NO150521B - Fremgangsmaate ved paavisning av patogene mikroorganismer i en vaeskeproeve, samt anordning for anvendelse ved fremgangsmaaten - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved påvisning av patogene mikroorganismer i en væskeprøve, hvori væskeprøven plasseres innenfor en avgrenset steril sentrifugeringssone og sentrifugeres for derved å tvinge væske-

prøven mot et flytende medium som er ikke-toksisk for de patogene mikroorganismer og har en større densitet enn væskeprøven, og mottas av dette medium, og væskemediet og de patogene mikroorganismer deretter separeres fra sentrifugeringssonen og analyseres med hensyn på disse patogene mikroorganismer, og en anordning for utøvelse av fremgangsmåten .

Blodforgiftning, som er forekomsten av patogene mikroorganismer

i blodet, er en av de alvorligste infeksjonstyper som finnes. Selv om moderne medisin har gitt en rekke antibiotika og sopp-droger, er dødelighetsforholdet ved blodforgiftning rundt 25%. Dertil øker dødelighetsforholdet til over 60 % når blodforgiftning føl-ges av sjokk. Svekkende sykdommer, store kirurgiske inngrep, administrering av immuno-suppressive droger eller anti-kreft-medisin forårsaker at pasienter blir særlig tilbøyelig til blodforgiftning.

Tidlig administrering av riktig antibiotisk terapi er viktig

ved bekjempelse av blodforgiftning. Følgelig er det avgjørende at legen vet så hurtig som mulig ikke bare om pasienten har blodforgiftning, men også typen .iav forstyrrende mikroorganismer og

ømfintligheten av mikroorganismene overfor antibiotiske midler.

Således avhenger riktig og tidsnok diagnose av blodforgiftning

av meget rask og effektiv kvantitativ analyse av pasientens blod. Videre er det avgjørende under den kvantitative analyse av pasientens blod at blodprøven ikke sammenblandes med patogener fra laboratorieomgivelsene.

Tre analytiske systemer har blitt nyttet konvensjonelt for å be-stemme tilstedeværelsen av mikroorganismer i en kroppsvæske. Disse konvensjonelle systemene omfatter den flytende brygg-kultur-teknikk, den såkalte helle-plate-metoden og filtreringsmetoden som anvender et fast matrisefilter. Hvert av disse systemene har sine svakheter og ingen av systemene gir rask påvisning av mikroorganismer i en blodprøve. Generelt er den flytende brygg-metoden ikke kvantitativ, og helle-plate-metoden og filtreringsmetoden (ved bruk av et fast matrisefilter) er åpne systemer som er gjenstand for forurensninger utenifra, dvs. innføring av patogener i kulturen fra laboratorieatmosfære og personell.

Nylig er en forbedret fremgangsmåte og apparatur utviklet for påvisning av nærvær av mikrobiologiske organismer i en kroppsvæske, inn-befattende f.eks. blod. Denne metoden er beskrevet i US-patent nr. 3.928.139.

Ifølge denne forbedrede metoden oppnåes rask og kvantitativ påvisning av mikrobiologiske patogener fra en kroppsvæskeprøve ved anvendelse av et flytende filtermedium. Væskeprøven anbringes på det flytende filtermedium innen en avgrenset steril so-ne. Det flytende filtermedium har en densitet.større enn væske-prøvens og består av en steril vandig løsning som selektivt vil motta mikrobiologiske patogener fra væskeprøven. Den avgrensede sterile sone blir deretter sentrifugert for å tvinge væskeprøven mot væskefiltermediet og forårsake at mikrobiologiske patogener selektivt trenger inn i dette og derved adskiller det fra massen av kroppsvæskeprøven. Dernest blir det flytende filtermedium som inneholder de mikrobiologiske patogener adskilt fra resten av væskeprøven og deler av det flytende filtermedium underkastes forskjellige dyrkningsbetingelser.

Den ovenfor beskrevne forbedrede metoden gir en svært rask og effektiv fremgangsmåte for å adskille mikrobiologiske patogener fra en væskeprøve. Ifølge den foretrukne utførelsesform for den flytende filtermediummetoden, lyseres blodprøven før sentri-fuger ingstrinnet, hvilket forårsaker at de mikrobiologiske patogener selektivt mottas av det flytende filtermedium. Andre for-behandlingsmidler, som anti-koaguleringsmidler brukes også for å fremstille blodprøven. Noen bestanddeler av de foretrukne flytende filtermedia som anvendes ved den forbedrede metoden som ovenfor er diskutert er ikke fordragelig sammen med noen av de forbéiandlete og/eller lyserende midler. Videre vil slike midler blande seg med væskefiltermediet hvis de tilsettes til dette før tidspunktet på hvilket blodprøven tilsettes til den avgrensede sterile sonen, og umiddelbart etter slik tilsetning kan slike midler ikke diffundere rask nok fra det flytende filtermediet for effektiv behandling av blodet. Derfor er det nødvendig enten å utsette blodprøvene for muligheten for ytre forurensning ved å blande blodprøvene med de forbehandlede og/eller lyserende midler før prøven innføres i et lukket sterilt system, eller å anvende en spesiell apparatur, hvor behandlingsmidlene kan foreligge innen det lukkete systemet, men adskilt fra det flytende filtermedium inntil apparatet tas i bruk. Apparat av denne type er omtalt i US-patent nr. 3.875.012 og US-patent nr. 3.932.222.

