroorganismen selektiv in das Filtermedium eindringen und sich damit von der übrigen Flüssigkeitsprobe trennen. Dann wird das flüssige, die pathogenen 15 Mikroorganismen enthaltende Filtermedium vom Rest der Flüssigkeitsprobe getrennt, und Teile des flüssigen Filtermediums werden verschiedenen Kultivierungsbedingungen unterworfen.

Das vorstehend beschriebene verbesserte Verfahren ermög-20 licht die schnelle und wirksame Trennung pathogener Mikroorganismen aus der Flüssigkeitsprobe. Gemäss der bevorzugten Ausführungsform dieser Methode wird die Blutprobe vor dem Zentrifugieren einer Zellzerstörung unterworfen, wodurch die mikrobischen Erreger selektiv vom flüssigen Filtermedium 23 aufgenommen werden. Andere Vorbehandlungsmittel, wie Anti-Koagulierungsmittel, werden ebenfalls zur Vorbereitung der Blutprobe verwendet. Einige Bestandteile des bevorzugten vorstehend erläuterten flüssigen Filtermediums sind mit einigen der Vorbehandlungs- und/oder die Zellzerstörung bewir-30 kenden Mitteln unverträglich. Hinzu kommt, dass sich diese Mittel mit dem flüssigen Filtermedium vermischen, wenn sie diesem vor dem Aufbringen der Blutprobe auf die geschlossene sterile Zone zugegeben werden. Wenn sich diese Mittel erst einmal mit dem flüssigen Filtermedium vermischt haben, können 35 sie aus diesem nicht schnell genug austreten, um das Blut wirksam zu behandeln. Es müssen daher entweder die Blutproben der Möglichkeit einer Verunreinigung von aussen durch Vermischen der Blutprobe mit den Vorbehandlungs- und/oder die Zellzerstörung bewirkenden Mitteln vor der Einführung der 40 Probe in ein geschlossenes steriles System ausgesetzt werden, oder es muss eine SpezialVorrichtung zur Anwendung kommen, wodurch die Behandlungsmittel innerhalb des geschlossenen Systems, aber getrennt vom flüssigen Filtermedium, gehalten werden können, bis die Vorrichtung in Betrieb genommen 43 wird. Eine Vorrichtung dieser Art ist in den US-Patentschriften 3 875 012 und 3 932 222 beschrieben.

In dem zuvor erläuterten verbesserten Verfahren wird ein flüssiges Filtermedium in einem Zentrifugiergefäss verwendet, das eine durchstossbare Verschlussvorrichtung am Ende des so Gefässes umfasst, gegen das die Blutprobe und das flüssige Filtermedium in der Zentrifugationsstufe gepresst werden. Dabei hat man festgestellt, dass einige der schwereren mikrobischen Erreger, die vom flüssigen Filtermedium aufgenommen werden, unter der Einwirkung der Zentrifugalkraft vollständig 33 durch das flüssige Filtermedium passieren können und nahe dem Boden des verwendeten Zentrifugationsgefässes bleiben, so dass, falls nicht grosse Sorgfalt bei der Trennung und Gewinnung des flüssigen Filtermediums aufgewandt wird, diese mikrobischen Erreger ungewonnen zurückbleiben können. 60 Man nimmt an, dass dieser Verlust an mikrobischen Erregern dadurch bedingt wird, dass beim vollständigen Passieren des flüssigen Filtermediums diese Erreger in dem winzigen Raum zwischen der Wandung des Zentrifugationsgefässes und dem einsetzbaren Verschluss aufgenommen werden. 63 Ein steriles Verfahren zur Trennung und Konzentrierung mikrobischer Erreger, die wahrscheinlich in einer Blutprobe enthalten sind, ohne die Notwendigkeit des vorherigen Vermischens der Blutprobe in einer potentiell verunreinigenden

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Umgebung und ohne die Notwendigkeit der Verwendung einer Spezialvorrichung zur Durchführung der Vorbehandlungsstufe ist daher sehr erwünscht. Besonders erwünscht ist ferner die verbesserte Gewinnung der selektiv aus einer Flüssigkeitsprobe abgetrennten und konzentrierten mikrobischen Erreger.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen in einer Flüssigkeitsprobe zur Verfügung, in dem die Zentrifugation der Flüssigkeitsprobe in Gegenwart eines flüssigen nicht toxischen, mit Wasser nicht mischbaren, Kissen bildenden Mittels hoher Dichte durchgeführt wird. Dieses Verfahren ist auf alle Arten von Körperflüssigkeiten anwendbar, wie Blut, Knochenmark, spinale und plurale Flüssigkeiten, Urin und dergleichen. Ausserdem kann dieses Verfahren auf jede Mikroorganismen enthaltende Probe angewandt werden, um die Mikroorganismen von jeglichen in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen antimikrobiellen Faktoren, wie Nahrungsmitteln, z.B. Milch und dergleichen, abzutrennen und zu konzentrieren. Allgemein gesagt, umfasst das erfin-dungsgemässe Verfahren bei seiner Anwendung auf eine Blutprobe die Ablagerung einer einer Zellzerstörung unterworfenen Blutprobe auf eine verhältnismässig dünne Schicht eines nicht toxischen, mit Wasser nicht mischbaren, hydrophoben, flüssigen, Kissen bildenden Mittels hoher Dichte. Dieses Kissen bildende Mittel ist mit den die Zellzerstörung bewirkenden und anderen Blutbehandlungsmitteln verträglich, und diese Mittel trennen sich rasch von dem Kissen bildenden Mittel, wenn sie mit ihm vermischt sind. Um eine mögliche Verunreinigung zu vermeiden, wird daher vorzugsweise eine Blutprobe in eine sterile geschlossene Zone gespritzt, die sowohl das Kissen bildende Mittel als auch eine wirksame Menge an die Zellzerstörung bewirkenden und/oder anderen Blutbehandlungsmitteln enthält, so dass die Blutprobe in situ behandelt wird. Die behandelte Blutprobe in der geschlossenen sterilen Zone wird dann einer Zentrifugation unterworfen, wodurch die Blutprobe gegen das Kissen bildende Mittel gepresst wird. Man hat gefunden, dass bei einer solchen Zentrifugation im wesentlichen die gesamten mikrobischen Erreger, die in einer einem Zellabbau unterworfenen Blutprobe enthalten sind, aus der Suspension treten und sich in einer Schicht an der Grenzfläche zwischen dem Kissen bildenden Mittel und der Blutprobe selbst sammeln. Die mikrobischen Erreger durchdringen tatsächlich die Grenzschicht zwischen Kissen bildendem Mittel und Blutprobe und treten in das Kissen bildende Mittel ein oder bleiben an der Oberfläche oder nahe der Oberfläche des Kissen bildenden Mittels, d.h. kein oder im wesentlichen kein Erreger passiert das Kissen bildende Mittel vollständig. Dies steht im Gegensatz zur Verwendung eines flüssigen Filtermediums, das selektiv mikrobische Erreger aufnimmt und das von einigen der Mikroorganismen vollständig passiert wird, die dann zwischen der Wandung des Zentrifugationsgefässes und der einsetzbaren Verschlussvorrichtung eingeschlossen werden. Die in erfindungsgemässer Weise gebildete Schicht aus mikrobischen Erregern kann ohne wesentlichen Verlust gewonnen werden, wenn man das Kissen bildende Mittel und einen kleineren Anteil der restlichen Blutprobe an der Grenzfläche des Kissen bildenden Mittels vom Hauptteil der Probe trennt. Die Gegenwart des Kissen bildenden Mittels während der Zentrifugation der Blutprobe ermöglicht damit die Abtrennung der pathogenen Mikroorganismen von der Blutprobe sowie von jeglichem Arzneimittel und anti-pathogenen Faktoren, die in dieser Probe enthalten sind. Nach der Gewinnung können die Erreger sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmt werden.

Die Erfindung stellt somit für die Abtrennung und Sammlung pathogener Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe durch Zentrifugation ein nicht toxisches, mit Wasser nicht mischbares, hydrophobes, flüssiges, Kissen bildendes Mittel hoher Dichte zur Verfügung: Die Verwendung eines solchen Kissen bildenden Mittels, entweder allein oder in Verbindung mit einem flüssigen Filtermedium, ermöglicht eine wesentlich bessere Gewinnung der aus einer Blutprobe abgetrennten mikrobischen Erreger. Als Kissen bildende Mittel können generell inerte Flüssigkeiten verwendet werden, die gegenüber den Mikroorganismen nicht toxisch, mit Wasser nicht mischbar, hydrophob und von hoher Dichte sind. Der vorliegend verwendete Ausdruck «hohe Dichte» bezieht sich auf eine Flüssigkeit, deren Dichte ausreicht, um bei Anwendung von Zentrifugalkraft von einer Mischung aus einer Blutprobe und einer Behandlungsflüssigkeit für die Blutprobe, oder von einer anderen Flüssigkeitsprobe, von der man annimmt, dass sie mikrobische Erreger enthält, nicht getragen zu werden. Vermutlich bewirken diese Mittel aufgrund ihrer hohen Dichte einen Kissen bildenden Effekt auf die mikrobischen Erreger, die beim Zentrifugieren aus der Suspension der Blutprobe herausge-presst werden. Die pathogenen Mikroorganismen werden an der Grenzfläche zwischen der Blutprobe selbst und dem Kissen bildenden Mittel aufgefangen. Auf diese Weise gehen die Mikroorganismen nicht an vorhandene Zwischenräume verloren.

Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Konzentrierung pathogener Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe. Diese Vorrichtung besteht aus einem geschlossenen mit durchstossbaren Verschlüssen versehenen Zentrifugenbehälter, der innen einen evakuierten Raum aufweist, der auf einem niedrigeren Druck als Atmosphärendruck gehalten wird und an ein flüssiges, nicht toxisches, mit Wasser nicht mischbares, hydrophobes Kissen bildendes Mittel hoher Dichte angrenzt, das im wesentlichen alle aus der Suspension der Flüssigkeitsprobe austretenden pathogenen Mikroorganismen zu sammeln vermag, ohne Verlust an pathogenen Mikroorganismen an Zwischenräume im Zentrifugenbehälter.

Der Zentrifugenbehälter weist innen eine glatte kontinuierliche Oberfläche auf, so dass beim Zentrifugieren die Flüssigkeitsprobe in im wesentlichen rechten Winkel gegen die Oberfläche gepresst wird. Die Oberfläche umfasst das innere Ende eines durchstossbaren Verschlusses für den Behälter, auf dem das oben beschriebene Kissen bildende Mittel aufgebracht ist. Das Kissen bildende Mittel wird auf der inneren Oberfläche des durchstossbaren Verschlusses verteilt und füllt die Zwischenräume zwischen der Wandung des Zentrifugenbehälters und dem durchstossbaren Verschluss, so dass jeder Einschluss schwererer pathogener Mikroorganismen, die während des Zentrifugierens zu dem Kissen bildenden Mittel passieren können, verhindert wird. Wenn eine Schaukelbecherzentrifuge verwendet wird, sollte die innere Oberfläche des durchstossbaren Verschlusses senkrecht zum Boden des durchstossbaren Verschlusses stehen. Wenn ferner eine Winkelrotorzentrifuge eingesetzt wird, ist die glatte innere Oberfläche des durchstossbaren Verschlusses innerhalb des Zentrifugenbehälters in einem Winkel angeordnet, der komplementär zu dem Winkel ist, bei dem die Zentrifugation durchgeführt wird. Diese Anordnung ermöglicht die Verwendung der herkömmlichen Winkelzentrifugen und resultiert in einem kürzeren Weg des Erregers durch die Probenflüssigkeit, bevor er an der Innenfläche des Kissen bildenden Mittels konzentriert wird. Dieser kürzere Weg resultiert in einer auf die pathogenen Mikroorganismen in der Probenflüssigkeit angewandten grösseren durchschnittlichen Kraft «g». Die Zentrifugation unter Anwendung dieses Zentrifugenbehälters führt zur Konzentrierung der Erreger an der Grenzfläche zwischen dem Kissen bildenden Mittel und der Probenflüssigkeit und teilweise an der Seitenwandung des Zentrifugenbehälters. Die so konzentrierten pathogenen Mikroorganismen lassen sich leicht sammeln und aus dem Zentrifugenbehälter entfernen. Die Einstellung der Oberfläche im Zentrifugenbehälter in einem solchen Winkel, dass die Blutprobe und das Kissen bildende Mittel während des Zentrifugierens in im wesentlichen senkrechten Winkel gegen die Ober4

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fläche gepresst werden, gewährleistet, dass sich das Kissen bildende Mittel im wesentlichen gleichmässig über die Oberfläche verteilt, so dass jegliche Zwischenräume, die Mikroorganismen einschliessen könnten, verschlossen werden. Die Anordnung ergibt einen kürzeren Weg für die pathogenen Mikroorganismen und daher eine grössere Durchschnittskraft «g» auf die Mikroorganismen, die in höherer Konzentration abgelagert und leicht aus dem Zentrifugenbehälter entfernt werden können. Die Anwendung dieser speziell konstruierten Zentrifugenbehälter führt zu einer höheren Zentrifugenleistung insofern, als die Zentrifugation bei niedrigeren «g»-Werten in der gleichen Zeit durchgeführt werden kann wie die herkömmliche Zentrifugation, oder bei den gleichen «g»-Werten in kürzerer Zeit als die herkömmliche Zentrifugation.

Ferner kann gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Zellauflösung und/oder die Behandlung des Blutes mit anderen Mitteln zur Vorbereitung einer Blutprobe in einer wässrigen Lösung innerhalb des Zentrifugenbehälters im Kontakt mit dem flüssigen, Kissen bildenden Mittel durchgeführt werden. Das flüssige, Kissen bildende Mittel hat eine höhere Dichte als die wässrige Lösung und ist hydrophob und mit Wasser nicht mischbar, so dass es die wässrige Lösung trägt. Wenn ferner der Zentrifugenbehälter während der Lagerung und des Transports geschüttelt wird, vermischen sich die zellauflösenden oder anderen Blutbehandlungsmittel mit dem Kissen bildenden Mittel. Wenn jedoch der Zentrifugenbehälter zentrifugiert wird, trennt sich das flüssige, Kissen bildende Mittel hoher Dichte leicht ab und ermöglicht somit die Vermischung der Blutbehandlungsmittel mit der Blutprobe im Behälter. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil gegenüber den oben beschriebenen herkömmlichen Filtermedien dar, die Bestandteile enthalten, die mit einigen der Blutbehandlungsmittel unverträglich sind. Ausserdem sind die herkömmlichen flüssigen Filtermedien auf wässriger Basis aufgebaut, d.h. sie vermischen sich mit den wässrigen Blutbehandlungsmitteln, wenn sie miteinander in Kontakt sind und verhindern eine wirksame Trennung voneinander und eine Behandlung der Blutprobe, die in den Behälter eingebracht ist.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 einen Querschnitt durch einen bevorzugten Zentrifugenbehälter,

Fig. 2 bis 9 veranschaulichen Stufen des Verfahrens zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen unter Verwendung des Behälters der Fig. 1.

Der Behälter 20 besteht aus einem länglichen rohrförmigen Gefäss 22 mit einem durchstossbaren Verschluss 24, der das obere Ende verschliesst, und einem durchstossbaren Verschluss 26, der das untere Ende verschliesst. Wenn der Behälter gemäss der bevorzugten Ausführungsform zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen verwendet werden soll, wird eine wirksame Menge des Kissen bildenden Mittels 28 und der Blutbehandlungsmittel 30 in ihn eingebracht.

Der Behälter 22 kann aus silikonbeschichtetem Glas oder Hartplastik bestehen, z.B. aus Polycarbonat oder Polypropylen. Die durchstossbaren Verschlussglieder 24 und 26 können aus selbstdichtenden Kautschukstöpseln bestehen. Die Verschlussglieder 24 und 26 tragen jeweils Einkerbungen 24a und 26a, um das Durchstossen mit herkömmlichen medizinischen Injektionsnadeln zu erleichtern. Der evakuierte Raum 32 wird auf einem vorbestimmten niedrigeren als Atmosphärendruck gehalten, so dass in den Behälter eine bekannte Menge Flüssigkeit durch Injektion durch das durchstossbare Verschlussglied 24 eingebracht werden kann, ohne dass im Inneren des Behälters ein übermässiger Druck entsteht, der dazu führen könnte, dass die Verschlussglieder 24 und 26 aus ihrer Position in den Öffnungen des Behälters 22 treten.

Zu bemerken ist, dass die innere Oberfläche 34 des durch-

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stossbaren Verschlussgliedes 26 in einem Winkel zur Wandung des Behälters 22 geneigt ist.

Der Behälter 22 ist besonders für die Verwendung in einer Winkelrotorzentrifuge konstruiert, wobei der Winkel der inneren Oberfläche 34 zum Winkel des Rotors komlementär ist. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die erfindungsgemässe Vorrichtung auch in einer herkömmlichen Schaukelbecherzentrifuge verwendet werden kann. Im letzteren Fall sollte die Oberfläche 34 senkrecht zum Boden des Behälters 20 stehen. Im übrigen ist die Anwendungsweise gleich. Die Oberfläche 34 sollte glatt und im wesentlichen frei von Hohlräumen sein, in denen pathogene Mikroorganismen eingeschlossen werden könnten. Ferner sollte der ringförmige Verschlussbereich um die Oberfläche 34, wo das durchstossbare Verschlussglied 26 auf die Wandung des Behälters 22 trifft, dicht verschlossen sein, so dass kein grosser ringförmiger Zwischenraum vorliegt, in dem pathogene Mikroorganismen eingeschlossen werden könnten.

