DK153763B - Fremgangsmaade til paavisning af mikrobielle patogener under anvendelse af et ikke-toxisk, med vand ikke-blandbart, hydrofobt, flydende middel og indretning til brug ved denne fremgangsmaade - Google Patents

Description

i

DK 153763 B

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til påvisning af mikrobielle patogener, som formodes at forekomme i en væskeprøve, fortrinsvis til diagnosticering af sepsis, ved centrifugering af en afgrænset steril zone indeholdende denne væskeprøve, hvilken 5 centrifugering udføres i nærværelse af et ikke-toxisk, flydende middel med en massefylde, der er større end væskeprøvens, hvorved i det væsentlige alle de mikrobielle patogener går ud af væskeprøven, samt en indretning til brug ved denne fremgangsmåde.

Sepsis, hvilket er forekomsten af patogene mikroorganismer i blodet, 10 er en af det mest alvorlige infektionstyper, der kendes. Selv om moderne medicin er veludrustet med antibiotika og antifungale midler, er mortalitetsgraden ved sepsis ca. 25%. Når desuden sepsis ledsages af chok, stiger mortalitetsgraden til mere end 60%. Debiliterende sygdomme, store kirurgiske indgreb, administration af immunosup-15 pressive midler eller anti-cancer-medikation gør patienter særlig udsatte for sepsis.

Tidlig administration af passende antibiotika er vigtig ved bekæmpelse af sepsis. Det er derfor vigtigt, at lægen så hurtigt som muligt får at vide, ikke kun om patienten har sepsis, men også får kendskab til 20 den angribende mikroorganismes identitet og dens påvirkelighed af antibiotiske midler. Hurtig og korrekt diagnose af sepsis afhænger således af en meget hurtig og effektiv kvantitativ analyse af patientens blod. Det er endvidere meget vigtigt under den kvantitative analyse af patientens blod, at blodprøven ikke forurenes med patoge-25 ner fra laboratorieomgivelserne.

Der anvendes almindeligvis tre analytiske systemer til bestemmelse af tilstedeværelsen af mikroorganismer i en legemsvæske. Disse sædvanlige systemer omfatter kultivering i flydende dyrkningsmedium, den såkaldte dybdeudsædsteknik (pour plate method) og filtrering under 30 anvendelse af et fast matrixfilter. Hvert af disse systemer har sine ulemper, og ingen af systemerne giver en hurtig påvisning af mikroorganismer i blodprøven. Kultivering i flydende dyrkningsmedium er almindeligvis ikke kvantitativ, og dybdeudsædsteknikken og filtreringsmetoden (under anvendelse af et fast matrixfilter) er åbne sy-

DK 153763 B

2 stemer, der er udsat for ydre forurening, fx indførelse af patogener i kulturen fra laboratorieatmosfæren og personalet.

Der er for nylig udviklet en forbedret metode og et forbedret apparat til bestemmelse af tilstedeværelsen af mikrobielle organismer i en 5 prøvevæske, fx blod. Denne metode er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.928.139.

Ved denne forbedrede metode opnås en hurtig og kvantitativ påvisning af mikrobielle patogener i en prøve af legemsvæske ved at anvende et flydende filtermedium. Væskeprøven anbringes på det fly-10 dende filtermedium inden for en afgrænset steril zone. Det flydende filtermedium har en massefylde, der er højere end væskeprøvens, og omfatter en steril vandig opløsning, som selektivt optager de mikrobielle patogener fra væskeprøven. Den afgrænsede sterile zone underkastes derefter centrifugering for at tvinge væskeprøven imod det 15 flydende filtermedium og forårsage, at mikrobielle patogener selektivt trænger ind i dette, hvorved de skilles fra massen af legemsvæske-prøven. Derefter skilles det flydende filtermedium indeholdende de mikrobielle patogener fra den resterende del af væskeprøven, og portioner af det flydende filtermedium underkastes forskellige dyrk-20 ningsbetingelser.

Den ovenfor beskrevne forbedrede metode er en meget hurtig og effektiv teknik til adskillelse af mikrobielle patogener fra en prøvevæske. Ved en foretrukken udførelsesform af den flydende filtermedi-ummetode lyseres blodprøven før centrifugeringstrinnet, hvorved de 25 mikrobielle patogener selektivt optages i det flydende filtermedium.

Andre forbehandlingsmidler, fx antikoaguleringsmidler, anvendes også til at præparere blodprøven. Nogle bestanddele i de foretrukne flydende filtermedier, der anvendes ved den forbedrede ovenfor beskrevne metode, er uforenelige med nogle af forbehandlings- og/eller 30 lyseringsmidlerne, og de skal være adskilt fra blodprøven indtil anvendelsestidspunktet. Sådanne midler vil endvidere blandes med det flydende filtermedium, hvis de sættes dertil før det tidspunkt, hvor blodprøven sættes til den afgrænsende sterile zone, og når sådanne midler én gang er tilsat, kan de ikke diffundere fra det flydende 35 filtermedium hurtigt nok til effektivt at behandle blodet. Det er

DK 153763 B

3 derfor nødvendigt enten at udsætte blodprøven for mulig ydre forurening ved at blande blodprøven med forbehandlings- og/eller lyseringsmidlerne, før den føres ind i et lukket sterilt system, eller at anvende et specielt apparatur, hvor behandlingsmidlerne kan være 5 inden for det lukkede system, men adskilt fra det flydende filtermedium, indtil apparatet anvendes. Apparater af denne type er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.875.012 og USA patentskrift nr.

3.932.222.

Ved den ovenfor beskrevne forbedrede metode til påvisning af mikro- 10 bielle patogener i blodprøver anvendes der endvidere et flydende filtermedium i en centrifugeringsbeholder, som omfatter et gennem-stikkeligt lukkeorgan for enden af beholderen, mod hvilket blodprøven og det flydende filtermedium tvinges ved centrifugering. Det har vist sig, at nogle af de tungere mikrobielle patogener, som opfanges af 15 det flydende filtermedium, kan passere helt igennem det flydende filtermedium under den kraft, som meddeles ved centrifugering, og lægge sig til hvile ved bunden af den centrifugeringsbeholder, der anvendes, og hvis der ikke passes meget på under adskillelse og isolering af det flydende filtermedium, kan nogle af sådanne mikrobi-20 elle patogener blive uisoleret tilbage. Det antages, at tabet af mikrobielle patogener i sådanne tilfælde opstår, fordi de, efter helt at have passeret igennem det flydende filtermedium, samler sig i den smalle sprække, der dannes mellem centrifugeringsbeholderens væg og det gennemstikkelige lukkeorgan.

25 Der er således et behov for en lukket, steril metode til adskillelse og koncentrering af mikrobielle patogener, som formodes at forekomme i en blodprøve, uden i forvejen at skulle blande blodprøven i potentielt forurenende omgivelser og uden at skulle anvende specielt udformet apparatur til at udføre forbehandlingstrinnet ved fremgangsmåden.

30 Det er endvidere særlig ønskeligt at forøge isoleringen af de mikrobielle patogener, der selektivt er skilt fra og koncentreret fra en væskeprøve.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den ovenfor definerede art til påvisning af mikrobielle patogener, som formodes at

DK 153763B

4 forekomme i en væskeprøve, fortrinsvis til diagnosticering af sepsis, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at det ikke-toxiske flydende middel er et med vand ikke-blandbart, hydrofobt fluoreret carbonhydrid med en molekylvægt i området mellem ca. 300 og ca. 850 5 og med en massefylde på mellem ca. 1,2 og ca. 2,0 g/cm , og at de mikrobielle patogener ved centrifugeringen tvinges enten ind i det ikke-toxiske flydende middel, men ikke igennem det, hvorved størstedelen af patogenerne koncentreres i det ikke-toxiske flydende middel, eller til grænsefladen mellem det ikke-toxiske flydende middel og 10 væskeprøven, hvorefter patogenerne i det flydende middel i en ringe mængde af væskeprøven, der ligger op til grænsefladen mellem det flydende middel og væskeprøven, skilles fra den øverste del af væskeprøven, og de således opsamlede patogener analyseres på i og for sig kendt måde. Fremgangsmåden kan udnyttes på alle typer legems-15 væsker, fx blod, knoglemarv, spinal- og pleuralvæsker og urin. Desuden kan fremgangsmåden udnyttes på en hvilken som helst prøve, der indeholder mikroorganismer, til at koncentrere og adskille mikroorganismerne fra eventuelle antimikrobielle faktorer, som forekommer i væskeprøven, fx fødevarer såsom mælk. Når fremgangsmå-20 den anvendes i forbindelse med en blodprøve, omfatter den generelt anbringelse af en lyseret blodprøve på et relativt tyndt lag af det som underlag virkende ikke-toxiske, med vand ikke-blandbare, hydrofobe, flydende middel med en massefylde, der er større end væskeprøvens. Det ikke-toxiske, flydende, med vand ikke-blandbare hydro-25 fobe middel kaldes herefter "underlagsmidlet". Sådanne underlagsmidler er forenelige med lyserende og andre blodbehandlingsmidler, og sådanne midler vil hurtigt adskilles fra underlagsmidlet, når de blandes dermed. For at undgå mulig forurening kan en blodprøve derfor fortrinsvis injiceres i en steril afgrænset zone indeholdende både det 30 ovenfor beskrevne underlagsmiddel og en aktiv mængde af lyserende og/eller andre blodbehandlingsmidler, så at blodprøven behandles in situ. Den lyserede blodprøve i den afgrænsede sterile zone underkastes derefter centrifugering, hvorved blodprøven tvinges mod underlagsmidlet, som også forekommer der. Det har vist sig, at i det 35 væsentlige alle mikrobielle patogener i en lyseret blodprøve går ud af suspensionen ved en sådan centrifugering og samles i et lag, der støder op til grænsefladen mellem underlagsmidlet og selve blodprøven. De mikrobielle patogener vil faktisk trænge igennem grænse-