Videre omfatter den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for påvisning av mikrobiologiske patogener i blodprøver bruken av et flytende filtermedium i et sentrifugeringskar som innbefatter et injiserbart lukningsmiddel på enden av beholderen som blodprø-

ven og væskefiltermediet tvinges mot ved sentrifugering. Det er funnet at noen av de tyngre mikrobiologiske patogener som mottas av det flytende filtermedium kan passere under kraften som pålegges ved sentrifugering fullstendig gjennom det flytende filtermedium og komme til stillstand nær bunnen av sentrifugeringsbeholderen som anvendes, og med mindre stor forsiktighet utvi-

ses under separasjonene og gjenvinningen av væskefiltermediet kan noen av slike mikrobiologiske patogener levnes bakut og ik-

ke gjenvinnes. Det antas at tapet av mikrobiologiske patogener i slik tilfeller opptrer fordi ved fullstendig passering gjen-

nom det flytende filtermedium blir de mikrobiologiske patogener hengende i den ørlille sprekken som dannes mellom veggen av sentrifugeringsbeholderen og det injiserbare lukningsmiddel.

Derfor er det ønskelig å ha en lukket, steril metode for separasjon og konsentrering av mikrobiologiske patogener som misten-kes for å være tilstede i en blodprøve uten at det er nødvendig å forblande blodprøven under potensielt forurensende omgivelser og uten nødvendigheten av å anvende spesielt konstruert apparatur for utførelse av forbehandlingstrinnet ved fremgangsmåten. Videre er det spesielt ønskelig å øke gjenvinningen av de mikrobiologiske patogener som er blitt selektivt separert og konsentrert fra en væskeprøve.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en klar forbedring av de fremgangsmåter og anordninger som er beskrevet i US patent 3.928.139 og 3.932.222 for påvisning av patogene mikroorganismer. I den nye fremgangsmåte for påvisning av nærvær av patogene mikroorganismer i en væskeprøve plasseres denne først i en avgrenset steril sone og sentrifugeres for å tvinge væskeprøven mot en underlagsvæske slik at de patogene mikroorganismer tvinges ut fra væskeprøven og oppsamles av underlagsvæsken. Nøkkelen til foreliggende oppfinnelse ligger i at underlagsvæsken er: a) ikke-toksisk overfor de patogene mikroorganismer;

b) hydrofob og ikke-blandbar med vann; og

c) har større densitet enn væskeprøven og derfor kan bære

denne væsken.

Ved utførelse av denne fremgangsmåten vil de patogene mikroorganismer oppsamles ved grenseflaten mellom væskeprøven og underlagsvæsken og deretter kan underlagsvæsken fjernes fra den avgrensede sterile sone og analyseres.

US patent 3.087.365 beskriver på den annen side fremgangsmåter for fremstilling av pesticide blandinger fra toksiske forbindelser som fremstilles av en mikroorganisme såsom en sopp eller en bakterie. Denne publikasjon angir teknikker for å fjerne inklusjonslegemer og sporer fra vegetative celler. En teknikk for gjennomføring av denne separasjon er en løsningsmiddelekstraksjonsteknikk som angir:""

Blandingen av vegetative celler og inklusjonslegemer med eventuelle resterende sporer behandles med et ikke-vann-blandbart løsningsmiddel, hvilket gir separasjon av de vegetative celler. For dette formål kan halogenerte hydrokarboner anvendes såsom fluormetaner, fluorklormetaner o.l.

Denne separasjon er bare beskrevet i eksemplene 17 (b) og 17(d). I eksempel 17(b) brukes triklortrifluoretan som ekstråksjonsmiddel og i eksempel 17(d) brukes diklortetrafluoretan som ekstråksjonsmiddel. Disse eksempler sammen med patentets øvrige lære viser at ekstraksjonsteknikken brukes for å separere inklusjonslegemer og sporer fra en basill og dette medfører at basillen drepes ved at celleveggene øde-legges slik at sporene og inklusjonslegemene slippes fri. Ble et slikt løsningsmiddel brukt i sentrifugeringsrøret i foreliggende oppfinnelse, ville det drepe bakteriene og andre patogene mikroorganismer som konsentreres ved fremgangsmåten og derved motvirke hensikten med foreliggende oppfinnelse. Ekstraksjonsmiddelet såsom triklortrifluor-metan som brukes i det nevnte US patent er åpenbart toksisk ovenfor patogene mikroorganismer og kan derfor ikke falle innenfor definisjonen av underlagsvæsken i foreliggende oppfinnelse. Denne underlagsvæske må være ikke-toksisk overfor patogene mikroorganismer, må være hydrofob, ikke-blandbar med vann og i stand til å bære væskeprøven i sentrifugerings-røret. Underlagsvæsker som oppfyller disse kriterier er fluorerte hydrokarboner med en densitet fra 1,2 til 2 g/cm<3 >og en molekylvekt i området fra 300-850 g og kokepunkt fra 93°C til 215°C. Slike materialer er tilgjengelige i handel under handelsnavnet "Fluorinert" såsom "Fluorinert FC-75", "Fluorinert FC-48" og "Fluorinert FC-43".