Der Neigungswinkel der glatten Oberfläche 34 in bezug auf die Wandung des Behälters 22 wird in Übereinstimmung mit der Zentrifugenvorrichtung festgelegt, in der der Behälter 20 verwendet werden soll.

Wie oben schon ausgeführt, ist bei Verwendung einer Schaukelbecherzentrifuge die Oberfläche 34 senkrecht zum Boden des Behälters 20 eingestellt. Wenn jedoch eine Winkelrotorzentrifuge einesetzt wird, ist die Oberfläche 34 in einem Komplementärwinkel zum Winkel des Rotors angeordnet. D.h. wenn die Rotorwinkel im Bereich von etwa 60° bis 10° liegen, beträgt der Winkel der Oberfläche 34 oder der Neigungswinkel 36 im Behälter entsprechend 30° bis 80°. D.h., der durch den Bogen 36 angezeigte Neigungswinkel ist im allgemeinen komplementär zum Winkel, in dem der Behälter 20 während des Zentrifugierens in der Zentrifuge steht. Wenn z.B. der Neigungswinkel 36 in der Fig. 1 etwa 34° beträgt, wird der Behälter 20 in eine Winkelrotorzentrifuge eingebracht, in der die Zentrifugation bei etwa 56° vor sich geht, so dass die Flüssigkeit im Behälter 20 in im wesentlichen rechten Winkel gegen die Oberfläche 34 gepresst wird.

Wie in Fig. 1 dargestellt ist, besteht das durchstossbare Verschlussglied 26 aus einem einzigen Stück Kautschuk. Die Oberfläche 34 kann unter Verwendung eines dichtschliessenden Pfropfens aus einem beliebigen Material hergestellt werden, das zu einer glatten Oberfläche und einer guten Abdichtung der Wandung des Behälters 22 führt, durchstossbar und gegenüber den pathogenen Mikroorganismen nicht toxisch ist, z.B. aus herkömmlichem Kautschuk. Für die Herstellung eines solchen Stopfens in situ kann man ein Material verwenden, das in den Behälter 22 gegossen werden kann, nachdem ein herkömmlicher Kautschukstopfen, z.B. das durchstossbare Verschlussglied 24, in das untere Ende des Behälters 22 eingesetzt wurde. Das Material sollte ausreichend fliessfähig sein und ausreichend lange Härtungszeiten besitzen, um den Behälter 22 in den gewünschten Neigungswinkel zu bringen, so dass das Material in den angestrebten Neigungswinkel fliesst und dann härtet. Nach dem Härten ergibt es eine glatte Oberfläche 34 bei guter Abdichtung der Wandung des Behälters 22. Beispiele für solche Materialien sind herkömmliche Badewannenabdichtungsmittel und Harze auf Silikonbasis, die in fliessfähiger, niedrig viskoser Form zur Verfügung stehen und zu einem elastomeren Material härten. Ein Beispiel für ein Material der zuletzt genannten Art ist ein fliessfähiges Harz auf Silikonbasis, das unter der Handelsbezeichnung Sylgard 134 von der Dow Corning, Midland, Michigan, vertrieben wird. Wenn ein solches Material, wie Sylgard, verwendet wird, ist es manchmal ratsam, auf die Innenwandung des Behälters 22 eine Grundierung aufzubringen, um eine gute Dichtung zwischen dem gehärteten Sylgard und der Behälterwandung 22 zu gewährleisten. Ein geeignetes Grundierungsmittel wird unter dem Handelsnamen

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DC 1200 von der Dow Corning auf den Markt gebracht. Z.B. kann eine glatte geneigte Fläche 34 als innere Oberfläche eines einheitlichen durchstossbaren Verschlussgliedes 26, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist, durch Grundieren der Innenwandung des Behälters 22 mit einem geeigneten Grundierungsharz auf Silikonbasis, wie DC 1200, Einsetzen eines üblichen Kautschukstopfens als durchstossbares Verschlussglied 24, Eingiessen von flüssigem Silikonharz, wie Sylgard 134 in den Behälter 22, Anordnen des Behälters im gewünschten Neigungswinkel und Härten des Silikonharzes unter entsprechenden Bedingungen hergestellt werden. Badewannendichtungsmittel und ähnliche Materialien können, falls gewünscht, in der gleichen allgemeinen Weise angewandt werden. Der richtige Neigungswinkel kann durch Zentrifugieren des das ungehärtete Material enthaltenden Behälters in der Zentrifuge, in der der Behälter letztlich angewandt werden soll, erreicht werden.

Wenn eine glatte Oberfläche 34 gebildet ist, entweder durch Verwendung eines aus einem Stück bestehenden durchstossbaren Verschlussgliedes 26 oder durch eine Kombination aus einem Kautschukstopfen und einem oben beschriebenen Material, kann eine wirksame Menge des Kissen bildenden Mittels in den Behälter 20 eingeführt werden. Diese Menge sollte ausreichen, um beim Zentrifugieren die Fläche 34 vollständig zu bedecken, sie sollte aber nicht so gross sein, um die Blutmenge, die der Behälter 20 aufnehmen kann, wesentlich zu beschränken. Die Menge des Kissen bildenden Mittels kann in Abhänig-keit vom Parameter des besonderen ausgewählten Systems, z.B. der Form des Stopfens, dem Volumen des restlichen Bluts und der Flüchtigkeit des verwendeten, Kissen bildenden Mittels, variiern. Eine bevorzugte Menge Kissen bildendes Mittel kann etwa 3,3 bis etwa 30,0 Vol.-% betragen, bezogen auf das Volumen der Mischung aus Kissen bildendem Mittel und restlicher Blutprobe, die aus dem Behäler 20 entfernt und auf die Gegenwart pathogener Mikroorganismen untersucht wird.

Das erfindungsgemäss verwendete, Kissen bildende Mittel kann aus einer hydrophoben, mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit hoher Dichte bestehen. Der Ausdruck «hohe Dichte» bezeichnet vorliegend eine Flüssigkeit, die von der Mischung aus Blut und Blutbehandlunsflüssigkeit oder einer anderen Flüssigkeitsprobe, von der man annimmt, dass sie pathogene Mikroorganismen enthält, bei Anwendung von Zentrifugalkraft nicht getragen wird. Ausserdem sollte das Kissen bildende Mittel gegenüber den pathogenen Mikroorganismen nicht toxisch und in bezug auf Butylkautschuk, Silikonkautschuk und andere Elastomere, die bei der Herstellung des durchstossbaren Verschlussgliedes verwendet werden, verhältnismässig inert sein. Die Dichte des Kissen bildenden Mittels kann im Bereich von etwa 1,2 g/cm3 bis etwa 2,0 g/cm3 liegen, wobei der bevorzugte Bereich etwa 1,6 g/cm3 bis etwa 2,0 g/cm3 beträgt.

Im allgemeinen werden fluorierte Kohlenwasserstoffe mit den oben beschriebenen Eigenschaften und Molekulargewichten im Bereich von etwa 300 bis etwa 850 bevorzugt. Weiterhin werden fluorierte Kohlenwasserstoffe mit den obigen Eigenschaften bevorzugt, die mit etwa der gleichen Geschwindigkeit verdampfen wie Wasser, wenn eine das Kissen bildende Mittel enthaltende Probe auf eine herkömmliche Plattenkultur aufgebracht wird. Dementsprechend können Kissen bildende Mittel mit den oben angegebenen Eigenschaften und Siedepunkten von etwa 90 °C bis 216 °C und vorzugsweise von etwa 100 °C bis etwa 140 °C verwendet werden. Das Kissen bildende Mittel sollte ausserdem einen Dampfdruck haben, der während der Verarbeitungsstufen, wie z.B. des Autoklavierens, die durchstossbaren Verschlüsse nicht aus dem Behälter drängt. Fluorierte Kohlenwasserstoffe, die unter den Handelsbezeichnungen Fluorinert von der 3M Company of Minneapolis, Minnesota, auf den Markt gebracht werden, erwiesen sich als geeignet. Besonders brauchbar waren die Typen FC-75, FC-48 und FC-43.