DK 153763 B

5 fladen mellem underlagsmidlet og blodprøven og gå ind i underlagsmidlet eller vil forblive på overfladen eller ved overfladen af underlagsmidlet, og ingen eller i det væsentlige ingen vil gå helt igennem underlagsmidlet. Dette står i kontrast til anvendelsen af et flydende 5 filtermedium, som selektivt optager mikrobielle patogener, og hvor nogle af mikroorganismerne kan gå helt igennem og fanges mellem væggen af centrifugeringsbeholderen og det gennemstikkelige lukkeorgan. Laget af mikrobielle patogener, som dannes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan derefter isoleres uden 10 væsentligt tab ved at skille underlagsmidlet og en mindre del af den resterende blodprøve, som støder op til grænsefladen med underlagsmidlet, fra den største del af prøven. Forekomsten af underlagsmiddel under centrifugeringen af den lyserede blodprøve gør det således muligt at skille mikrobielle patogener fra den lyserede blodprøve samt .15 fra eventuelle medikamenter og antipatogene faktorer, som forekommer deri. Efter isoleringen kan de mikrobielle patogener analyseres både kvantitativt og kvalitativt.

Anvendelsen af det ikke-toxiske, med vand ikke-blandbare, hydrofobe fluorerede carbonhydrid som ovenfor defineret (underlagsmidlet) til 20 opsamling og adskillelse af mikrobielle patogener fra en væskeprøve i en centrifugeringszone er en forbedring af den teknik, der er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.928.139 og 3.932.222.

Mange af de vandige flydende filtermedier, der er beskrevet i den kendte teknik, er uforligelige med de midler, der anvendes til forbe-25 handling af blod før centrifugeringen. Det var derfor nødvendigt enten at behandle blodet uden for centrifugeringsbeholderen som angivet i USA patentskrift nr. 3.928.139, eller at anvende en særlig raffineret udformet beholder som beskrevet i USA patentskrift nr. 3.932.222 for at holde blodbehandlingsmidlerne adskilt fra det flyden-30 de filtermedium, før prøven blev injiceret i centrifugeringszonen. Ved at gå frem ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har det vist sig, at et hydrofobt, med vand ikke-blandbart fluoreret carbonhydrid med en molekylvægt på mellem ca. 300 og ca. 850 og med 3 en massefylde på mellem 1,2 og 2,0 g/cm , hvilket er større end 1 prøvens, er forligeligt med sådanne sædvanlige blodbeharidlingsmidler,

DK 153763 B

6 hvorfor, det kan være i en centrifugeringsbeholder i kontakt med det flydende filtermedium (det flydende middel, som anvendes ifølge opfindelsen), før det tidspunkt, hvor prøven injiceres i centrifugeringsbeholderen. Ved at gå frem på denne måde injiceres prøven blot 5 i centrifugeringsbeholderen og blandes med de dér værende bestanddele, hvorefter der dannes en dispersion af hydrofobt, med vand ikke-blandbart materiale inde i prøven og blodbehandlingsmidlet, men blodbehandlingsmidlet vil kunne behandle blodprøven; og centrifugering vil fraskille det hydrofobe, med vand ikke-blandbare flydende 10 middel og lade det virke ved at opfange i det væsentlige alle de mikrobielle patogener, der ligger op til grænsefladen mellem det og det vandige medium, i overensstemmelse med opfindelsen.

Inkorporering af de lyserende og/eller blodbehandlende midler i prøvebeholderen frembyder endvidere den store fordel, at eventuel 15 forurening undgås, idet det ikke er nødvendigt at anvende separate kamre for hver komponent som ifølge USA patentskrift nr. 3.932.222. Desuden er den vandige fase af blodbehandlingsmidlerne ikke-bland-bar med det flydende middel, og den vil således i større udstrækning blive blandet med blodprøven, end hvis der blev anvendt et vandigt 20 middel til opfangning.

Det antages, åt disse underlagsmidler på grund af deres høje massefylde virker som underlag for mikrobielle patogener, som tvinges ud af en suspension i en blodprøve ved centrifugering. De mikrobielle patogener fanges og understøttes ved grænselaget mellem selve bfod-25 prøven og underlagsmidlet. På denne måde tabes mikrobielle patogener ikke i mellemrum, som kan være på overfladen af den afgrænsede sterile zone, mod hvilken de tvinges ved centrifugeringen.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en hidtil ukendt indretning til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning af 30 mikrobielle patogener, som formodes at forekomme i en væskeprøve, hvilken indretning omfatter: en lukket centrifugeringsbeholder, der kan lukkes tæt med gennemstikkelige lukkeorganer, og hvis indre omfatter et evakueret rum, der holdes ved et tryk, som ligger under atmosfæretryk, tilgrænsende et ikke-toxisk, flydende middel med en

DK 153763 B

7 massefylde, der er større end vaeskeprøvens, hvilken indretning er ejendommelig ved, at det ikke-toxiske flydende middel er et med vand ikke-blandbart hydrofobt fluoreret carbonhydrid med en molekylvægt i området mellem ca. 300 og ca. 850 og med en massefylde på mellem ca.

5 1,2 og ca. 2,0 g/cm^.

Den hidtil ukendte indretning har en glat, sammenhængende overflade inden i en centrifugeringsbeholder, så at væskeprøven ved centrifugeringen af centrifugeringsbeholderen tvinges ud mod overfladen i en derpå i det væsentlige ret vinkel. Overfladen omfatter den indre ende 10 af et gennemstikkeligt lukkeorgan for beholderen, på hvilken det ovenfor beskrevne underlagsmiddel er anbragt. Dette underlagsmiddei fordeles på den indre overflade af det gennemstikkelige lukkeorgan og vil udfylde mellemrummet mellem væggen i centrifugeringsbeholderen og det gennemstikkelige lukkeorgan, hvorved det undgås, at nogen af 15 de tungere mikrobielle patogener, som kan gå igennem underlagsmidlet under centrifugeringen, ikke bliver fanget. Når der anvendes en kurvecentrifuge, skal den indre overflade af det gennemstikkelige lukkeorgan være vinkelret på det indre af centrifugeringsbeholderens sider. Når der anvendes en centrifuge med vinkelrotor, må den glatte 20 indre overflade af det gennemstikkelige lukkeorgan anbringes sådan i centrifugebeholderen, at vinklen er komplementær med den vinkel, i hvilken centrifugeringen udføres. Denne særlige udformning muliggør, at man kan anvende almindeligt tilgængelige vinkelcentrifuger, og bevirker reelt en kortere vej for patogen erne gennem væskeprøven, 25 før de bliver samlet ved underlagsmidlets indre overflade. Denne kortere vej medfører, at der skal pålægges en større g en n ems nits kraft ("g"-kraft) på de mikrobielle patogener inden i væskeprøven. Centrifugering med denne særligt udformede centrifugeringsbeholder resulterer i, at patogenerne samles ved underlagsmidlets og væskeprøvens 30 grænseflade og til dels på centrifugeringsbeholderens sidevæg. De således koncentrerede mikrobielle patogener kan let opsamles og fjernes fra centrifugeringsbeholderen. Placeringen af den indre overflade i centrifugeringsbeholderen i en sådan vinkel, at blodprøven og underlagsmidlet tvinges mod overfladen i en i det væsentlige ret 35 vinkel under centrifugeringen, sikrer således, at underlagsmidlet fordeles i det væsentlige jævnt hen over overfladen, så at det helt

DK 153763B

8 forsegler eventuelle mellemrum, som kan fange mikrobielle patogener.

Et sådant arrangement medfører kortere vej for patogenerne, og derfor at en større gennemsnitlig "g"-kraft skal lægges på patogenerne for at fremkalde en mere effektiv koncentreret afsætning af dem, 5 som let kan fjernes fra centrifugeringsbeholderen. Anvendelsen af denne specielt udformede centrifugeringsbeholder medfører yderligere en forøget centrifugeringseffektivitet, idet centrifugeringen kan udføres med mindre g-vaerdier inden for samme tidsrum som ved almindelig centrifugering eller med samme g-værdier på kortere tid 10 end ved sædvanlige metoder.