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art hvor væskeprøven ved sentrifugering i sentrifugeringssonen tvinges mot en underlagsvæske omfattende et inert fluorert hydrokarbon med en densitet i området 1,2 til 2,0 g/cm og en molekylvekt i området 300-850, hvilket er ikke-toksiskt.for de patogene mikroorganismer, hydrofobt, ikke-blandbart med vann og har en større densitet enn væskeprøven og derved kan bære væske-prøven, idet hovedsakelig ingen av de patogene mikroorganismer kan passere gjennom underlagsvæsken, hvorved hovedsakelig alle patogene mikroorganismer går gjennom væske-prøven og oppsamles ved grenseflaten mellom væskeprøven og underlagsvæsken.

i Fremgangsmåten kan anvendes på alle typer av kroppsvæsk^, _;

slik som blod, benmarg, spinal- og pleural-væsker, urin og lignende. I tillegg kan fremgangsmåten anvendes på enhver prøve som inneholder mikroorganismer for å konsentrere og separere mikroorganismene fra enhver antimikrobisk faktor

som er til stede i væskeprøven, f.eks. næringsmidler, slik som melk og lignende. Generelt innbefatter fremgangsmåten, ved anvendelse i forbindelse med en blodprøve, avsetning av en lysert blodprøve på et relativt tynt sjikt av den ovenfor angitte underlagsvæske. Denne underlagsvæske er fordragelig sammen med lyserings- og andre blodoppvarmings-midler, og slike midler vil raskt skille seg fra nevnte underlagsvæske ved blanding med denne. For derfor fortrinnsvis å unngå mulig forurensning kan en blodprøve injiseres . i en steril avgrenset sone som inneholder både underlagsvæsker som ovenfor er beskrevet og en effektiv mengde av lyserings- og/eller andre blodbehandlingsmidler, slik at blodprøven behandles in situ. Den lyserte blodprøven som inneholdes av den avgrensede, sterile sonen utsettes så for sentrifugering, som tvinger blodprøven mot utjevningsmidlet som også inneholdes deri. Det er funnet at etter slik sentrifugering vil hovedsakelig alle de mikrobiologiske patogener som foreligger i en lysert blodprøve passere ut av suspensjonen og samles i et sjikt nær grenseflaten av underlagsvæsken og blodprøven selv. De mikrobiologiske patogener vil faktisk gjennomtrenge grenseflaten mellom underlagsvæsken og blodprøven og trenge inn i underlagsvæsken eller vil forbli på overflaten eller nær overflaten av underlagsvæsken og intet eller nesten intet vil passere fullstendig gjennom underlagsvæsken. Dette må bringes i kontrast med bruken av et flytende filtermedium som selektivt mottar mikrobiologiske patogener, og hvorigjennom noen av mikroorganismene kan passere fullstendig og bli fanget mellom veggen av sentrifugeringsbeholderen og de injiserbare lukningsmidler. Sjiktet av mikrobiologiske patogener som således dannes ifølge foreliggende oppfinnelse kan så gjenvinnes uten vesentlig tap ved å adskille underlagsvæsken og en liten andel av den resterende blod-prøven nær grenseflaten i underlagsvæsken fra hoveddelen av prøven. Således muliggjør nærværet av underlagsvæsken

under sentrifugeringen av den lyserte blodprøven at mikrobiologiske patogener kan adskilles fra den lyserte blod-prøven såvel som fra ethvert medikament og antipatogene faktorer som foreligger deri. Etter gjenvinning kan de mikrobiologiske patogener analyseres både kvantitativt og kvalitativt.

Således anvendes i foreliggende oppfinnelse en høydensitets-, ikke-toksisk, med vann ikke-blandbar, hydrofob underlagsvæske for oppsamling og adskillelse av mikrobiologiske patogener fra en væskeprøve i en sentrifugeringssone. Det er funnet at anvendelsen.av en slik underlagsvæske, enten alene eller i forbindelse med et flytende filtermedium, gir en vesentlig øket gjenvinning av mikrobiologiske patogener som er blitt separert fra en blodprøve. Uttrykket "høy densitet" slik det her er brukt, betyr at væsken har en tilstrekkelig densitet til ikke å flyte opp på en blanding av en blod-prøve og behandlingsvæske for denne eller noen annen væske-prøve som er mistenkt for å inneholde mikrobiologiske patogener under sentrifugering. Det antas at disse underlagsvæsker på grunn av sin høye densitet gir en "underlags-virkning"'på mikrobiologiske patogener som tvinges til å

gå ut fra suspensjonen i en blodprøve ved sentrifugering.

De mikrobiologiske patogener oppfanges, og fordeles nær overflaten mellom selve blodprøven og underlagsvæsken. På denne måten tapes ikke mikrobiologiske patogener i innvendige rom som kan foreligge i overflaten av den avgrensede sterile sonen som de presses mot ved sentrifugering.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse én ny anordning for bruk under utøvelsen av foran nevnte fremgangsmåte.