Obgleich die genaue Wirkungsweise der Kissen bildenden Mittel nicht vollständig bekannt ist, nimmt man an, dass sie die Sammlung der aus einer zentrifugierten Blutprobe ausgetretenen pathogenen Mikroorganismen in mindestens zweierlei Weise verbessern. Einmal verschliesst das Kissen bildende Mittel Zwischenräume, Risse und Löcher in der glatten Oberfläche 34 des Behälters 22 und an der Grenzfläche zwischen der Wandung des Behälters 22 und dem durchstossbaren Verschlussglied 26. Pathogene Mikroorganismen, die sonst in diesen Zwischenräumen eingeschlossen werden könnten und daher nicht gewonnen werden, werden mit dem Kissen bildenden Mittel 28 entfernt, wenn dieses dem Behälter 20 entnommen wird. Zweitens nimmt man an, dass das Kissen bildende Mittel den Zusammenstoss pathogener Mikroorganismen, die während des Zentrifugierens aus der Blutprobe gedrückt werden, abfängt. Dieser Dämpfungseffekt verringert die Gefahr einer Schädigung der pathogenen Mikroorganismen, die durch den Zusammenprall verursacht werden könnte. Während ferner einige der pathogenen Mikroorganismen tatsächlich in das Kissen bildende Mittel eintreten können, passiert im wesentlichen keiner dieses Mittel vollständig, und der überwiegende Teil sammelte sich an der Grenzfläche zwischen dem Kissen bildenden Mittel 28 und der Blutprobe in einer Schicht.

Nachdem das Kissen bildende Mittel 28 in den Behälter 20 eingebracht ist, können auch wasserlösliche Behandlungsmittel 30 für das Blut eingetragen werden. Solche Behandlungsmittel können z.B. die Zellauflösung bewirkende Mittel und/oder Antikoagulantien umfassen. Es kann jedes geeignete zellauflösende Mittel verwendet werden, solange es für die Mikroorganismen nicht toxisch ist. Ein geeignetes, die Zellauflösung bewirkendes Mittel ist eine wässrige Lösung eines nicht toxischen Saponins. Es ist bekannt, dass viele Saponine gegenüber pathogenen Mikroorganismen toxisch sind. In der US-Patentschrift 3 883 425 ist jedoch ein Verfahren zur Entfernung der toxischen Bestandteile aus Saponinen beschrieben, die man bisher als toxisch erachtete. Im allgemeinen kann das toxische Saponinmaterial gemäss der Lehre der US-Patentschrift 3 883 425 entgiftet werden. In dieser Weise gereinigtes Material kann im erfindungsgemässen Verfahrn eingesetzt werden. Die wässrige Saponinlösung kann ausserdem ein Antikoagulations-mittel und/oder Sauerstoffspülmittel enthalten. Ein bevorzugtes Antikoagulationsmittel ist z.B. Natrium-polyanethol-sulfo-nat (SPS) oder Heparin. Natrium-polyanethol-sulfonat wird bevorzugt, da es nicht nur als Antikoagulationsmittel wirkt, sondern auch die phagozytische Wirkung von Granulocyten und Monocyten sowie die normale antibakterielle Wirksamkeit von Blutserum hemmt. Vorzugsweise macht die wässrige Lösung des Behandlungsmittels mindestens 1,0 Vol.-% der gesamten Flüssigkeit aus Behandlungslösung, Flüssigkeitsprobe und Kissen bildendem Mittel im Behäler 22 aus. Vorzugsweise beträgt ihre Menge etwa 7,6 bis 17,5 Vol.-%.

Wenn die Behandlungsmittel 30 in den Zentrifugierbehäl-ter 20 eingebracht sind, kann das durchstossbare Verschlussglied 24 in Stellung gebracht und der Raum 32 auf den gewünschten Druck evakuiert werden, der niedriger ist als Atmosphärendruck.

In den Fig. 2 bis 9 ist schematisch eine Analysenfolge einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dargestellt. Als Beispiel kann in Verfahren gemäss einer Ausführungsform der Erfindung zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen in einer Blutprobe zweckmässig unter Verwendung der folgenden Anordnung durchgeführt werden :

Der Zentrifugierbehälter 20 mit dem Kissen bildenden Mittel 28 und den Blutbehandlungsmitteln 30 kann ein Volumen von 12 bis 14 ml haben.

Eine sterile Glasspritze und eine entfernbar subkutane Nadel mit einer Länge von 3,81 cm und einem äusseren Durchmesser von 1,7 mm;

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eine sterile Glasspritze und eine entfernbare subkutane Nadel mit einer Länge von 2,54 cm und einem äusseren Durchmesser von 0,81 mm;

eine subkutane Nadel mit einer Läne von 1,59 cm und einem äusseren Durchmesser von 0,5 mm mit einem Wattepfropfen als durchlässigen Verschluss in ihrer Mitte;

drei Blutagarplatten;

eine Schokoladeagarplatte;

eine Sabouraudplatte.

Mit Ausnahme des Zentrifugierbehälters 20 oder eines äquivalenten Gegenstandes können verschiedene Arten bekannter Laborvorrichtungen und Kulturmedien zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrns verwendet werden. Insbesondere ist festzustellen, dass die oben genannten Kulturmedien nur als Beispiele angeführt sind und im allgemeinen für die Bestimmung der häufigsten bekannten pathogenen Mikroorganismen bevorzugt werden. Bei den Blutagarplatten handelt es sich um herkömmlicherweise verwendete Blutagarplatten auf der Basis von Schafsblut und Nährstoffen, wie Zucker, die mit einem Agar-Verfestigungsmittel auf eine Petrischale aufgebracht werden. Die Schokoladeagarplatte wird zur Züchtung bestimmter heikler pathogener Mikroorganismen, z.B. Hämophilus, verwendet. Die Sabouraudplatte dient speziell zur Züchtung von Fungi.

Obgleich somit verschiedene Vorrichtungen für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet werden können, ist es zweckmässig, die oben aufgeführte Anordnung einzusetzen.

Der Zentrifugierbehälter 20 der Fig. 1 wird zu Anfang so angeordnet, dass sich das durchstossbare Verschlussglied 26 mit der geneigten glatten Oberfläche 34 am unteren Ende befindet, so dass das Kissen bildende Mittel 28 und die Blutbehandlungsflüssigkeit 30 auf der geneigten Oberfläche 34 zu stehen kommen. Zur besseren Illustration sind in Fig. 2 zwei getrennte Flüssigkeitsspiegel, die das Kissen bildende Mittel 28 und die Behandlungsflüssigkeit 30 veranschaulichen, dargestellt. In der Praxis kann aufgrund der Handhabung eine nicht-beständige Emulsion oder Mischung der beiden Flüssigkeiten eintreten, so dass nicht immer zwei getrennte Flüssigkeitsschichten vorhanden sind. Die unbeständige Mischung aus Kissen bildendem Mittel 28 und Blutbehandlungsflüssigkeit 30 beeinträchtigt das erfindungsgemässe Verfahren in keiner Weise, da die Trennung der beiden Flüssigkeiten rasch beim Zentrifugieren eintritt.

Dann wird eine vorbestimmte Menge einer einem Patienten abgezogenen Blutprobe 38, z.B. 7 ml Blut, unter Verwendung einer üblichen Spritze 40 in den evakuierten Raum des Behälters 20 eingespritzt, wie in Fig. 3 dargestellt. Alternativ kann die Probe direkt unter Verwendung einer feststehenden Standard-Doppelnadel mit einer herkömmlichen Vakuumblutabziehvor-richtung, wie sie unter der Bezeichnung «Vacutainer» von Beckten Dickenson vertrieben wird, in den Behälter 20 aufgezogen werden. Anschliessend wird der die Blutprobe 38, die Blutbehandlungsflüssigkeit 30 und das Kissen bildende Mittel 28 enthaltende Behälter 20 einem Mischvorgang unterworfen, um zu gewährleisten, dass die Blutbehandlungsmittel 30 vollständig mit der Blutprobe 38 vermischt werden. Diese Vermischungsstufe ist schematisch in Fig. 4 gezeigt.