Ved en foretrukken udførelsesform af opfindelsen kan blodlyserende og andre blodbehandlende midler, der anvendes til at præparere en blodprøve, anbringes i en vandig opløsning inden i centrifugeringsbeholderen i kontakt med det flydende underlagsmiddel. Det flydende 15 underlagsmiddel vil, på grund af sine egenskaber som ovenfor defineret, understøtte en sådan vandig opløsning. Hvis centrifugeringsbeholderen endvidere bliver rystet under oplagring og transport, vil de lyserende eller andre blodbehandlende midler blandes med underlagsmidlet. Når centrifugeringsbeholderen imidlertid udsættes for centri-20 fugering, vil det flydende underlagsmiddel med høj massefylde let fraskilles (sedimenteres) og muliggøre, at blodbehandlingsmidlerne blandes med blodprøven inden i beholderen. Dette er en stor fordel i forhold til de ovenfor beskrevne sædvanlige flydende filtermedier, som indeholder bestanddele, som er uforenelige med nogle af de blodbe-25 handlende midler, og da endvidere sædvanlige flydende filtermedier er baseret på vand, vil de blandes med de på vand baserede blodbehandlingsmidler, hvis de to er i kontakt med hinanden, og forhindre, at de effektivt diffunderer fra hinanden og behandler en blodprøve, som er anbragt inde i beholderen. En foretrukken udførelsesform af 30 fremgangsmåden ifølge opfindelsen går således ud på, at den øverste del af væskeprøven efter centrifugering udtages, uden at det væske-prøvelag, der ligger umiddelbart op til grænsefladen mellem væskeprøven og det ikke-toxiske, flydende middel, forstyrres, således at patogener, der ligger nær ved eller i grænsefladen, ikke udtages, og 35 især går den ud på, at den resterende væskeprøve og det ikke-toxiske, flydende middel blandes før analysen for patogener og derefter analyseres for mikrobielle patogener på i og for sig kendt måde.

i 9

DK 153763 B

Opfindelsen forklares lettere ved studium aftegningen, på hvilken:

Fig. 1 er et tværsnit af den foretrukne centrifugeringsindretning ifølge opfindelsen, og fig. 2-9 illustrerer trinnene i den forbedrede metode til påvisning af 5 mikrobielle patogener under anvendelse af den i fig. 1 afbildede indretning.

I fig. 1 afbildes en foretrukken udførelsesform af den forbedrede centrifugeringsindretning ifølge opfindelsen. Indretningen 20 omfatter en aflang, rørformet centrifugeringsbeholder 22 med et sædvanligt 10 gennemstikkeligt lukkeorgan 24, som tæt kan lukke dens øvre ende, og et hidtil ukendt gennemstikkeligt lukkeorgan 26, som tæt kan lukke dens nedre ende. Når indretningen 20 skal anvendes ved den foretrukne udførelsesform af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning af mikrobielle patogener, kan en effektiv mængde under-15 lagsmiddel 28 og blodbehandlingsmidler 30 anbringes deri. En foretrukken variant af fremgangsmåden ifølge opfindelsen går således ud på, at a) der i en evakueret centrifugeringsbeholder 22 hældes et sterilt, ikke-toxisk, med vand ikke-blandbart, hydrofobt, fluoreret carbon- 3 20 hydrid 28 med en massefylde på mellem ca. 1,2 og 2,0 g/cm , i en mængde svarende til ca. 3,3 - ca. 30,0 volumenprocent, beregnet på rumfanget af blandingen af det fluorerede carbonhydrid og blodprøven, der analyseres for forekomst af mikrobielle patogener, b) blodprøven anbringes på det fluorerede carbonhydrid i den eva-25 kuerede centrifugeringsbeholder 22, c) centrifugeringsbeholderen 22 underkastes centrifugering på en sådan måde, at blodprøven tvinges mod det fluorerede carbonhydrid, hvorved i det væsentlige alle de mikrobielle patogener går ud af suspensionen og opsamles i et lag på det fluorerede carbonhydrid. 1 d) størstedelen af den tilbageværende blodprøve skilles fra det fluorerede carbonhydrid og laget af mikrobielle patogen er,

DK 153763 B

ίο e) laget af mikrobielle patogener blandes med den resterende mindre del af den tilbageværende blodprøve, f) den resulterende blanding og det fluorerede carbonhydrid fjernes fra centrifugeringsbeholderen 22, og 5 g) den resulterende blanding og det fluorerede carbonhydrid analyseres for forekomst af mikrobielle patogener, især ved, at blodprøven lyseres i centrifugeringsbeholderen 22, og navnlig ved, at lysen udføres ved at hælde et lyserende middel ind i centrifugeringsbeholderen 22 og blande blodprøven dermed før centri-10 fugeringen.

Centrifugeringsbeholderen 22 kan fremstilles af siliconovertrukket glas eller hård plast, fx polycarbonat eller polypropylen. Gennemstikkelige lukkeorganer 24 og 26 kan omfatte gummipropper af den selvforseg-lende type. Gennemstikkelige lukkeorganer 24 og 26 er hver forsynet 15 med nedskæringer 24a henholdsvis 26a for at gøre det lettere at injicere med almindelige typer medicinske injektionsnåle. Et evakueret rum 32 holdes ved et tryk, som ligger under atmosfæretryk på en forudbestemt værdi, så at der kan tilføres centrifugeringsbeholderen en kendt mængde væske ved injektion gennem det gennemstikkelige 20 lukkeorgan 24, uden at der opbygges et større tryk i beholderens indre, hvilket ville forårsage, at de gennemstikkelige lukkeorganer 24 og 26 forskydes fra åbningerne i centrifugeringsbeholderen 22.

Med hensyn til især det gennemstikkelige lukkeorgan 26 i den nedre ende af centrifugeringsbeholderen 22 skal det bemærkes, at den indre .25 overflade 34 af det gennemstikkelige lukkeorgan 26 er anbragt i en ikke ret vinkel i forhold til væggene i centrifugeringsbeholderen 22.

Det er særlig foretrukket, at centrifugeringsbeholderen 22 har en bundflade, på hvilken det fluorerede carbonhydrid anbringes, og som er anbragt således, at blodprøven ved centrifugeringen vil blive 30 tvunget imod det fluorerede carbonhydrid og bundoverfladen i en i det væsentlige ret vinkel.

DK 153763B

11

Det skal bemærkes, at indretningen 20 er specielt formgivet til at anvendes i en centrifuge med vinkelrotor, og at vinklen mellem den indre overflade 34 er komplementær med rotorens vinkel. Det skal imidlertid bemærkes, at indretningen ifølge den foreliggende opfindel-5 se kan anvendes i en sædvanlig centrifuge af typen med svingende kurv. I det sidste tilfælde skal overfladen 34 være vinkelret på de lodrette sider af indretningen 20 og i øvrigt anvendes på samme generelle måde, som beskrives nedenfor i forbindelse med den på fig.

1 viste indretning 20. Overfladen 34 skal være glat og i det væsent-10 lige fri for mellemrum og sprækker, i hvilke mikrobielle patogener kan fanges. Endvidere skal det cirkulære lukkeareal rundt om overfladen 34, hvor materialet i det gennemstikkelige lukkeorgan 26 støder op til væggene i centrifugeringsbeholderen 22, være tæt forseglet, så at grænsefladen ikke danner en stor cirkulær sprække, i hvilken mikro-15 bielle patogener kan blive siddende.

Hældningsvinklen mellem den glatte overflade 34 og centrifugeringsbeholderen 22 bestemmes af det centrifugeringsapparatur, i hvilket genstanden 20 skal centrifugeres.

Som ovenfor anført vil overfladen 34 blive anbragt vinkelret på de 20 lodrette sider af indretningen 20, når der anvendes en svingkurvscentrifuge. Hvis der imidlertid anvendes en centrifuge af vinkelrotor-typen, vil overfladen 34 med indretningens lodrette sider danne rotorens komplementærvinkel. Når derfor rotorvinklerne er mellem 60 og 10°, vil vinklen mellem overfladen af det gennemstikkelige lukkeorgan 25 og det indre af centrifugeringsbeholderen generelt tilsvarende være mellem ca. 80 og 30°. Således vil hældningsvinklen, mærket som arc 36, generelt være komplementær med den vinkel, i hvilken indretningen 20 ligger i centrifugen under centrifugeringen. Fx er hældningsvinklen 36 på fig. 1 ca. 34°. Når fx indretningen 20 anbringes i en 30 centrifuge af vin kel rotortypen, i hvilken centrifugeringen sker ved ca. 56°, vil væsker inden i indretningen 20 blive tvunget mod overfladen 34 i en i det væsentlige ret vinkel. En særlig hensigtsmæssig indretning ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at det ene, gennemstikkelige lukkeorgan 26 er en prop, der har en overflade 34, der 35 er anbragt i vinkel 36 med det indre af centrifugeringsbeholderen 22,

DK 153763 B

12 hvilken vinkel 36 er komplementær med den vinkel, i hvilken indretningen 20 centrifugeres, og at der desuden forefindes en effektiv mængde af et ikke-toxisk, lyserende middel i indretningen 20, især er den ejendommelig ved, at vinklen 36 mellem overfladen af den gennem-5 stikkelige prop og det indre af centrifugeringsbeholderen 22 er ca.