Denne anordning ifølge foreliggende oppfinnelse er karakterisert ved at den omfatter en lukket sentrifugebeholder som er selvtettende lukket med lukningsorganer, hvorunder beholderens indre del omfatter et tomt rom som holdes på

et trykk under atmosfæretrykket, et inert'fluorert hydrbr

karbon med en densitet på 1,2 til 2,0 g/cm , et kokepunkt på 90-210°C og en gjennomsnittlig molekylvekt på 300-850,

som befinner seg på bunnen derav og ikke er giftig, ikke-blandbar med vann, er hydrofob og danner et sjikt, hvilken væske er i stand til å oppsamle hovedsakelig alle de pato-

gene mikroorganismer som skilles ut fra den væskeformi^e

prøven, uten at noen patogene mikroorganismer går tapt i sentrifugerørets mellomrom.

Den nye anordning gir en jevn kontinuerlig overflate inne i

en sentrifugeringsbeholder, slik at ved sentrifugering av sentrifugeringsbeholderen vil væskeprøven som sentrifugeres tvinges hovedsakelig loddrett mot overflaten. Overflaten omfatter den indre enden av et injiserbart lukningsmiddel for beholderen, hvorpå ovenfor beskrevne underlagsvæske er anbragt. Nevnte underlagsvæske vil bli fordelt på den indre overflaten av dette injiserbare lukningsmiddel og vil fylle det indre mellomrommet mellom sentrifugeringskarets vegg og det injiserbare lukningsmiddel for å hindre at noen tyngre mikrobiologiske patogener oppfanges, som kan gå

gjennom til denne underlagsvæske under sentrifugering. Når

en kurvsentrifuge anvendes, bør den indre overflaten av

dette injiserbare lukningsmiddel være perpendikulært på

bunnen av nevnte injiserbare lukningsmiddel. Videre blir,

når en vinklet rotortype-sentrifuge anvendes, den jevne indre overflaten av det injiserbare lukningsmiddel anbragt innenfor sentrifugeringsbeholderen i en vinkel som er komplementær til den vinkel hvorved sentrifugeringen utføres.

Denne enestående konstruksjonen gjør det mulig å bruke vanlig tilgjengelige vinkelsentrifuger og fører faktisk til en kortere veilengde for patogenet gjennom væskeprøven før den blir konsentrert nær den indre flaten til underlagsvæsken. Denne kortere veilengden resulterer i en større gjennomsnittskraft ("g" kraft), som må anvendes på de mikrobiologiske patogener i væskeprøven. Sentrifugering med denne enestående konstruerte sentrifugeringsbeholder vil resulterer i at patogener blir konsentrert nær grenseflaten av underlagsvæsken og væskeprøven og delvis på sentri-fugeringsbeholderens sidevegg. De mikrobiologiske patogener som således konsentreres er lette å samle opp og fjerne fra sentrifu-geringskaret. Således garanterer plasseringen av overflaten innenfor sentrifugeringsbeholderen i en slik vinkel at blodprøven og underlagsvæsken vil tvinges mot overflaten i en hovedsakelig perpendikulær vinkel under sentrifugering, at underlagsvæsken vil fordeles hovedsakelig jevnt over overflaten og således fullstendig dekke alle innvendige rom som vil oppfange mikrobiologiske patogener. En slik anordning gir en kortere veilengde for patogenene og derfor en større gjennomsnittlig "g" kraft som må pålegges patogener for å gi en mere effektiv konsentrert avsetning av disse, som lett kan fjernes fra sentrifugeringsbeholderen. Videre resulterer bruken av denne spesielt konstruerte sentrif ugeringsbeholder i en øket sentrifugeringseffektivitet ved at sentrifugeringen kan utføres ved mindre g'er i løpet av samme tidsrom enn ved konvensjonell sentrifugering eller ved ds samme g'er i en kortere tid enn ved den konvensjonelle fremgangsmåte .

Videre kan ifølge en foretrukken utførelsesform ved foreliggende oppfinnelse blodlyserings- og andre blodbehandlingsmidler som anvendes for å fremstille en blodprøve anbringes i en vandig løsning inne i sentrifugeringsbeholderen i kontakt med den flytende underlagsvæske. Den flytende underlagsvæske har en høyere densitet enn den vandige løsningen og er hydrofob og ikke blandbar med vann og vil derfor bære en slik vandig løs-ning. Videre vil, hvis sentrifugeringsbeholderen beveges under lagring eller forsendelse, de lyserende eller andre blodbehandlingsmidler blandes med underlagsvæsken. Når imidlertid sentrifugeringsbeholderen underkastes sentrifugering adskilles (sedi-menteres) den flytende underlagsvæske . med høy densitet lett og muliggjør at blodbehandlingsmidlene blandes med blodprøven innen beholderen. Dette er en stor fordel overfor de forut beskrevne konvensjonelle flytende filtermedia som har bestanddeler som er uforenelige med noen av blodbehandlingsmidlene, og da dessuten de konvensjonelle væskefiltermediene er basert på vann, vil de blandes med de vandig baserte blodbehandlingsmidler, hvis de to er i kontakt, og hindre dem i effektivt å diffundere derifra og virke på en blodprøve som befinner seg i beholderen.