Nachdem die Blutprobe 38 in dieser Weise behandelt wurde, wird der Behälter 20 zentrifugiert, damit die pathogenen Mikroorganismen in der behandelten Blutprobe 42 aus der Suspension austreten und sich an der Grenzfläche zwischen dem Kissen bildenden Mittel 28 mit hoher Dichte und der restlichen Probenflüssigkeit sammeln. Einige pathogene Mikroorganismen werden auf der Seitenwandung des Behälters 22 angrenzend an das höhere Ende der glatten Oberfläche 34 beim Punkt 22a abgelagert. Die Zentrifugierungsstufe ist schematisch in Fig. 5 dargestellt. Geschwindigkeit und Dauer der Zen-

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trifugierungsstufe können in Abhängigkeit von der Konstruktion des Behälters 20 und der Art der Zentrifugenvorrichtung stark variieren. Die Zentrifugierung kann zweckmässig in der Weise bewirkt werden, dass man dem die Blutprobe 42 und das Kissen bildende Mittel 28 enthaltenden Behälter 20 zwischen etwa 1500 und 6000 g und vorzugsweise etwa 1500 bis 3000 g verleiht. Wie in Fig. 5 dargestellt ist, wird eine Winkelrotorzentrifuge verwendet, die den Behälter 20 während des Zentrifugie-rens, z.B. in einem Winkel von 56°, wie durch den Bogen 43 angezeigt ist, einstellt. Wenn daher die glatte Oberfläche 34 einen Winkel von etwa 34° in bezug auf die Innenwandung des Behälters 20 einnimmt, werden die behandelte Blutprobe 42 und das Kissen bildende Mittel 28 während des Zentrifugierens in einem verhältnismässig rechten Winkel gegen die glatte Oberfläche 34 gepresst. Bei Verwendung einer Schaukelbecherzentrifuge wird der Behälter 20 bei im wesentlichen 0° in bezug auf die horizontale Fläche zentrifugiert. In diesem Fall macht der Winkel der Oberfläche 34 annähernd 90° aus, und es kann ein Kautschukverschlussglied mit einer ebenen inneren Oberfläche anstelle des Verschlussgliedes 26 verwendet werden.

Nach Beendigung der Zentrifugationsstufe kann der Behälter 20 von der Zentrifuge genommen und der grössere Teil der behandelten Blutprobe 42, aus der die pathogenen Mikroorganismen abgetrennt wurden, entfernt werden. Der vorliegend verwendete Ausdruck «restliches behandeltes Blut» oder «restliches Blut» bezeichnet eine Blutprobe, die so zentrifugiert wurde, dass die vorhanden pathogenen Mikroorganismen am Boden der Probe gesammelt wurden und damit einen «restlichen» Teil der Probe zurücklassen, der von pathogenen Mikroorganismen im wesentlichen frei ist. Diese Stufe ist in Fig. 6 dargestellt. Zur Erleichterung der Entfernung wird z.B.

eine Abzugsnadel 44 in Form einer üblichen subkutanen Nadel mit einem Wattestopfen durch das durchstossbare Verschlussglied 24 gestossen. Eine zweite subkutane Nadel mit der Spritze 45 kann durch das durchstossbare Verschlussglied 26 eingeführt werden, um den grösseren Teil der restlichen behandelten Blutprobe 42 zu entfernen, aus der die pathogenen Mikroorganismen abgetrennt wurden. Wenn z.B. der Behälter 20 ein Volumen von 12 bis etwa 14 ml hat, kann eine Nadel mit einer Länge von 3,81 cm und einem äusseren Durchmesser von 1,27 mm zur Entfernung der gesamten behandelten Blutprobe 42 bis auf etwa 1,3 bis 1,7 ml verwendet werden. Wie gezeigt, bevorzugt man die Entfernung des grösseren Anteils der restlichen Blutprobe aus dem Inneren des Behälters 22 an einer Stelle der Seitenwandung, die der an das obere Ende der glatten Fläche 34 angrenzenden Seitenwandung gegenüberliegt, um eine Störung der Schicht aus pathogenen Mikroorganismen, die sich auf und innerhalb der Grenzfläche der beiden Flüssigkeiten und an der Seitenwandung des Behälters 22 angrenzend an das obere Ende der glatten Fläche 34 gebildet hat, zu vermeiden. Der Hauptteil des restlichen Bluts wird in dieser Stufe entfernt, jedoch sollte ein kleiner Anteil restliches Blut im Behälter 22 verbleiben, so dass von der gesamten verbleibenden Flüssigkeit das Kissen bildende Mittel etwa 4,7 bis etwa 28,6 Vol.-% ausmacht. Vorzugsweise sollte das Kissen bildende Mittel nicht mehr als etwa 20 Vol.-% betragen, da grössere Mengen dieses Mittels die Morphologie der pathogenen Mikroorganismenkolonien in den nachfolgenden Kultivierungsstufen beeinträchtigen können.

Wenn der grössere Anteil der behandelten restlichen Blutprobe entfernt ist, können beide Nadeln aus den Verschlussgliedern 24 und 26 gezogen werden, und der Behälter 20 kann einer zweiten Vermischung unterworfen werden, wie schematisch in Fig. 7 gezeigt ist. Falls gewünscht, kann jedoch die Abzugsnadel 44 in ihrer Stellung im durchstossbaren Verschlussglied 24 bleiben, um die Entfernung der pathogene Mikroorganismen enthaltenden Flüssigkeit in einer späteren Stufe zu erleichtern. Die zweite Vermischungsstufe dient der Re-Suspendierung der pathogenen Mikroorganismen, die sich aus dem grösseren

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Anteil der restlichen behandelten Blutprobe 42 abgetrennt und die oben beschriebene Schicht gebildet haben. Die Re-Suspen-dierung der so gesammelten pathogenen Mikroorganismen im verbleibenden kleineren Teil der behandelten restlichen Blutprobe 42 gewährleistet eine bessere und gleichmässigere Gewinnung.

Wenn in der Vermischungsstufe die pathogenen Mikroorganismen im kleineren Anteil der behandelten restlichen Blutprobe 42 re-suspendiert sind, können die Mischung aus pathogenen Mikroorganismen in der behandelten restlichen Blut-proe und das Kissen bildende Mittel hoher Dichte aus dem Behälter 20 entfernt werden. Diese Stufe ist in Fig. 8 wiedergegeben. Wie oben ausgeführt, kann, falls gewünscht, die Abzugsnadel 44 in das durchstossbare Verschlussglied 24 eingesetzt werden, um die leichtere Entfernung der verbleibenden Bestandteile zu ermöglichen. Die Spritze 46 mit der subkutanen Nadel kann dann durch das Verschlussglied 26 eingeführt werden, um die Mischung 48 aus Kissen bildendem Mittel 28, dem kleineren Anteil an restlicher Blutprobe 42 und pathogenen Mikroorganismen zu entfernen. Zu bemerken ist, dass eine besonders gute Rückgewinnung möglich ist, wenn man die subkutane Nadel zur Entfernung der Bestandteile am unteren Ende der geneigten glatten Fläche 34 einführt. Man nimmt an, dass der Winkel der Fläche 34 zum Teil als Trichter wirkt, in den die restliche Flüssigkeit mit den pathogenen Mikroorganismen fliesst. Die Mischung 48 aus Kissen bildendem Mittel 28 hoher Dichte und dem kleineren Anteil an behandelter restlicher Blutprobe 42 sowie gewonnenen pathogenen Mikroorganismen sollte 1V2 ml Flüssigkeit ausmachen. Diese Flüssigkeit wird dann auf einem Medium für Bakterienwachstum ausgebreitet. Diese Stufe ist schematisch in Fig. 9 dargestellt. Unter Verwendung der oben erläuterten Anordnung kann das Material wie folgt verteilt werden:

Eine Blutagarplatte kann 0,3 ml der Mischung aufnehmen, und die Platte kann bei 36 °C in einer aeroben Atmosphäre bebrütet werden. Zwei Blutagarplatten können 0,3 ml der wässrigen Lösung aufnehmen und bei 36 °C in einer anaeroben Umgebung bebrütet werden. Eine Schokoladeagarplatte kann 0,3 ml der wässrigen Lösung aufnehmen und in einer Schale bei 36 °C bebrütet werden. Die Sabouraudplatte kann 0,3 ml der Mischung aufnehmen und in einer aeroben Umgebung bei 25 °C bebrütet werden. Die Wachstumsmedien sollten täglich auf das Vorhandensein von Kolonien geprüft werden. Es können mikroskopische Analysentechniken angewandt werden. Die Anzahl der pathogenen Mikroorganismen in 1 ml Blut kann durch Multiplizieren der Anzahl der Kolonien mit einem Korrekturfaktor ermittelt werden. Dieser Korrekturfaktor berücksichtigt die Gewinnungsmenge für einen gegebenen Organismus, die verwendeten Volumina Blut und Kissen bildendes Mittel hoher Dichte und die Menge der schliess-ausge-strichenen Mischung. In dem nachstehenden allgemeinen Beispiel beträgt der Korrekturfaktor 1,4.