90°. Som afbildet pi fig. 1 dannes det gennemstikkelige lukkeorgan 26 af et enkelt stykke gummi. Overfladen 34 kan imidlertid fremkomme ved at anvende en prop af et stof, som støder op til den indre overflade af en almindelig gummiprop som fx det gennemstikkelige lukke-10 organ 24. En sådan prop kan fremstilles af mange forskellige stoffer, som giver en glat overflade og god forsegling med væggen i centrifugeringsbeholderen 22, som er gennemstikkelige, og som er ikke-toxis-ke over for mikrobielle patogener. En metode til fremstilling af en sådan prop er at lave den in situ ved at anvende et materiale, som 15 kan hældes ind i centrifugeringsbeholderen 22, når en almindelig gummiprop, fx det gennemstikkelige lukkeorgan 24, er blevet anbragt i centrifugeringsbeholderens 22 nedre ende. Dette materiale skal være tilstrækkeligt flydende og have lang nok størkningstid til, at centrifugeringsbeholderen 22 kan blive anbragt i den ønskede hældnings-20 vinkel med det resultat, at materialet strømmer ud i den ønskede hældningsvinkel og derefter størkner. Ved størkningen vil materialet danne en glat overflade 34 og god forsegling med væggene i centrifugeringsbeholderen 22. Eksempler på sådanne materialer er almindelige badekar-tætningsmaterialer og siliconbaserede harpikser, som indføres 25 i flydende form med lav viskositet, og som hærder og danner et elastomert materiale. Et eksempel på den sidstnævnte materialetype er en siliconbaseret flydende harpiks, som sælges under handelsnavnet "SYLGARD"® 124 af Dow Corning, Midland, Michigan. Når der anvendes et materiale såsom "SYLGARD"®, er det undertiden tilrådeligt at 30 anvende en primer på den indre væg i centrifugeringsbeholderen 22 for at sikre god forsegling imellem den hærdede "SYLGARD"® og centrifugeringsbeholderens væg 22. En egnet primer sælges under handelsnavnet DC 1200 af Dow Corning. Således kan fx en glat, skrå overflade 34, som på fig. 1 er afbildet som indre overflade af et 35 gennemstikkeligt enhedslukkeorgan 26, fremstilles ved at forbehandle den indre væg i centrifugeringsbehoideren 22 med en egnet siliconbaseret harpiksprimer, fx DC 1200, indsætte en almindelig gummiprop 13

DK 1S3763 B

som den, der er afbildet som det gennemstikkelige lukkeorgan 24, hælde en portion flydende siliconbaseret harpiks såsom "SYLGARD"® 134 i centrifugeringsbeholderen 22, anbringe hele beholderen i den ønskede hældningsvinkel og hærde siliconharpiksen under egnede 5 betingelser til dannelse af en elastomer prop med en glat overflade 34 i den ønskede hældningsvinkel op ad en almindelig gummiprop. Badekar-tætningsmidler og lignende materialer kan, om ønsket, anvendes på samme generelle måde, og den korrekte hældningsvinkel kan dannes ved at centrifugere genstanden indeholdende det ikke-hærdede 10 propdannende materiale i den type centrifuge, i hvilken indretningen skal anvendes.

Når den glatte overflade 34 er blevet dannet, enten ved at anbringe et gennemstikkeligt enhedslukkeorgan 26 eller ved en kombination af en gummiprop og en prop af et materiale som ovenfor beskrevet, kan 15 en effektiv mængde af underlagsmidlet hældes i beholderen 22. Den anvendte mængde underlagsmiddel skal være tilstrækkelig til helt at dække overfladen 34 ved centrifugering, men ikke så stor, at den i betydelig grad begrænser den mængde blod, som indretningen 20 kan rumme. Den anvendte mængde underlagsmiddel vil variere med det 20 pågældende valgte systems parametre, fx udformningen af propperne, rumfanget af det tilbageværende blod og det anvendte underlagsmiddels flygtighed. En foretrukken mængde underlagsmiddel kan udgøre ca. 3,3 - ca. 30,0 volumenprocent, beregnet på rumfanget af blandingen af underlagsmiddel og resterende blodprøve, som udtages fra 25 indretningen 20 og undersøges for tilstedeværelse af mikrobielle patogener.

Det ikke-toxiske, flydende middel med en massefylde, der er større end prøvens, omfatter ifølge den foreliggende opfindelse en hydrofob, med vand ikke-blandbar væske. Det er altså en væske, som ikke 30 bæres af blandingen af blod og blodbehandlende væske eller en hvilken som helst anden væskeprøve, som formodes at indeholde mikrobielle patogener, under centrifugalkraft. Yderligere skal underlagsmidlet være relativt inert over for butylgummi, silicongummi og andre elastomertyper, som anvendes ved fremstillingen af de ovenfor be-35 skrevne gennemstikkelige lukkeorganer. Underlagsmidlets massefylde

DK 153763 B

14 ligger i området mellem ca, 1,2 og ca. 2,0 g/cm3, fortrinsvis mellem ca. 1,6 og ca. 2,0 g/cm3. Der anvendes fluorerede carbonhydrider med de ovenfor angivne data og med molvaegte i området mellem ca.

300 og ca. 850. Endvidere foretrækkes fluorerede carbonhydrider, 5 som har de ovenfor anførte egenskaber, og som vil fordampe med omtrentlig samme hastighed som vand, når en prøve indeholdende underlagsmidlet anbringes på en almindelig kulturplade. Der kan derfor anvendes underlagsmidler med de ovenfor beskrevne egenskaber og med kogepunkter mellem ca. 90 og ca. 210°C, fortrinsvis mellem ca.

10 100 og ca. 140°C. Underlagsmidlet skal også have et damptryk, som ikke river det gen nemsti kkelige lukkeorgan fra røret under fremstillingstrinnene, fx ved autoklavering. Fluorerede carbonhydrider, som sælges under handelsnavnet "FLUORINERT"® af 3M Company of Minneapolis, Minnesota, har vist sig at fungere godt som underlagsmid-15 ler. Især har typerne FC-75, FC-48 og FC-43 af FLUORINERT-serien vist sig at være særlig nyttige. Disse fluorerede carbonhydrider er klare, farveløse, perfluorerede væsker med relativt høj massefylde og lav viskositet. Den væsentligste forskel mellem dem ligger i kogepunkterne. Det er karakteristisk for disse væsker, at deres flydepunkt er 20 meget lavt, i de fleste tilfælde på under -73°C.

Selv om sådanne underlagsmidlers nøjagtige funktion ikke er helt opklaret, antages det, at de forbedrer opsamlingen af de mikrobielle patogener, der er passeret fra suspensionen i en centrifugeret blodprøve, på mindst to måder. For det første tjener underlagsmidlet til 25 at forsegle mellemrum, revner og sprækker både i den glatte overflade 34 af centrifugeringsbeholderen 22 og i grænsefladen mellem væggene i centrifugeringsbeholderen 22 og det gennemstikkelige lukkeorgan 26. Således isoleres mikrobielle patogener, som ellers ville blive fanget i sådanne mellemrum og derfor ikke blive isoleret, sammen med 30 underlagsmidlet 28, når det fjernes fra indretningen 20. For det andet antages det, at underlagsmidlet virker som støddæmper for de mikrobielle patogener, som tvinges ud af suspensionen i en blodprøve under centrifugeringen. Denne dæmpende effekt reducerer faren for beskadigelse af mikrobielle patogener, hvilket ellers kan forekomme 35 ved trykket. Selv om nogle af de mikrobielle patogener faktisk kan trænge ind i underlagsmidlet, vil ingen af dem gå helt igennem det,

DK 153763 B

15 og hovedparten vil blive på dets overflade ved grænsefladen mellem underlagsmidlet 28 og blodprøven og samles i et lag.

Efter anbringelse af underlagsmidlet 28 i centrifugeringsindretningen 20 kan der også deri anbringes vandopløselige behandlingsmidler 30 5 for blodprøven. Sådanne behandlingsmidler kan fx være lyserende midler og/eller antikoagulanter. Ethvert egnet lyseringsmiddel kan anvendes, når blot det ikke er toxisk for mikroorganismer. Et sådant egnet lyseringsmiddel er en vandig opløsning af en ikke-toxisk saponin. Det skal bemærkes, at mange saponiner vides at være toxiske for 10 mikrobielle patogener. Som angivet i USA patentskrift nr. 3.883.425 kendes der imidlertid en metode til fjernelse af toxiske bestanddele fra saponiner, som tidligere blev anset for at være toxiske. Almindeligvis kan det toxiske saponinmateriale afgiftes som beskrevet i USA patentskrift nr. 3.883.425 og det resulterende rensede materiale 15 anvendes ifølge den foreliggende opfindelse. Desuden kan den vandige opløsning af saponin indeholde en antikoagulant og/eller en oxygenfjerner. En foretrukken antikoagulant er fx natriumpolyanetholsulfonat (SPS) eller heparin. Natriumpolyanetholsulfonat foretrækkes, da dette stof ikke kun virker som antikoagulant, men også inhiberer den 20 phagocytiske virkning af granulocyter og monocyter og den normale antibakterielle virkning af blodserum. Det foretrækkes, at denne vandige opløsning af behandlingsmidlet er mindst 1,0 volumenprocent af det totale rumfang i centrifugeringsbeholderen 22, herunder behandlingsopløsningen, væskeprøve og underlagsmiddel, fortrinsvis 25 mellem 7,6 og ca. 17,5 volumenprocent deraf.

Når behandlingsmidlerne 30 er anbragt i centrifugeringsindretningen 20, kan det gennemstikkelige lukkeorgan 24 anbringes, og rummet 32 kan evakueres til det ønskede tryk under atmosfæretryk.

I fig. 2-9 er en analysesekvens afbildet skematisk, hvilken sekvens 30 illustrerer en foretrukken udførelsesform af opfindelsen. En fremgangsmåde, som udføres ifølge en udførelsesform af opfindelsen til påvisning af mikrobielle patogener i en blodprøve, kan fx bekvemt udføres i nedenstående apparatur:

DK 153763 B

16

Den ovenfor beskrevne centrifugeringsindretning 20 indeholdende underlagsmidlet 28 og blodbehandlingsmidler 30. Beholderen kan have et rumfang på 12-14 ml.

En steril glassprøjte og en éngangshypodermkanyle (længde 3,81 cm, 5 ydre diameter 1,7 mm).

En steril glassprøjte og en éngangshypodermkanyle (længde 2,54 cm, ydre diameter 0,81 mm).