Foreliggende oppfinnelsen kan lettere forståes gjennom studium

av tegningene, hvor:

Fig. 1 er et tversnitt av den foretrukne sentrifugeringsartikkel ifølge foreliggende oppfinnelse, og Fig. 2-9 angir trinnene for den forbedrete fremgangsmåten for påvisning av mikrobiologiske patogener som anvender artiklen ifølge fig. 1.

Under henvisning til fig. 1, skal en foretrukken utførelsesform av den forbedrede sentrifugeringsartikkel ifølge foreliggende oppfinnelse beskrives. Som vist omfatter artiklen 20 en langstrakt, rørformet sentrifugeringsbeholder 22 med en konvensjonell innsettbar lukningsdel 24, som forseglende lukker dennes øvre ende, og en ny innsettbar lukningsdel 26, som forseglende lukker den nedre ende. Når artikkel 20 skal anvendes i den foretrukne utførelsesform ifølge metoden for påvisning av mikrobiologiske patogener ifølge foreliggende oppfinnelse, kan en effektiv mengde av utjevningsmiddel 28 og blodbehandlingsmiddel 30 anbringes deri.

Sentrifugeringsbeholderen 22 kan lages av silikonglass eller hard plast, slik som polykarbonat eller polypropylen. Innsettbare lukningsmidler 24 og 2 6 kan omfatte gummiselvforseglende korker. Innsettbare lukningsmidler 24 og 26 har begge inn-bukninger 24a henh. 26a for å lette inntrengning av vanlige typer av medisinske injeksjonsnåler. Det evakuerte rommet 32 holdes under atmosfærisk trykk på en forutbestemt verdi, slik at sentrifugeringsbeholderen kan motta en kjent væskemengde ved injeksjon gjennom injiserbart lukningsmiddel 24 uten at overtrykk dannes inne i røret som ville løsne de injiserbare lukningsdele-ne 24 og 26 fra åpningene i sentrifugeringsbeholderen 22.

Under spesiell henvisning til lukningsdelen 26 på den nedre enden av sentrifugeringsbeholderen 22 bemerkes at den indre flate 34 av injiserbar lukningsdel 26 er anbragt i vinkel i forhold til veggene til sentrifugeringsbeholderen 22. Det bemerkes at artikkel 20 er spesielt konstruert for å anvendes i en vinklet rotorsentrifuge,, og at vinklen til den indre flaten 24 er komplementær til rotorens vinkel. Det bør imidlertid bemerkes at anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i konvensjonelle kurvsentrifuger. I siste tilfelle bør overflaten 34 være parallell med bunnen av artiklen 20 og anvendes forøvrig på samme generelle måte som det skal beskrives nedenunder for artikkel 20, illustrert i fig. 1. Overflaten 34 bør være jevn og hovedsakelig fri for innvendige rom og sprekker, hvori mikrobiologiske patogener kunne oppfanges. Videre bør det runde for-seglingsområde rundt overflaten 34, hvor materialet til den injiserbare lukningsdel 2 6 møter veggene til sentrifugeringsbeholderen 22 være tett forseglet, slik at den indre flaten ikke gir en stor ringformet sprekk hvori mikrobiologiske patogener kunne avsettes.

Helningsvinklen for den jevne flaten 34 med hensyn til veggene

i sentrifugeringsbeholderen 22 bestemmes ifølge sentrifugerings-apparatet hvori artikkel 20 skal sentrifugeres.

Som ovenfor omtalt vil, når en kurvsentrifuge benyttes, over-falten 34 være parallell med bunnen i artikkel 20. Når imidlertid en vinklet rotorsentrifuge anvendes vil overflaten 34 være. komplementær til rotorens vinkel. Derfor vil generelt, når rotorvinklene ligger fra 60° til 10°, vinklen til flaten 34 eller skråningsvinklen 36 i sentrifugeringsbeholderen ligge til-svarende fra 30o til 80°. Således vil helningsvinklen angi ved pilen 36, generelt være komplementær til vinklen som anordningen 20 ligger i innen sentrifugen under sentrifugering. F.eks.

er helningsvinklen 36, som angitt i fig. 1, tilnærmet 34°. Således vil f.eks., når artikkel 20 plasseres i en vinkelrotorsentrifuge, hvori sentrifugering finner sted ved ca. 56°, væske som befinner seg i artikkel 20 tvinges mot overflaten 34 i en nær rett vinkel.