Wie schon ausgeführt, können, falls gewünscht, im erfindungsgemässen Verfahren die genauen Verfahrensstufen, die Vorrichtungen und ihre Anordnung und die verwendeten Arten von Kulturmedien variiert werden. Z.B. kann man die Blutprobe und das Antikoagulationsmittel und/oder das zellauflösende Mittel unter Anwendung bekannter beliebiger Mittel vermischen. Ferner kann in einigen Fällen das in Fig. 6 gezeigte Abziehen des grösseren Teiles der Blutprobe 42 völlig unterlassen und nur ein kleinerer Teil der Blutprobe 42, der pathogene Mikroorganismen re-suspendiert enthält, vom Boden des Behälters zusammen mit dem Kissen bildenden Mittel hoher Dichte 28 abgezogen werden, wie Fig. 8 zeigt. Auch noch weitere Modifizierungen sind möglich.

Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemässe Verfahren.

Beispiel

Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um Vergleichs werte in bezug auf die prozentuale Gewinnung pathogener Mikroorganismen aus Blutproben bei Anwendung eines flüssigen Filtermediums gemäss der US-Patentschrift 3 928 139 und bei erfin-dungsgemässer Anwendung eines Kissen bildenden Mittels zu erhalten.

Die angewandte Technik ist in der Tabelle I entweder als «flüssiges Filtermedium» oder «Kissen bildendes Mittel» bezeichnet. Die Angaben (direkt unter der genannten Technik) erläutern das verwendete flüssige Filtermedium, z.B. 50%ige Saccharose in den Versuchen mit flüssigem Filtermedium, bzw. das eingesetzte Kissen bildende Mittel, z.B. Fluorinert FC-48, in den erfindungsgemässen Versuchen. Jede untersuchte Probe (1 bis 21, wie in der Tabelle I aufgeführt) wurde mit 7 ml Proben sterilen, einer Zellauflösung unterworfenen Bluts von gesunden Blutspendern hergestellt. Jede Probe wurde mit 0,3 ml verschiedener bekannter Konzentrationen eines menschlichen pathogenen Mikroorganismus (entweder Escherichia coli oder Candida albicans, wie in der Tabelle I angegeben) beimpft.

In jedem Test wurde ein Behälter 20, wie oben beschrieben, eingesetzt, ob nun ein flüssiges Filtermedium oder ein Kissen bildendes Mittel angewandt wurde. Um die Wirkung einer Fläche zu untersuchen, die im wesentlichen im Komplementärwinkel zum Winkel angeordnet ist, bei dem der Behälter 20 zentrifugiert wird, hatten einige der Behälter 20 ebene glatte innere Oberflächen, so dass die innere Oberfläche des Bodenstopfens horizontal zur Standfläche ausgerichtet war, wenn der Behälter 20 aufrecht stand. Diese Bodenstopfen sind in der Tabelle I als «horizontal» bezeichnet. Ferner wurden speziell hergestellte Verschlüsse für den Boden hergestellt, indem man herkömmliche Kautschukstopfen entweder in Verbindung mit einer herkömmlichen Badewannendichtungsmasse oder einem Harz auf Silikonbasis verwendete, das unter dem Handelsnamen Sylgard 134 von der Dow Corning, Midland, Michigan, vertrieben wird. Man erhielt auf diese Weise im Behälter 20 eine Grundfläche, die in bezug auf die Wandung des Behälters 20 in einem Winkel geneigt war, der im wesentlichen komplementär zu dem Winkel war, in dem der Behälter 20 zentrifugiert wurde. Die unter Verwendung von Bodenstopfen mit einer geneigten Fläche untersuchten Proben sind in der Tabelle I zusammen mit dem zu ihrer Herstellung verwendeten Material (entweder Badewannendichtungsmasse oder Sylgard) als solche bezeichnet. Die Zentrifugation der in Tabelle I aufgeführten Proben unter Verwendung der Stopfen mit geneigter Oberfläche erfolgte in einer Winkelrotorzentrifuge, in der der Zentrifugationswinkel etwa 56° betrug. Dementsprechend ergaben die Behälter mit in einem Winkel von etwa 34° abgeschrägten Bodenstopfen eine Bodengrundfläche, die im wesentlichen senkrecht zur Richtung der Zentrifugalkraft stand. Die Behälter mit einem horizontalen Bodenstopfen (wie in der Tabelle I angegeben) wurden in einer Schaukelbecherzentrifuge zentrifugiert, die während des Betriebs dazu führt, dass der Behälter 20 in einer Ebene gedreht wird, die im wesentlichen parallel zum Erdboden ist. Demenstprechend wurde eine Zentrifugalkraft von im wesentlichen rechten Winkel zur Oberfläche der horizontalen Bodenstopfen ausgeübt.

Bei Verwendung flüssigen Filtermediums enthielt jeder Behälter 20 1,2 ml einer wässrigen Lösung mit 1,5 Gew.-% Gela-tin und den in der Tabelle I angegebenen Saccharosekonzentrationen. Jeder Behälter 20 wurde umgedreht und in umgedrehter Stellung auf 4 °C gekühlt, bevor die beimpfte Blutprobe zugefügt wurde. Nachdem jeder Behälter 20 die erforderliche Menge Blutprobe mit der bekannten Menge menschlicher pa- ' thogener Mikroorganismen erhalten hatte, wurde er noch umgedreht in ein Wasserbad gestellt. Das Wasserbad wurde auf 42 °C eingestellt, worauf die Gelatine schmolz. Jedes Rohr wurde dann in einem Winkel von etwa 56° 30 Minuten bei

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9 636128

Anwendung einer relativen Zentrifugalkraft von 1500 oder platten verglichen, die in gleicher Weise hergestellt worden

3000 g, wie in der Tabelle I angegeben, in einer Rotorzentrifuge waren, wie die oben in bezug auf das flüssige Filtermedium zentrifugiert. beschriebenen. Die prozentuale Gewinnung bei Anwendung

An diesem Punkt des Verfahrens, das bei einigen Proben des Kissen bildenden Mittels wurde anschliessend errechnet,

angewandt wurde und vorliegend als «3»-Einführungsverfah- s Sie ist in der Tabelle laufgeführt.

ren bezeichnet ist, wurde eine 10-ml-Spritze durch den Boden- Obgleich keine exakte Theorie zur Erklärung der erhalte-stopfen eingeführt, um etwa 6,7 ml restliche Blutprobe zu ent- nen Daten vorliegt, könnte die niedrige Gewinnungsrate bei fernen. Dann wurde der Behälter 20 in einem Vortex-Mischer der Probe Nr. 2 der Tabelle I, für die 50%ige Saccharose als flüs-etwa Vi bis 2 Minuten gemischt. Nach der Mischstufe wurden siges Filtermedium und ein horizontaler Bodenstopfen verwen-1,5 ml des zugemischten Filtermediums und des Teils der im 10 det wurde, die Folge des Einschlusses pathogener Mikroorga-Behälter 20 verbliebenen Blutprobe mit einer herkömmlichen nismen längs der inneren Begrenzung des horizontalen Boden-Spritze mit Nadel entfernt. Bei anderen Proben unterliess man stopfens gegenüber der Wandung des Behälters 20 sein. Verdie Entfernung eines grösseren Anteils der restlichen Blutprobe gleicht man die Ergebnisse der Probe Nr. 1 mit denen der Probe nach dem Zentrifugieren. In diesem Fall wurden 1,5 ml des Nr. 3, für die wiederum flüssiges Filtermedium und ein hori-flüssigen Filtermediums und der Blutprobe am Bodenstopfen '5 zontaler Stopfen verwendet wurde, bei der jedoch 3 Einführun-direkt nach dem Zentrifugieren vom Boden des Behälters 20 gen zur Anwendung kamen, so sieht man, dass die Gewin-abgezogen. Die 1,5 ml, die aus einer Mischung des Filtermedi- nungsrate bei der Probe Nr. 3 wesentlich verbessert ist. Dies ums und restlicher Blutprobe sowie gesammelten pathogenen könnte damit erklärt werden, dass, nachdem weniger relative Mikroorganismen bestanden, wurden nach der Entfernung aus Zentrifugalkraft angewandt wurde, die pathogenen Mikroorga-dem Behälter 20 vermischt, um eine verhältnismässig gleichför- 20 nismen nicht so fest in dem Raum zwischen dem Bodenstopfen mige Verteilung der Komponenten beim Ausstreichen der und der Wandung des Behälters 20 eingeschlossen wurden. Probe zu erreichen. Der Unterschied zwischen diesen beiden Ausserdem ermöglicht die Anwendung von 3 Einführungen die Verfahren ist in der Tabelle I unter der Bezeichnung «Anzahl Gewinnung aller pathogener Mikroorganismen, die im restli-der Einführungen» angegeben, die jede Testprobe als solche chen Teil der Blutprobe re-suspendiert wurden. Bei 2 Einfüh-mit 2 oder 3 Einführungen bezeichnet. Im Falle von 3 Einfüh- 25 rungen können einige der re-suspendierten pathogenen rungen dient die erste der Einführung der Blutprobe, die zweite Mikroorganismen im restlichen Teil der Blutprobe verbleiben, der Entfernung des grösseren Teils der Blutprobe nach dem Ein Vergleich der Probe Nr. 15 mit der Probe Nr. 17 zeigt Zentrifugieren und vor dem Mischen und die dritte der Entfer- die bei Verwendung eines Kissen bildenden Mittels gemäss der nung des verbliebenen flüssigen Filtermediums und des ver- Erfindung erzielbaren Verbesserungen. Für die Probe Nr. 15 bliebenen Teils der Blutprobe. Bei 2 Einführungen dient die 30 wurde wie für die Probe Nr. 17 ein horizontaler Bodenstopfen erste der Einführung der Blutprobe in den Behälter 20 und die verwendet, die Anzahl der Einführungen betrug 3, und die rela-zweite der Entfernung von etwa 1,5 ml zugemischten flüssigen tive Zentrifugalkraft war die gleiche wie bei Probe Nr. 17 Filtermediums und Blutprobe vom Boden des Behälters 20. (3000). Man nimmt an, dass die bei Anwendung eines Kissen