En hypodermkanyle (længde 1,59 cm, ydre diameter 0,5 mm) med vat indskudt i muffen (anvendt som lufthul).

10 Tre blodagarplader.

Én chokoladeagarplade.

Én Sabouraud-plade.

Det skal bemærkes, at med undtagelse af centrifugeringsindretningen 20 eller dertil svarende indretninger kan forskellige typer velkendte 15 laboratorieapparaturer og kulturmedier anvendes til at udføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Det skal især bemærkes, at de ovenfor angivne kulturmedier kun er anført som eksempler og generelt foretrækkes til anvendelse ved påvisning af de mest almindeligt kendte mikrobielle patogener. De foreslåede blodagarplader er sædvanligt 20 anvendte blodagarplader på basis af fåreblod og et basenæringsmiddel såsom sukker, som holdes sammen med et agarstørknende middel i en petri-skål. Chokoladeagarpladen er udformet til dyrkning af visse kræsne patogener, fx hemophilus. Sabouraud-pladen er specielt udformet til dyrkning af fungi.

25 Selv om forskellige apparaturer kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan den ovenfor anførte apparatur- og materialeliste bekvemt anvendes ifølge opfindelsen på den nedenfor beskrevne måde:

DK 153763B

17

For at anvende centrifugeringsindretningen 20 vist på fig. 1 i tegningen anbringes den først således, at det gennemstikkelige lukkeorgan 26 med sin glatte, i vinkel anbragte overflade 34 er i den nedre ende af indretningen 20, så at underlagsmidlet 28 og blodbehandlingsvæs-5 ken 30 hviler på den glatte, i vinkel anbragte overflade 34. Det skal bemærkes, at der på fig. 1 og 2 af illustrative grunde er vist to adskilte væskeniveauer, som viser underlagsmidlet 28 og behandlingsvæsken 30. I praksis kan der optræde en ikke-stabil emulsion eller en blanding af disse to væsker på grund af håndtering, så at der ikke 10 altid er to klart adskilte væskelag. Denne ustabile blanding af underlagsmiddel 28 og blodbehandlingsvæske 30 har på ingen måde negativ virkning på den her angivne metode, da adskillelse af de to væsker hurtigt finder sted under centrifugering.

Derefter injiceres en bestemt mængde af en blodprøve 38, som er 15 udtaget fra en patient, fx 7 ml blod, i det evakuerede rum i centrifugeringsindretningen 20 som afbildet i fig. 3 under anvendelse af en almindelig type sprøjte 40. Alternativt kan prøven tages direkte ind i genstanden 20 under anvendelse af en standard-dobbeltkanyleanord-ning forsynet med et sædvanligt vakuum-blodudtagningsorgan, som fx 20 sælges under mærket "VACUTAINER"® af Beckten Dickenson. Dernæst underkastes indretningen 20 indeholdende blodprøven 38, blodbehandlingsvæsken 30 og underlagsmidlet 28 blanding for at sikre, at blod-behandlingsmidlerne 30 blandes fuldstændigt med blodprøven 38. Dette blandingstrin er skematisk vist i fig. 4.

25 Efter at blodprøven 38 er blevet behandlet på denne måde, centrifugeres centrifugeringsindretningen 20 for at få de mikrobielle patogener i den behandlede blodprøve 42 til at gå ud af suspensionen og samles ved grænsefladen til det tunge underlagsmiddel 28 og resten af prøvevæsken. Nogle mikrobielle patogener vil sætte sig på sidevæggen 30 i centrifugeringsbeholderen 22 ved den øverste ende af den glatte overflade 34 ved punkt 22a.

Dette centrifugeringstrin er vist skematisk på fig. 5. Centrifugeringens hastighed og varighed kan variere inden for vide rammer, alt afhængig af konstruktionsmaterialet i centrifugeringsindretningen 20

DK 153763B

18 og centrifugeringsapparaturets type. Centrifugeringen kan bekvemt udføres ved at anvende mellem 1500 og 6000 g, fortrinsvis mellem 1500 og 3000 g, på centrifugeringsindretningen 20 indeholdende den behandlede blodprøve 42 og underlagsmidlet 28. Som illustreret på fig. 5 5 anvendes en centrifuge af vin kel rotortypen, som sætter centrifugeringsindretningen 20 i en vinkel på fx 56° (vist ved arc 43) under centrifugeringen. Hvis en glat, i vinkel anbragt overflade 34 sidder med en vinkel på 34° i forhold til den indre væg i centrifugerings-indretningen 20, vil den behandlede blodprøve 42 og underlagsmidlet 10 28 blive tvunget mod den glatte, i vinkel anbragte overflade 34 i en relativt ret vinkel under centrifugeringen. Det skal bemærkes, at når der anvendes en svingkurvscentrifuge, vil centrifugeringsindretningen 20 blive centrifugeret i i det væsentlige en vinkel på 0° i forhold til den horisontale overflade. I et sådant tilfælde vil vinklen 15 af overfladen 34 være ca. 90°, og et gennemstikkeligt gummilukkeor-gan med flad indre overflade kan anvendes i stedet for et gennemstikkeligt lukkeorgan 26.

Efter endt centrifugering kan centrifugeringsindretningen 20 fjernes fra centrifugen, og størstedelen af den behandlede blodprøve 42, 20 hvorfra mikrobielle patogener er fraskilt, kan fjernes. Det skal bemærkes, at i nærværende beskrivelse betegner udtrykket "tilbageværende behandlet blod" eller "tilbageværende blod" en blodprøve, som er blevet centrifugeret således, at de deri tilstedeværende mikrobielle patogener er blevet samlet ved bunden af prøven, hvorved den "til-25 bageværende" del af prøven bliver tilbage, i det væsentlige fri for mikrobielle patogener. Dette trin er illustreret i fig. 6. For at lette fjernelsen injiceres fx en udluftet kanyle 44 i form af en almindelig hypodermkanyle med vat i muffen gennem det gennemstikkelige lukkeorgan 24. En anden hypodermkanyle med sprøjte 45 fastgjort dertil 30 kan derefter injiceres gennem det gennemstikkelige lukkeorgan 26 for at fjerne størstedelen af den tilbageværende behandlede blodprøve 42, fra hvilken mikrobielle patogener er fraskilt. Når fx centrifugeringsbeholderen har et rumfang på 12-14 ml, kan der anvendes en kanyle (længde 3,81 cm, ydre diameter 1,27 mm) for at fjerne alt på nær ca.

35 1,3 - ca. 1,7 ml af den behandlede blodprøve 42. Som vist foretræk kes det, at den overvejende del af den tilbageværende blodprøve

DK 153763 B

19 udtages fra det indre af centrifugeringsbeholderen 22 ved et punkt, som sidder over for den sidevæg, som støder op til den øvre skrå ende af den glatte overflade 34 for at undgå at forstyrre det lag af mikrobielle patogener, som er dannet på og i grænsefladen mellem de 5 to væsker og på sidevæggen af centrifugeringsbeholderen 22 ved den øvre ende af den skrå glatte overflade 34. Størstedelen af det tilbageværende blod fjernes i dette trin, men en lille del af det tilbageværende blod skal efterlades i centrifugeringsbeholderen 22, så at underlagsmidlet udgør mellem ca. 4,7 og ca. 28,6 volumenprocent af 10 den totale mængde tilbageværende væske. Det foretrækkes, at ikke mere end ca. 20 volumenprocent skal udgøres af underlagsmidlet, da større mængder af underlagsmidlet kan have ødelæggende indvirkning på morfologien i mikrobielle patogenkolonier i påfølgende patogenvæksttrin, som anvendes ved fremgangsmåden.

15 Når den største del af den behandlede tilbageværende blodprøve er blevet fjernet, kan begge nåle trækkes ud af de gennemstikkelige lukkeorganer 24 og 26, og centrifugeringsindretningen 20 underkastes derefter et andet blandingstrin, som er afbildet skematisk i fig. 7.

Om ønsket kan imidlertid den udluftede kanyle 44 blive i sin stilling 20 gennem det gennemstikkelige lukkeorgan 24 for at hjælpe ved fjernelsen af den patogenholdige væske ved et senere trin. Det andet blandingstrin tjener til at resuspendere mikrobielle patogener, som er blevet skilt fra den største del af den tilbageværende blodprøve 42, og som har dannet det ovenfor beskrevne lag. Resuspension af de 25 mikrobielle patogener, der er opsamlet, i den tilbageværende mindste del af den tilbageværende behandlede blodprøve 42 sikrer større og mere ensartet udvinding.