Det bør bemerkes at som angitt i fig. 1 blir den injiserbare lukningsdel 26 dannet fra et eneste gummistykke. Imidlertid kan overflaten 34 frembringes ved å bruke en plugg av et materiale nær den indre overflaten av en vanlig gummikork som injiserbar lukningsdel 24 for eksempel. En slik plugg kan fremstilles fra mange forskjellige materialer som gir en jevn overflate, en god forsegling med veggen av sentrifugeringsbeholderen 22, er injiserbare og som er ikke-toksiske overfor mikrobiologiske patogener. En fremgangsmåte for fremstilling av en slik plugg er å gjøre dette in situ ved å anvende et materiale som kan helles i sentrifugeringsbeholderen 22 såsnart en vanlig gummikork, slik som en injiserbare lukningsdel 24, er plassert i den endre enden av sentrif ugeringsbeholderen 22. Materialet bør være flytende nok og ha lange nok setningstider, slik at sentrifugeringsbeholderen 22 kan plasseres i den ønskete helningsvinkel med slikt resultat at materialet flyter til den ønskede helningsvinkel og så setter seg. Etter setning vil materialet gi en glatt overflate 34 og en god forsegling med veggene til sentrifugeringsbeholderen 22. Eksempler på slike materialer er vanlige badekarspropper og si-liciumbaserte harpikser som foreligger i form av lav-viskøs væske og sam herder under dannelse av et elastomert materiale. Et eksempel på sistnevnte materialtype er en siliciumbasert flytende harpiks,"Sylgard 134".

Når et slikt materiale som "Sylgard" anvendes, er det noen ganger tilrådelig å bruke en primer på

den innvendige veggen av sentrifugeringsbeholderen 22 for å sikre en god forsegling mellom det herdete "Sylgard" og sentri-fugeringsbeholderens v=aa 22. En egnet primer selges under hen-delsnavnet "DC1200". Således kan f.eks. jevn skrå-nende flate 34, som angitt i fig. 1, fremstilles som den indre overflaten av en enhetsinjiserbar lukningsdel 26 ved å forbe-handle den indre veggen av sentrifugeringsbeholderen 22 med en egnet siliciumbasert harpiksprimer som "DC1200", innsette en vanlig gummipropp som vist som injiserbar lukningsdel 24, helle en mengde flytende siliciumbasert harpiks, slik som "Sylgard 134" i sentrifugeringsbeholderen 22, anbringe hele beholderen i den ønskete helningsvinkel og herde silikonharpiksen under riktige betingelser for å gi en elastomer plugg med en jevn overflate 34 i den ønskede helningsvinkel nær en vanlig gummipropp. Badekarspropper og lignende materialer kan anvendes på samme generelle måte om ønsket, og den riktige helningsvinkel kan dannes ved å sentrifugere gjenstanden som inneholder det ikke-her-dede plugg-dannende materiale i den sentrifugetype, med hvilken artiklen skal anvendes.

Såsnart den jevne overflaten 34 er dannet enten ved å plassere en injiserbar lukningsdel 26 i ett stykke eller ved en kombi-nasjon av en gummipropp og en plugg av materiale som ovenfor beskrevet, kan en effektiv mengde utjevningsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse settes til artiklen 20. Mengden av utjevningsmiddel som anvendes bør være tilstrekkelig til fullstendig å dekke overflaten 34 etter sentrifugering, men ikke så stor at den vesentlig begrenser blodmengden som artikkel 20 kan motta. Mengden av utjevningsmiddel som anvendes kan variere med para-meteren av det spesielt valgte system, f.eks. proppenes utform-ning, volumet av blodresten og flyktigheten til utjevningsmidlet som anvendes. En foretrukken mengde av utjevningsmiddel kan bestå av fra 3,3 til 30,0 volum% basert på volumet av den underlagsvæske -restblodprøveblanding som tas fra artikkel 20 og undersøkes for nærværet av mikrobiologiske patoge-.ner.

Generelt kan underlagsvæsken som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte en hydrofob, med vann ikke-blandbar væske med høy densitet. Som tidligere angitt referer uttrykket "høy densitet" som heri brukt, seg til en væske som ikke vil ligge oppe på en blanding av blod og blodbehandlingsvæske eller noen annen væskeprøve som kan tenkes å inneholde mikrobiologiske patogener i nærvær av sentrifugalkraften. Dertil bør underlagsvæsken være ikke-toksisk overfor mikrobiologiske patogener og relativt inert med hensyn til butylgummi, silikongummi og andre typer elasto-merer som anvendes ved fremstillingen av injiserbare lukningsmidler som er beskrevet ovenfor. Underlags.væskens densitet må ligge i området fra 1,2 g pr. cm<J> til 2,0 g pr. cm , men det foretrukne område ligger fra 1,6 g pr. cm 3 til 2,0 g pr. cm 3. Generelt foretrekkes fluorerte hydrokarboner med de foran beskrevne karakteristika og med molekylvekter i området fra 300 til 850. Videre foretrekkes fluorerte hydrokarboner med de ovennevnte egenskaper som vil fordampe med nær samme hastighet som vann såsnart en prøve som inneholder underlagsvæsken plasseres på en vanlig type dyrkningsskål. Derfor kan utjevningsmidler med de ovenfor beskrevne kvaliteter og kokepunkter på 90° til 210°C, og fortrinnsvis 100° til - 140°C anvendes. Utjevningsmidlet bør også ha et damptrykk som ikke vil blåse ut de injiserbare lukningsmidlene fra røret under fremstillingstrinne-ne som f.eks. autoklavering. Fluorerte hydrokarboner som "Fluorinert"

, er blitt funnet å virke godt som underlagsvæske. Spesielt er typene FC-75, FC-48 og FC-43 fra "Fluorinert"-serie-ne funnet å være særlig brukbare.