In beiden Fällen, ob nun ein Verfahren mit 2 oder 3 Einfüh- bildenden Mittels gemäss der Erfindung erzielten verbesserten rungen angewandt wurde, wurden 5 Proben von jeweils 0,3 ml 35 Ergebnisse darauf zurückzuführen sind, dass die pathogenen der vom Boden des Behälters 20 abgezogenen 1,5 ml auf 5 Mikroorganismen nicht durch das Kissen bildende Mittel hingetrennten Platten ausgestrichen. Nach der Bebrütung wurden durchtreten und in dem Zwischenraum zwischen der Wandung diese Proben mit Kontrollplatten verglichen. Diese waren des Behälters 20 und dem Bodenstopfen verlorengehen können, dadurch hergestellt worden, dass man die gleiche bekannte Ein Vergleich der Probe Nr. 9 mit der Probe Nr. 11 veran-Menge pathogener Mikroorganismen, wie sie der zu untersu- to schaulicht die Vorteile, die bei Verwendung eines abgeschräg-chenden Blutprobe zugefügt worden war, zu einer Kochsalzlö- ten Stopfens im Vergleich zu einem horizontalen Bodenstopfen sung gab und 0,3 ml der Kochsalzlösung auf jeweils 5 Agarplat- erzielt werden. Da die Bedingungen und angewandten Techni-ten aufstrich. Die prozentuale Rückgewinnung, bezogen auf ken bei den Proben Nr. 9 und 11 vollständig identisch waren, den Vergleich der Probeplatten mit den Kontrollplatten, ist in mit der Abweichung, dass bei der Probe Nr. 11 ein abgeschräg-der Tabelle I aufgeführt. « ter Stopfen verwendet wurde, kann die bei der Probe Nr. 11

Das Verfahren unter Verwendung eines Kissen bildenden erreichte Verbesserung in der Gewinnungsrate nur der Verwen-Mittels zur Untersuchung von Blutproben wurde wie folgt dung des abgeschrägten Bodenstopfens zugeschrieben werden, durchgeführt. Ein Zentrifugenbehälter 20 wurde entweder mit Die innere Oberfläche dieses Stopfens ist in bezug auf die Wan-einem horizontalen oder einem abgeschrägten Bodenstopfen dung des Behälters 20 in einem Winkel geneigt, der komple-hergestellt. Jeder in diesem Verfahren verwendete Behälter 20 so mentär zum Winkel ist, in dem der Behälter 20 zentrifugiert enthielt 0,3 ml Fluorinert FC-48.7 ml einer Zellauflösung wird. Ein Vergleich der Probe Nr. 10 mit der Probe Nr. 12 verunterworfenen Bluts, die mit einer bekannten Anzahl pathoge- anschaulicht ebenfalls die besseren Ergebnisse, die bei Verwen-ner Mikroorganismen verunreinigt worden waren, wurden dung eines abgeschrägten Bodenstopfens bei höherer relativer dann durch den oberen Stopfen des Behälters 20 eingeführt. Zentrifugalkraft (3000) erreicht werden.

Anschliessend wurden die Behälter 20 in der gleichen Winkel- 55 rotorzentrifuge zentrifugiert, wie die mit dem flüssigen Filtermedium hergestellten Proben. Es wurde 30 Minuten bei einer relativen Zentrifugalkraft von entweder 1500 g oder 3000 g zentrifugiert, wie es in der Tabelle I angegeben ist. Bei Anwendung des Verfahrens mit 3 Einführungen wurden etwa 5,8 ml rest- eo liehe Blutprobe entfernt, die man mit einer 10-ml-Spritze durch den Bodenstopfen abzog. Bei Anwendung des Verfahrens mit 2 Einführungen wurde diese Massnahme unterlassen. In jedem Fall wurden 1,5 ml, die etwa 1,2 ml restliche Blutprobe und 0,3

ml Fluorinert enthielten, vom Boden des Behälters 20 abgezo- 65 gen. Dann wurden unter Verwendung von jeweils 0,3 ml aus restlicher Blutprobe und Fluorinert 5 Probenplatten hergestellt.

Diese Platten wurden bebrütet und nachfolgend mit Kontroll-

636128 . 10

Tabelle I

Probe-

pathogene Mikro

Technik

Boden

Anzahl der relative

Prozentuale

Nr.

organismen

stopfen

Einfüh

Zentrifu

Gewinnung

rungen galkraft

1.

Escherichia coli flüssiges Filtermedium horizontal

2

1500

65 ± 11

50%ige Saccharose

2.

Escherichia coli flüssiges Filtermedium horizontal

2

3000

55 ±5

50%ige Saccharose

3.

Escherichia coli flüssiges Filtermedium horizontal

3

1500

90 ±4

50%ige Saccharose

4.

Escherichia coli flüssiges Filtermedium horizontal

2

3000

63+ 14

60%ige Saccharose

5.

Escherichia coli flüssiges Filtermedium horizontal

3

1500

90 ±3

60%ige Saccharose

6.

Escherichia coli flüssiges Filtermedium horizontal

3

3000

95 ± 15

60%ige Saccharose

7.

Escherichia coli

Kissen bildendes Mittel horizontal

2

1500

65+16

Fluorinert FC-48

8.

Escherichia coli

Kissen bildendes Mittel horizontal

2

3000

90 + 7

Fluorinert FC-48

9.

Escherichia coli

Kissen bildendes Mittel horizontal

3

1500

81,5 ±4

Fluorinert FC-48

10.

Escherichia coli

Kissen bildendes Mittel horizontal

3

3000

89 ±2

Fluorinert FC-48

11.

Escherichia coli

Kissen bildendes Mittel abgeschrägt,

3

1500

98 ± 1,2

Fluorinert FC-48

Sylgard-

Stopfen

12.

Escherichia coli

Kissen bildendes Mittel abgeschrägt

3

3000

98+1

Fluorinert FC-48

Sylgard-

Stopfen

13

Candida alibicans flüssiges Filtermedium horizontal

2

1500

38 ±22

50%ige Saccharose

14.

Candida alibicans flüssiges Filtermedium horizontal

2

3000

40 + 8

50%ige Saccharose

15.

Candida alibicans flüssiges Filtermedium horizontal

3

3000

53 + 16

50%ige Saccharose

16.

Candida alibicans flüssiges Filtermedium horizontal

3

1500

92 ±7

60%ige Saccharose

17.

Candida alibicans

Kissen bildendes Mittel horizontal

3

3000

98 ±6

Fluorinert FC-48

18.

Candida alibicans

Kissen bildendes Mittel abgeschrägt,

3

1500

99 + 4

Fluorinert FC-48

Sylgard-Stop-

fen

19.

Candida alibicans

Kissen bildendes Mittel abgeschrägt,

3

3000

100

Fluorinert FC-48

Sylgard-Stop-

fp ri

20.

Candida alibicans

Kissen bildendes Mittel icll abgeschrägt,

3

1500

91 ± 16

Fluorinert FC-48

Badewannen

dichtungs

stopfen

21.