Når de mikrobielle patogener er blevet resuspenderet i blandingstrinnet i den mindste del af den tilbageværende behandlede blodprøve 42, 30 kan blandingen af mikrobielle patogener i den tilbageværende behandlede blodprøve og det tunge underlagsmiddel fjernes fra centrifugeringsindretningen 20. Dette trin er afbildet på fig. 8. Som ovenfor anført kan, om ønsket, den udluftede hypodermkanyle 44 være stukket igennem det gennemstikkelige lukkeorgan 24 for at muliggøre 35 lettere fjernelse af de tilbageværende bestanddele. Sprøjten 46 med

DK 153763 B

20 dertil fastgjort hypodermkanyle kan derefter injiceres gennem det gennemstikkelige lukkeorgan 26 for at udtage blandingen 48 af underlagsmiddel 28, mindste tilbageværende andel af tilbageværende blodprøve 42 og de deri forekommende mikrobielle patogener. Det skal 5 bemærkes, at der kan opnås særlig god udvinding, hvis den hypodermkanyle, som anvendes til at fjerne disse bestanddele, injiceres i den nedre ende af den i vinkel anbragte glatte overflade 34. Det antages, at vinklen af overfladen 34 delvis virker som en tragt, ind i hvilken den tilbageværende væske indeholdende de mikrobielle pato-10 gener strømmer. Blandingen 48 af det tunge flydende underlagsmiddel 28 og den tilbageværende mindste del af den tilbageværende behandlede blodprøve 42 med de udvundne mikrobielle patogener skal være 1-1,5 ml væske. Denne væske fordeles derefter på bakterievækstmedier. Dette trin er illustreret skematisk i fig. 9. Med det ovenfor 15 beskrevne apparatur kan materialet fordeles på følgende måde:

En blodagarplade kan tilføres 0,3 ml af blandingen, og pladen kan inkuberes ved 36°C i aerob atmosfære. To blodagarplader kan tilføres 0,3 ml af den vandige opløsning og kan inkuberes ved 36°C i anaerobe omgivelser. En chokoladeagarplade kan tilføres 0,3 ml af den 20 vandige opløsning og kan inkuberes ved 36°C i en lysbeholder. Sa-bouraud-pladen kan tilføres 0,3 ml af blandingen og kan inkuberes ved 25°C i aerobe omgivelser. Vækstmedierne skal efterses daglig for tilstedeværelse af kolonier. Der kan anvendes mikroskopisk analyseteknik. Antallet af mikrobielle patogener i 1 ml af blodet kan bestem-25 mes ved at multiplicere antallet af kolonier med en korrektionsfaktor.

Denne korrektionsfaktor tager hensyn til udvindingsgraden for en given organisme, blodrumfanget og det anvendte underlagsmiddel med høj massefylde og mængden af den endelige blanding på pladen. I det ovenfor givne generelle eksempel er korrektionsfaktoren 1,4. 1 2 3 4 5 6

Det skal igen påpeges, at de nøjagtige fremgangsmådetrin, genstande 2 og udstyr samt anvendte kulturmedier, som ovenfor detaljeret er be 3 skrevet, kan varieres efter ønske. Fx kan et hvilket som helst kendt 4 organ anvendes til at blande blodprøven med det antikoagulerende 5 og/eller lyserende middel. Endvidere kan trinnet med fjernelse af den 6 overvejende del af blodprøven 42, afbildet i fig. 6, i nogle tilfælde

DK 153763 B

21 elimineres helt, og kun en mindre del af blodprøven 42 indeholdende resuspenderede mikrobielle patogener udtages fra bunden af centrifugeringsindretningen 20 sammen med underlagsmidlet med høj massefylde 28 som afbildet i fig. 8. Forskellige andre modifikationer kan 5 anvendes ved fremgangsmåden efter ønske.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempel, som ikke skal anses for begrænsende for omfanget:

EKSEMPEL

Dette eksempel udføres for at etablere sammenligningsdata med hensyn 10 til den procentvise udvinding af mikrobielle patogener fra blodprøver, når der anvendes den flydende filtermediumteknik, der er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.928.139, sammenlignet med udvinding af mikrobielle patogener, der er vundet ved anvendelse af underlagsmiddelteknikken ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

15 De i dette eksempel anvendte teknikker er identificeret i tabel I som enten "flydende filtermedium" eller "underlagsmiddel". De i parenteserne lige under identifikationen af teknikken givne oplysninger angiver det anvendte flydende filtermedium (fx 50% saccharose) i de flydende filtermedium-forsøg og det anvendte underlagsmiddel (fx 20 "FLUORINERT"® FC-48) i underlagsmiddel-forsøgene. Hver undersøgt prøve (1-21 i tabel I) er fremstillet ud fra 7 ml's prøver af sterilt lyseret blod fra sunde bloddonorer, hvorhos hver prøve podes med 0,3 ml af forskellige kendte koncentrationer af et humant patogen (enten Escherichia coli eller Candida albicans som angivet i tabel I). 1 2 3 4 5 6 I hvert af de udførte forsøg anvendes en centrifugereringsindretning 2 20 som vist og beskrevet ovenfor, hvad enten der anvendes den 3 flydende filtermedium-teknik eller underlagsmiddel-teknikken. Med 4 henblik på at undersøge virkningen af at anvende en overflade an 5 bragt i en i det væsentlige komplementær vinkel med den vinkel, i 6 hvilken indretningen 20 centrifugeres, er der til nogle af indretningerne 20 anvendt gummipropper med flad, glat indre overflade, så

DK 153763 B

22 at den indre overflade i bundproppen er horisontal med jordoverfladen, når indretningen 20 står lodret. Disse bundpropper er identificeret som "horisontal" i tabel I. Der anvendes tillige specielt fremstillede bund-lukkeorganer, der er fremstillet ved anvendelse af sædvan-5 lige gummipropper sammen med enten almindeligt badekar-tættemiddel eller en siliconbaseret harpiks markedsført under handelsnavnet "SYLGARD"® 134 af Dow Corning, Midland, Michigan, så at der fremstilles en bundoverflade i indretningen 20, som i forhold til væggene danner en vinkel, som i det væsentlige er komplementær med den 10 vinkel, i hvilken indretningen 20 centrifugeres. Prøver undersøgt under anvendelse af centrifugeringsindretninger med i vinkel anbragt bundprop identificeres i tabel I, og det anvendte materiale (enten badekar-tættemiddel eller "SYLGARD"®) til fremstilling af den i vinkel anbragte overflade er også angivet. De centrifugeringer, der udføres 15 i forbindelse med hver af de i tabel I angivne prøver under anvendelse af en i vinkel anbragt bundprop er udført i en vin kel rotorcentrifuge, i hvilken centrifugeringsvinklen er ca. 56°. Således har de centrifugeringsindretninger med i vinkel anbragte bundprøver (med vinkler på ca. 34°) en bundflade, der i det væsentlige er vinkelret 20 på centrifugalkraftens retning. Endvidere centrifugeres de prøver, til hvilke der anvendes en horisontal bundprop (som angivet i tabel I) i en centrifuge af typen med svingende kurv, som under drift bevirker, at centrifugeringsindretningen 20 slynges i et plan, der i det væsentlige er parallelt med jordoverfladen. Således udøves centri-25 fugalkraften i en retning, som i det væsentlige er vinkelret på overfladen af de horisontale bundpropper.

Når der anvendes teknikken med det flydende filtermedium, indeholder hver af indretningerne 20 1,2 ml af en vandig opløsning indeholdende 1,5 vægtprocent gelatine og den i tabel I angivne vægtkoncen-30 tration af saccharose. Hver af indretningerne 20 vendes om og afkøles til 4°C i omvendt stilling, før den podede blodprøve tilsættes. Efter at der i hver af indretningerne 20 er hældt den nødvendige mængde blodprøve indeholdende den kendte mængde humant patogen, anbringes den i et vandbad, medens den stadig er omvendt. Vandbadet 35 sættes til 42°C, og gelatinen lades smelte. Hvert glas centrifugeres derefter i en vinkel på ca. 56° i en rotorcentrifuge. Centrifugeringen foretages i en periode på 30 minutter og udføres med en relativ centrifugalkraft på 1500 eller 3000 g som angivet i tabel I.

DK 153763 B

23 På dette trin i fremgangsmåden, som anvendes i forbindelse med nogle af prøverne (herefter betegnet "prodecuren med tre indledende trin"), indsættes en 10 ml's sprøjte gennem bundproppen for at fjerne ca. 6,7 ml af den tilbageværende blodprøve. Derefter underkastes 5 centrifugeringsindretningen 20 blanding i en Vortex-mixer i ca. 1/2-2 minutter. Efter blandingstrinnet fjernes 1,5 ml af det blandede filtermedium og den del af blodprøven, som er tilbage i indretningen 20, med en almindelig sprøjte med påsat kanyle. Ved andre prøver anvendes ikke det trin til fjernelse af den overvejende del af den resteren-10 de blodprøve efter centrifugeringen. I dette tilfælde udtages 1,5 ml flydende filtermedium og blodprøve ved bundproppen fra bunden af centrifugeringsindretningen 20 lige efter centrifugeringen. De 1,5 ml, bestående af en blanding af flydende filtermedium og tilbageværende blodprøve samt de samlede mikrobielle patogener, blandes efter udtag-15 ning fra indretningen 20 for at få en relativt jævn fordeling af komponenterne ved udstrygning af prøverne på plader. Forskellen i disse to procedurer er angivet i tabel I under betegnelsen "antal indledende trin", hvilket angiver, om den pågældende prøve ifølge proceduren har enten ét eller to indledende trin. I tilfælde af tre indledende 20 trin, er det første indledende trin injektion af blodprøven, det andet indledende trin er fjernelse af den overvejende del af blodprøven efter centrifugering, men før blanding, og det tredje indledende trin er fjernelse af tilbageværende flydende filtermedim og den tilbageværende del af blodprøven. I procedurerne med to indledende trin er 25 det første indledende trin injektion af blodprøven i indretningen 20 og det andet indledende trin udtagning fra bunden af centrifugeringsindretningen 20 af ca. 1,5 ml blandet flydende filtermedium og blodprøve.