Selv om den eksakte funksjonen som slike underlagsvæsker har ikke er fullstendig kjent, antas det at de Hjelper oppsamlingen av mikrobiologiske patogener som er kommet fra suspensjonen i en sentrifugert blodprøve på minst to måter. For det første tjener underlagsvæsken til å forsegle innvendige rom, sprekker, og gap både på den jevne overflaten 34 i sentrifugeringsbeholderen 22 og på grenseflaten mellom veggene til sentrif ugeringsbehol-deren 22 og den injiserbare lukningsdel 26. Således oppsamles mikrobiologiske patogener som ellers ville blitt fanget i slike innvendige rom og derfor gått tapt ved utjevningsmidlet 28 når det fjernes fra artikkel 20. For det annet antas det at underlagsvæsken tjener til å utjevne de tilstrømmende mikrobiologiske patogener som tvinges ut av suspensjonen i en blodprøve under sentrifugering. Denne utjevningsvirkning reduserer faren for å skade de mikrobiologiske patogener som ellers kunne opptre ved belastning. Videre, skjønt noen av de mikrobiologiske patogener faktisk kan komme inn i underlagsvæsken vil i det vesentlige ingen gå helt gjennom det og hoveddelen vil komme til overflaten derav ved grenseflaten mellom -underlagsvæsken 28 og blodprø-ven og samlet i ett sjikt.

Etter at underlagsvæsken 28 er anbragt i sentrifugeringsartiklen 20 blir vannløselige behandlingsmidler 30 for blodet også anbragt deri. Slike behandlingsmidler kan f.eks. bestå av lyse-ringsmidler og/eller antikoagulanter. Ethvert brukbart lyseringsmiddel kan anvendes sålenge det ikke er toksisk for mikroorganismer. Et slikt egnet lyseringsmiddel er en vandig løsning av et ikke-toksisk saponin. Man må legge merke til at mange saponiner er kjent for å være toksiske overfor mikrobiologiske patogener. Som imidlertid beskrevet i US-patent nr. 3.883.425 finnes en metode for å fjerne de toksiske bestanddeler som hittil er ment å være toksiske saponiner. Generelt kan toksiske sapo-ninmateriale detoksifiseres ifølge oppfinnelsen beskrevet i US-patent nr. 3.883.425 og det resulterende rensede materiale anvendes innen rammen av foreliggende oppfinnelse. Dertil kan den vandige løsningen av saponin inneholde et antikoagulant og/ eller oksygenrensemiddel. En foretrukken antikoagulant er na-triumpolyanetolsulfonat (SPS) eller f.eks. heparin. Natrium-polyanetolsulfonat foretrekkes fordi det ikke bare virker som et antikoagulant, men også inhiberer den fagocytiske aktivitet for granulocyter og monocyter og den normale antibakterielle aktivitet i blodserum. Det er foretrukket at nevnte vandige løs-ning av behandlingsmiddel minst er 1,0 volum* av den totale væske i sentrifugeringsbeholderen 22 som inneholder behandlings-løsningen, væskeprøve og underlagsvæske og fortrinnsvis fra

7,6 til 17,5 volum% av denne.

Når behandlingsmidlene 30 er anbragt i sentrifugeringsartiklen 20, kan injiserbar lukningsdel 24 settes på plass og rommet 32 evakueres til det ønskete trykk under atmosfærestrykk.

Under henvisning til fig. 2-9 er det angitt en analytisk se-kvens som skjematisk illustrerer en foretrukken utførelsesform av foreliggende oppfinnelse. Som et eksempel kan en fremgangsmåte som utføres ifølge én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse for påvisning av mikrobiologiske patogener i en blodprøve utføres hensiktsmessig med det følgende apparatur: Den ovenfor beskrevne sentrifugeringsartikkel 20 som inneholder utjevningsmidlet 28 og blodbehandlingsmidlene 30 - beholderen kan ha 12-14 milliliters volum.

En steril glass-sprøyte og én éngangs-hypodermisknål (lengde: 3,81 cm; utvendig diameter 1,7 mm),

en steril glass-sprøyte og en éngangs-hypodermisk nål (lengde: 2,54 cm; utvendig diameter: 0,81 mm)

én hypodermisk nål (lengde: 1,59 cm; utvendig diameter: 0,5 mm) med bomull innsatt ved inntaket (brukt som ventil),

tre blod-agar-plater,

én sjokolade-agar-plate,

én "SabouraucP-plate.

Det bemerkes at med unntagelse av sentrifugeringsartikel 20 eller en ekvivalent artikkel, kan forskjellige typer velkjente laboratorieapparatur og kulturmedia anvendes for å utføre den nye fremgangsmåten ved foreliggende oppfinnelse. Det skal særlig bemerkes at kulturmediene som er ovenfor angitt bare er eksempler og generelt foretrukket for anvendelse for påvisning av de mest vanlig kjente mikrobiologiske patogener. Blod-agar-platene som er foreslått er konvensjonelt benyttede blod-agar-plater som

er basert på saueblod og et basisernæringsmiddel som sukker,

som holdes sammen med et agar-stivemiddel på en Petri-skål. Sjokolade-agar-platen er konstruert for å dyrke visse kresne patogener, f.eks. hemophilus. "Sabouraud"-platen er spesielt konstruert for å dyrke sopp.