Candida alibicans

Kissen bildendes Mittel abgeschrägt,

3

3000

99 ± 1

fluorinert FC-48

Badewannen-

dichtungs-

55

stopFen

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims (13)

1. 636128 2

   PATENTANSPRÜCHE 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,

   1. Verfahren zur Bestimmung pathogener Mikroorganis- dass man ein die Zellauflösung bewirkendes Mittel in das Zen-men in einer Flüssigkeitsprobe durch Zentrifugieren einer die trifugenröhrchen (20) einbringt und die Blutprobe vor dem Flüssigkeitsprobe enthaltenden geschlossenen sterilen Zone, Zentrifugieren mit ihm vermischt.

   dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation der Flüssig- 5 11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch keitsprobe in Gegenwart eines flüssigen, nicht toxischen, mit gekennzeichnet, dass man für die Zentrifugierung ein Röhr-

   Wasser nicht mischbaren, Kissen,bildenden Mittels hoher chen mit einem das Kissen bildende Mittel tragenden und in

   Dichte durchgeführt wird. solcher Weise angeordneten Boden verwendet, dass beim Zen-
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, trifugieren die Blutprobe in im wesentlichen rechten Winkel dass das Kissen bildende Mittel (28) in einer Menge von 3,3 bis '<> gegen das Kissen bildende Mittel und die Bodenfläche gepresst 30,0 Vol.-% vorliegt. wird.
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch 12. Vorrichtung zur Konzentrierung pathogener Mikroor-gekennzeichnet, dass das flüssige, nicht-toxische, mit Wasser ganismen aus einer Flüssigkeitsprobe, gemäss Anspruch 1,

   nicht mischbare, Kissen bildende Mittel (28) hoher Dichte aus bestehend aus einem geschlossenen, mit durchstossbaren Vereinen! inerten fluorierten Kohlenwasserstoff mit einem Mole- is schlüssen (24,26) versehenen Zentrifugenbehälter (20), der kulargewicht von 300 bis 850 besteht. innen einen evakuierten Raum (32) aufweist, der auf einem
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, niedrigeren Druck als Atmosphärendruck gehalten wird und dass der fluorierte Kohlenwasserstoff eine Dichte von 1,6 g/cm3 an ein flüssiges, nicht-toxisches, mit Wasser nicht mischbares, bis 2,0 g/cm3 und einen Siedepunkt von 90 bis 216 °C hydrophobes, Kissen bildendes Mittel (28) hoher Dichte hat. 20 angrenzt, das im wesentlichen alle aus der Suspension der Flüs-
5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn- sigkeitsprobe austretenden pathogenen Mikroorganismen zu zeichnet, dass man (a) in einer geschlossenen sterilen Zone (32) sammeln vermag ohne Verlust an pathogenen Mikroorganis-die Flüssigkeitsprobe auf ein flüssiges, nicht-toxisches, mit men an Zwischenräume im Zentrifugenbehälter.

   Wasser nicht mischbares, hydrophobes, Kissen bildendes Mittel 13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeich-(28) hoher Dichte aufbringt, und (b) die geschlossene Zone zen- 25 net, dass der Behälter (20) das Kissen bildende Mittel (28) in trifugiert, so dass die Flüssigkeitsprobe gegen das Kissen bil- einer Menge von 3,3 bis 30,0 Vol.-% enthält.

   dende Mittel gepresst wird und im wesentlichen die gesamten 14. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeich-

   pathogenen Mikroorganismen aus der Suspension austreten net, dass der Behälter (20) das Kissen bildende Mittel (28) in und sich an der Grenzfläche zwischen Flüssigkeitsprobe und einer Menge von 4,7 bis 28,6 Vol.-% enthält.

   Kissen bildendem Mittel sammeln, (c) das Kissen bildende Mit- 30 15. Vorrichtung nach den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch tel und die gesammelten pathogenen Mikroorganismen von der gekennzeichnet, dass der Behälter (20) als Kissen bildendes restlichen Flüssigkeitsprobe trennt und (d) die so gesammelten Mittel (28) einen inerten, flüssigen, fluorierten Kohlenwasser-pathogenen Mikroorganismen analysiert. stoff mit einer Dichte von 1,6 g/cm3 bis 2,0 g/cm3
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, enthält.

   dass man die pathogenen Mikroorganismen durch Mischen die- 35 16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeich-

   ser Mikroorganismen im kleineren Anteil der restlichen Flüs- net, dass der Behälter als flüssigen fluorierten Kohlenwasser-

   sigkeitsprobe und nachfolgendes quantitatives Ausstreichen stoff einen solchen mit einem Siedepunkt von 90 bis 210 °C ent-

   dieser Mischung auf Kulturmedien für pathogene Mikroorga- hält.

   nismen analysiert. 17. Vorrichtung nach den Ansprüchen 12 bis 16, für die
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, 40 Konzentrierung von in einer Blutprobe enthaltenen pathoge-dass man die Mischung aus pathogenen Mikroorganismen und nen Mikroorganismen, bestehend aus (a) einem geschlossenen restlicher Flüssigkeitsprobe mikroskoisch analysiert. Zentrifugenbehälter (20) mit einem ersten und einem zweiten
8. 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, zur Bestimmung Ende, die mit durchstossbaren Verschlüssen (24,26) dicht ver-pathogener Mikroorganismen in einer einer Zellauflösung schlössen sind, (b) einem durchstossbaren Pfropfen (26), der an unterworfenen Blutprobe, die pathogene Mikroorganismen 45 den durchstossbaren Verschluss des zweiten Endes angrenzt und antipathogene Faktoren enthält, dadurch gekennzeichnet, und eine in bezug auf das Innere des Behälters geneigte Ober-dass man (a) in ein evakuiertes Zentrifugenröhrchen (20) ein fläche (34) aufweist, deren Winkel (36) komplementär zu dem flüssiges, steriles, mit Wasser nicht mischbares, hydrophobes, Winkel ist, in dem der Behälter zentrifugiert werden soll, (c) Kissen bildendes Mittel (28) hoher Dichte in einer Menge von einer wirksamen Menge eines flüssigen, nicht-toxischen, mit 3,3 bis 30,0 Vol.-%, bezogen auf das Volumen an Kissen bilden- 50 Wasser nicht mischbaren, hydrophoben, Kissen bildenden Mit-dem Mittel und Blutprobe, einbringt, (b) die Blutprobe auf das tels (28) hoher Dichte im Zentrifugenbehälter und (d) einer Kissen bildende Mittel im evakuierten Zentrifugenröhrchen wirksamen Menge eines nicht-toxischen, die Zellauflösung aufbringt, (c) das Zentrifugenröhrchen zentrifugiert, damit die bewirkenden Mittels (30) im Zentrifugenbehälter (20). Blutprobe gegen das Kissen bildende Mittel gepresst wird und 18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeich-im wesentlichen alle pathogenen Mikroorganismen aus der 55 net, dass der durchstossbare Pfropfen aus einer Verlängerung Suspension austreten und sich in einer Schicht auf dem Kissen des durchstossbaren Verschlusses des zweiten Endes des Zentri-bildenden Mittel sammeln, (d) einen grösseren Anteil der restii- fugenbehälters besteht.

   chen Blutprobe vom Kissen bildenden Mittel und der Schicht 19. Vorrichtung nach Anspruch 17 und 18, dadurch gekenn-

   aus pathogenen Mikroorganismen trennt, (e) diese Schicht der zeichnet, dass der Winkel der Oberfläche (34) des durchstossba-

   pathogenen Mikroorganismen mit dem verbleibenden kleine- 60 ren Pfropfens (26) in bezug auf das Innere des Behälters (20)

   ren Anteil der restlichen Blutprobe mischt, (f) diese Mischung 30° bis 80° beträgt.

   und das Kissen bildende Mittel aus dem Zentrifugenröhrchen 20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeich-

   entfernt und (g) die Mischung und das Kissen bildende Mittel net, dass der Winkel etwa 34° beträgt.

   auf das Vorhandensein pathogener Mikroorganismen unter- 21. Vorrichtung nach den Ansprüchen 17 und 18, dadurch sucht. 65 gekennzeichnet, dass der Winkel der Oberfläche des durch-
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, stossbaren Pfropfens (26) in bezug auf das Innere des Behälters dass man die Blutprobe im Zentrifugenröhrchen (20) einer Zell- (20) etwa 90° beträgt.

   autlösung unterwirft. 22. Vorrichtung nach den Ansprüchen 17 bis 21, dadurch

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   gekennzeichnet, dass der Behälter (20) eine wirksame Menge zellauflösender Mittel, Antikoagulantien und von deren Gemischen (30) enthält.
10. 23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter (20) die zellauflösenden Mittel und die Antikoagulantien in einer Menge von mindestens 1 Vol.-%, bezogen auf das Volumen der Behandlungsmittel (30), der Blutprobe und des Kissen bildenden Mittels (28), enthält.
11. 24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter 20 die Behandlungsmittel (30) in einer Menge von 7,6 bis 17,5 Vol.-% enthält.
12. 25. Vorrichtung nach den Ansprüchen 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter als Behandlungsmittel (30) entgiftetes Saponin enthält.
13. 26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter als Behandlungsmittel (30) Natrium-polyanethol-sulfonat enthält.