I begge tilfælde, hvad enten der anvendes to eller tre indledende 30 trin, udstryges fem prøver indeholdende 0,3 ml fra hver af de 1,5 ml's portioner, der udtages fra bunden af indretningen 20, på fem forskellige plader. Efter inkubering sammenlignes disse prøver med kontrolplader, der er fremstillet ved at sætte den samme kendte mængde mikrobielle patogener, som blev injiceret i de afprøvne blod-35 prøver, til en saltopløsning og udstryge 0,3 ml af denne saltopløsning på hver af fem agarplader. Den procentvise udvinding baseret på sammenligning af prøvepladerne og kontrolpladerne er angivet i tabel I.

DK 153763 B

24

Den procedure, der anvendes til hver blodprøve, der undersøges under anvendelse af underlagsmiddelteknikken, er følgende:

En centrifugeringsindretning 20 fremstilles under anvendelse af enten en horisontal eller en i vinkel anbragt bundprop som ovenfor beskre-5 vet. Hver centrifugeringsindretning 20, som anvendes i underlagsmiddelproceduren, indeholder 0,3 ml "FLUORINERT"® FC-48. 7 ml lyseret blod, som er forurenet med et kendt antal mikrobielle patogener, injiceres derefter gennem den øverste prop i indretningen 20. Det næste trin er at centrifugere hver af indretningerne 20 i samme 10 vin kel rotorcentrifuge, som anvendes ved den flydende filtermedium- teknik. Centrifugeringstiden er 30 minutter, og den relative centrifugalkraft, som pålægges, er enten 1500 g eller 3000 g, som anført i tabel I. Når der anvendes proceduren med tre indledende trin, udtages ca. 5,8 ml af den tilbageværende blodprøve ved at føre en 10 15 ml's sprøjte igennem bundproppen. Når der anvendes et system med to indledende trin, foretages en sådan udtagning ikke. I hvert tilfælde udtages 1,5 ml, indeholdende ca. 1,2 ml tilbageværende blodprøve og ca. 0,3 ml "FLUORINERT"®, fra bunden af centrifugeringsindretningen 20. Fem prøveplader fremstilles derefter under anvendelse af 20 0,3 ml af blandingen af tilbageværende blodprøve og "FLUORINERT"® i hvert tilfælde. Disse prøveplader inkuberes og sammenlignes derefter med kontrolplader, som er fremstillet på samme måde som beskrevet ovenfor i forbindelse med den flydende filtermediumteknik. Den procentvise udvinding under anvendelse af underlagsmiddelteknikken 25 beregnes derefter og er angivet i tabel I.

Selv om der ikke kan opstilles nogen nøjagtig teori for at forklare de 1 dette forsøg vundne data, kan den lave udvindingsgrad i prøve nr.

2 i tabel I (hvor der anvendes den flydende filtermediumteknik med 50% saccharose og en horisontal bundprop) være et resultat af, at 30 mikrobielle patogener bliver fanget langs den indre kant af den horisontale bundprop ved væggen i centrifugeringsindretningen 20. Ved sammenligning af resultaterne af prøve nr. 1 med resultaterne af prøve nr. 3, som også er udført under anvendelse af den flydende filtermediumteknik og en horisontal prop, men som er udført under 35 anvendelse af proceduren med tre indledende trin, ses det, at udvindingsgraden i prøve nr. 3 er forbedret betydeligt. Dette kan forkla-

DK 153763 B

25 res ved, at fordi der anvendes mindre relativ centrifugalkraft, bliver de mikrobielle patogener ikke pakket så tæt i sprækken mellem bundproppen og væggene i indretningen 20. Proceduren med tre indledende trin muliggør endvidere udvinding af alle mikrobielle patogener, 5 som er blevet resuspenderet i den tilbageværende portion af blodprøven. Når der anvendes proceduren med to indledende trin, kan nogle af de resuspenderede mikrobielle patogener blive tilbage i en resterende del af blodprøven.

Ved sammenligning af prøve nr. 15 med prøve nr. 17 ses de forbed-10 rede resultater, som fås, når der anvendes underlagsmiddelteknikken ifølge den foreliggende opfindelse. I prøve nr. 15, som i prøve nr.

17, anvendes en horisontal bundprop, antallet af indledende trin er 3, og den relative centrifugalkraft er den samme som i prøve nr. 17 (3000). Det antages, at de opnåede forbedrede resultater ved anven-15 delse af underlagsmiddelteknikken kommer af anvendelsen af underlagsmidlet, som ikke tillader mikrobielle patogener at gå igennem og blive tabt ved grænsefladen mellem væggene i indretningen 20 og bundproppen.

Sammenligning af prøve nr. 9 med prøve nr. 11 viser yderligere de 20 fordele, der fås ved at anvende en i vinkel anbragt prop i sammenligning med en horisontal bundprop. Da betingelserne og teknikken i prøve nr. 9 og 11 er helt identiske, med den undtagelse, at der i prøve nr. 11 anvendes en vinkelprop, kan den forbedrede udvindingsgrad i prøve nr. 11 i forhold til prøve nr. 9 kun skyldes an-25 vendeisen af en vinkelbundprop, der er anbragt i en sådan vinkel i forhold til væggene i indretningen 20, som er komplementær med den vinkel, i hvilken indretningen 20 centrifugeres. En sammenligning mellem prøve nr. 10 og prøve nr. 12 viser på lignende måde de overlegne resultater, der fås ved anvendelse af en vinkelbundprop 30 ved højere relativ centrifugalkraft (3000).

O' 26

DK 153763 B

•5 ir <N

fOiHin^^rroin^r^ *

C·-» ^ HrH +l *-*HCMco«>r'VD

> +1 +· +· +· +· +1 +1 +i m +! . w H

'O * ^"· +1 +1 +1 +1 4-1 4-| j3ininomominoHo\ ^ + \οιησ»νοσ'<Λνοο'οο® ®οοοοο»ηΜθο dP ^ ® ^ 'f m m o 4J I *44 c « 0) n O*

fH

> <0 •HO'OOOOOooOOq 4JD000000000cj?000do0 55ί2£2£20ιηο,0ο500©οοο Η -H HrOHCOiHcOrHmrHm^Oinooin© G) £ ^^^cnfOHfn

G

•H

I P «0 -P

c -Η β) -0 ιΗβΟ>{ΝΓ0ΝΓ0<η<ΜΓ4Γ0ί*ΐ 00 ^ cg cm η m η C Φ rtj rH ^ λ & α p o

p P

o, cu dddddHH,~IH«H 1 * njnJnjiOnj« s = η h r4 r-i 0 CggCgccccc 4J 5 Jj jj P O O O O O o O O O o Φ <d Q) (fl fi Ceee ft cnwM M WcnrøuiWrø« 0»^! tro o o o o

Η Ό T1 d f T1 T4 -« Ή -Η -H 5 Chchm m n g S

C PP£.&£PPPPpd>i-H>i-rt-H.555 rH S O O O o O o O O O o >W>WPp^dd 0) » =Ooooo

•8 jg O O O

E4 ε I s g - g ε O OOOOp ^ ^ ^ SEbss

•H 1-1 tH *H -H tH CO 00 CO ^-3 3 5 S

-O -C -O -O Ό Ό ir 'T -i 2 — 00 -H 5 5 5 CT

2 £ S e c ! 1 I 7 Ύ 00 rr Ό -O io 5 2

B9E»E-«g-36-«E^grtSwgrti T ώS-i_l~! A

5958585859<w°,°s ^ -o« »S- «Se^eSeSSSSS'S^

•K i-|(di-lldi-lld-Hf0*HldiHld*Hp*H54'*r|p.f4'H,0‘*J,o*J,"*^'',,IP'HPHP,O4J

C o ϋ O ϋ ϋ ϋδβηβΒδδϊΙδεΟ^ί^Λ^ΐΗΛΕο Μ ΦϋΦΟΦΟΕΟΕϋΕϋ 0'5 0>·Η tJ»5 2,5 2° ®. G 0 0 O Om«

® «Οβ-Οιβ'ΟΦ'Ο-Φ'ΟΦ'σφιβΡΛΡ fl 13 m Ti ίτ1 β>000<1)00ϋ 01H

φ <d tu 0) 5 S w3PoT38i2T4O7'oce>cwPWCWr-io ^#-0^-0^-0^-0^-0^0)3 0,3^5^5¾3^30 ° ® φ p 3 >1© >1© 5>io sL« Sr.2i φ «η φι-{>ο#ό#,ο#ό# φη Η in Η S Η S jS 51° b° 'Ofii'Ofci-Oh-Oft-Oft'Oft >iO >iO >,0 -O £ 144 V—.(1J vlu^, —S £ s cjs £ S (!: HinHinHinrHlO C;

•H

4J oSSSsssssssrCs*** -Η O id

© O

'H C flS -H

•Ο Φ Η Λ

p ο» Λ H

POO id M Ή

Sfta}"“SsssssssB'osBBs j3 i-i O -0

m G

W « u 0 >

DK 153763 B

27

VD H

Ό· H

+« +1 +1 o σι o Ή σ\ σν η o σι o o o o o o o o mom o .H ro r-) co ro ro ro ro

Έ *E I I II

0 O <U 10 0) 10 d k *d ε ό ε ft an 10 H Μ 1 i Λ O' Λ t n

ε r ·— c *— C

4J Ό Ό *H *H

fC H ft H ft H C Ή C

w ti « li « φ ^ φ φ ^ φ

+) ^ Ι31Λ cn^i «ΗΛ (HH

U CrHCHC4JfflC+J(0 0 Ι/ΙιΗΉ ffl-rl «Η >C0>W>dd>dd ε ε (Od) (0 11) Η τΗ'-'-Η'-'-Η,Μ-Ρ'Η,ν-Ρ Η Ο) ,0 <-* *-» <-* π} α οο οο οο Εη τγ ’τ ^r

III I

υ υ υ u ιΗ {i| ιΗ 1¾ t-i pn ιΗ fti

<U fl) 0) (U

Όε Ό = Ό = Os Ό -ΡΌ ·ΜΌ 4J Ό +> ft ft r| ft r| ft -H d ΕΦΕΦΕΦ ΕΦ w d tn d tn d ud Ο'-Η&'ιΗΟι-τΗ f0 d ifl d <0 d <0 d rHOHOHO iH 0 d d d d d d d d

ΦΗ ΦΗ Q)rl tt) pH

Ό h Ό fa Ό h Oh d = d r d: d = d-'d'-'d·^ d'-' tn

G

(0 o •Η ε - s Λ «Η ni (0 *0

•H

Ό s ε ε

C

rd u

οο σ o H

Claims (23)

1. Fremgangsmåde til påvisning af mikrobielle patogener, som formodes at forekomme i en væskeprøve, fortrinsvis til diagnosticering af sepsis, ved centrifugering af en afgrænset steril zone indeholdende 5 denne væskeprøve, hvilken centrifugering udføres i nærværelse af et ikke-toxisk, flydende middel med en massefylde, der er større end væskeprøvens, hvorved i det væsentlige alle de mikrobielle patogener går ud af væskeprøven, kendetegnet ved, at det ikke-toxiske, flydende middel er 10 et med vand ikke-blandbart, hydrofobt, fluoreret carbonhydrid med en molekylvægt i området mellem ca. 300 og ca. 850 og en massefylde 3 på mellem ca. 1,2 og ca. 2,0 g/cm , og at de mikrobielle patogener ved centrifugeringen tvinges enten ind i det ikke-toxiske, flydende middel, men ikke igennem det, hvorved størstedelen af patogenerne 15 koncentreres i det ikke-toxiske, flydende middel, eller til grænsefladen mellem det ikke-toxiske, flydende middel og væskeprøven, hvorefter patogenerne i det flydende middel i en ringe mængde af væskeprøven, der ligger op til grænsefladen mellem det flydende middel og væskeprøven, skilles fra den øverste del af væskeprøven, og de 20 således opsamlede patogener analyseres på i og for sig kendt måde.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det fluorerede carbonhydrid forekommer i en mængde, der svarer til ca. 3,3 - ca. 30,0 volumenprocent, beregnet på rumfanget af blandingen af det fluorerede carbonhydrid 25 og den fraskilte væskeprøve med de mikrobielle patogener.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det fluorerede carbonhydrid har en massefylde på mellem ca. 1,6 og ca. 2,0 g/cm3 og et kogepunkt på mellem ca. 90 og ca. 210°C.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den øverste del af væskeprøven efter centrifugering udtages, uden at det væskeprøvelag, der ligger umiddelbart op til grænsefladen mellem væskeprøven og det fluorerede DK 153763B carbonhydrid forstyrres, således at patogener, der ligger nær ved eller i grænsefladen, ikke udtages.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den resterende væskeprøve og det 5 fluorerede carbonhydrid blandes før analysen for patogener og derefter analyseres for mikrobielle patogener på i og for sig kendt måde.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5 til påvisning af mikrobielle patogener i en lyseret blodprøve, som formodes at indeholde suspenderede mikrobielle patogener og anti-patogene fakto- 10 rer, kendetegnet ved, at a) der i en evakueret centrifugeringsbeholder (22) hældes et sterilt, ikke-toxisk, med vand ikke-blandbart, hydrofobt, fluoreret carbon-hydrid (28) med en massefylde på mellem ca. 1,2 og ca. 2,0 g/cm , i 15 en mængde svarende til ca. 3,3 - ca. 30,0 volumenprocent, beregnet på rumfanget af blandingen af det fluorerede carbonhydrid og blodprøven, der analyseres for forekomst af mikrobielle patogener, b) blodprøven anbringes på det fluorerede carbonhydrid i den evakuerede centrifugeringsbeholder (22), 20 c) centrifugeringsbeholderen (22) underkastes centrifugering på en sådan måde, at blodprøven tvinges mod det fluorerede carbonhydrid, hvorved i det væsentlige alle de mikrobielle patogener går ud af suspensionen og opsamles i et lag på det fluorerede carbonhydrid, d) størstedelen af den tilbageværende blodprøve skilles fra det fluo-25 rerede carbonhydrid, og laget af mikrobielle patogener, e) laget af mikrobielle patogener blandes med den resterende mindre del af den tilbageværende blodprøve, f) den resulterende blanding og det fluorerede carbonhydrid fjernes fra centrifugeringsbeholderen (22), og DK 153763 B g) den resulterende blanding og det fluorerede carbonhydrid analyseres for forekomst af mikrobielle patogener.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegn et ved, at blodprøven lyseres i centrifugerings-5 beholderen (22).

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at lysen udføres ved at hælde et lyserende middel ind i centrifugeringsbeholderen (22) og blande blodprøven dermed før centrifugeringen.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at centrifugeringsbeholderen (22) har en bundflade, på hvilken det fluorerede carbonhydrid anbringes, og som er anbragt således, at blodprøven ved centrifugeringen vil blive tvunget imod det fluorerede carbonhydrid og bundoverfladen i en i T5 det væsentlige ret vinkel.

10. Indretning (20) til brug ved fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9 til påvisning af mikrobielle patogener, som formodes at forekomme i en væskeprøve, hvilken indretning (20) omfatter en lukket centrifugeringsbeholder (22), der kan lukkes tæt med 20 gennemstikkelige lukkeorganer (24, 26), og hvis indre omfatter et evakueret rum (32), der holdes ved et tryk, som ligger under atmosfæretryk, tilgrænsende et ikke-toxisk, flydende middel (28) med en massefylde, der er større end væskeprøvens, kendetegnet ved, at det ikke-toxiske, flydende middel er 25 et med vand ikke-blandbart hydrofobt fluoreret carbonhydrid med en molekylvægt i området mellem ca. 300 og ca. 850 og med en massefylde på mellem ca. 1,2 og ca. 2,0 g/cm .

11. Indretning (20) ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det ikke-toxiske, fluorerede carbon-30 hydrid (28) forekommer i en mængde, som svarer til ca. 3,3 - ca. 30,0 volumenprocent, beregnet på rumfanget af blandingen af det ikke-toxiske, fluorerede carbonhydrid og den fraskilte væskeprøve med de mikrobielle patogener. DK 153763 B

12. Indretning (20) ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det ikke-toxiske, fluorerede carbon-hydrid (28) forekommer i en mængde, der svarer til ca. 4,7 - ca. 28,6 volumenprocent, beregnet på rumfanget af blandingen af det 5 ikke-toxiske, fluorerede carbonhydrid og den fraskilte væskeprøve med mikrobielle patogener.

13. Indretning (20) ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12, kendetegnet ved, at det ikke-toxiske, fluorerede carbonhydrid omfatter et inert, flydende, fluoreret carbonhydrid med en 10 massefylde på mellem ca. 1,6 og ca. 2,0 g/cm3.

14. Indretning (20) ifølge krav 13, kendetegnet ved, at det fluorerede carbonhydrid har et kogepunkt på mellem ca. 90 og ca. 210°C.

15. Indretning (20) ifølge et hvilket som helst af kravene 10-14 til 15 koncentrering af mikrobielle patogener i en blodprøve, kendetegnet ved, at det ene, gennemstikkelige lukkeorgan (26) er en prop, der har en overflade (34), der er anbragt i vinkel (36) med det indre af centrifugeringsbeholderen (22), hvilken vinkel (36) er komplementær med den vinkel, i hvilken indretningen (20) 20 centrifugeres, og at der desuden forefindes en effektiv mængde af et ikke-toxisk, lyserende middel i indretningen (20).

16. Indretning (20) ifølge krav 15, kendetegnet ved, at vinklen (36) mellem overfladen af den gennemstikkelige prop og det indre af centrifugeringsbeholderen (22) 25 er mellem ca. 30 og ca. 80°.

17. Indretning (20) ifølge krav 16, kendetegnet ved, at vinklen (36) er 34°.

18. Indretning (20) ifølge krav 15, kendetegnet ved, at vinklen (36) mellem overfladen af den 30 gennemstikkelige prop og det indre af centrifugeringsbeholderen (22) er ca. 90°. DK 153763 B

19. Indretning (20) ifølge et hvilket som helst af kravene 10-14, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter en effektiv mængde blodbehandlingsmidler (30), som kan være lyserende midler, antrkoagulanter eller blandinger deraf.

20. Indretning (20) ifølge krav 19, kendetegnet ved, at behandlingsmidlerne (30) forekommer i en mængde, som svarer til mindst 1 volumenprocent, beregnet på rumfanget af behandlingsmidler, blodprøve og fluoreret carbonhydrid (28).

21. Indretning (20) ifølge krav 20, ke n detegnet ved, at behandlingsmidlerne (30) forekommer i en mængde, som svarer til ca. 7,6 - ca. 17,5 volumenprocent.

22. Indretning (20) ifølge et hvilket som helst af kravene 19-21, kendetegnet ved, at behandlingsmidlet (30) omfatter en 15 afgiftet saponin.

23. Indretning (20) ifølge krav 22, kendetegnet ved, at behandlingsmidlet (30) omfatter natri umpolyanetholsulfonat.