Således, skjønt forskjellig apparatur kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan ovenstående liste av apparatur og materialer med fordel anvendes innenfor rammen av denne oppfinnelse slik det er beskrevet nedenfor.

For å benytte sentrifugeringsartikkel 20 som er beskrevet i

fig. 1 i tegningen anbringes den først slik at den injiserbare lukningsdel 26 med sin glatte vinklete overflate 34 er ved artikkels 20 nedre ende, slik at underlagsvæsken 28 og blodbehandlingsvæsken 30 hviler på den glatte vinklete overflaten 34. Det må bemerkes at i illustrerende hensikt er to adskilte væskenivåer vist i fig. 2, som representerer underlagsvæsken 28 og behandlingsvæsken 30. I praksis kan en ikke stabil emul-sjon eller blanding av disse to væsker opptre som følge av be-handlingen slik at ikke alltid to flytende væskesjikt er tilstede. Denne ustabile blandingen av underlagsvæsken 28 og blodbehandlingsvæske 30 har ingen uheldig innflytelse på den heri beskrevne metode, da separasjon av de to væskene rask oppnåes ved sentrifugering.

Deretter blir en forutbestemt mengde av en blodprøve 38 som er tatt fra en pasient, f.eks. 7 ml blod, injisert i det evakuerte rommet i sentrifugeringsartiklen 20 som vist i fig. 3 under bruk av en vanlig type sprøyte 40. Alternativt kan prøven anbringes direkte i artikkel 20 under bruk av en standard og dobbeltnål-anordning utstyrt med konvensionel1« vakuumblodsugningsorganer, slik som "Vacutainer",

Så blir artikkel 20 som inneholder blodprøven 38, blodbehandlingsvæsken 30 og underlagsvæsken 28 utsatt for blanding for å sikre at blodbehandlingsmidlene 30 fullstendig blandes med blodprøven 38. Dette blandingstrinnet er skjematisk angitt ved fig. 4.

Etter at blodprøven 38 er blitt behandlet på denne måten sentrifugeres sentrifugeringsartlklen 20 for å få de mikrobiologiske patogeneri den behandlete blodprøven 4 2 til å gå ut av suspensjonen og samles nær grenseflaten av underlagsvæske 28 med høy densitet og resten av prøvevæsken. Noen mikrobiologiske patogener vil faktisk avsettes på sideveggen i sentrifugeringsbeholderen 22 nær den øvre enden av den jevne overflaten 34

ved punkt 22a. Dette sentrifugeringstrinn representeres skjematisk i fig. 5. Hastighet og tid for sentrifugering kan variere betraktelig avhengig av konstruksjonsmaterialet for sentrifugeringsartiklen 20 og typen av sentrifugeringsapparatur. Sentrifugeringen kan lett utføres ved å pålegge mellom 1500 og 6000 g og fortrinnsvis fra 1500 til 3000 g på sentrifugeringsartiklen 20 som inneholder den behandlete blodprøven 42 og utjevningsmidlet 28. Som vist i fig. 5 anvendes en vinkelrotorsentrifuge som plaserer sentrifugeringsartiklen 20 i en vinkel på f. eks. 56° (antydet ved sektor 43) under sentrifugeringen. Hvis således den jevne vinklete flaten 34 har en 34°'s vinkel med hensyn til veggene i sentrifugeringsartlklen 20, vil den behandlete blodprøven 42 og utjevningsmidlet 28 tvinges mot den jevne vinklete overflaten 34 i en omtrent perpendikulær vinkel under sentrifugering. Det skal bemerkes at når en kurvsentrifuge anvendes, vil sentrifugeringsartiklen 20 sentrifugeres -ved nær 0° med hensyn til en horisontal overflate. Således vil i et slikt tilfelle overflatevinklen 34 være nær 90° og en injiserbar gummilukningsdel med en flat indre overflate kan erstatte den injiserbare lukningsdel 26.

Såsnart sentrifugeringstrinnet er avsluttet, kan sentrifugeringsartiklen 20 fjernes fra sentrifugen og hoveddelen av den behandlete blodprøven 42, fra hvilken mikrobiologiske patogener er adskilt, kan fjernes. Det bemerkes at, slik det brukes heri, re-fererer uttrykket "rest-behandlet blodprøve" eller "rest-blod" seg til en blodprøve som er blitt sentrifugert, slik at de mikrobiologiske patogener som deri foreligger er samlet på bunnen av prøven og således levner "rest"-delen av prøven i det vesentlige fri for mikrobiologiske patogener. Dette trinn er vist i fig. 6. For å lette fjerningen injiseres en luftenål 44 i form av en vanlig hypodermisk nål med bomull i tuppen f.eks. gjennom injiserbar lukningsdel 24. En annen hypodermisk nål med sprøyte 45 tilknyttet kan derpå injiseres gjennom den injiserbare lukningsdel 26 for å fjerne hoveddelen av rest-behandlet blodprøve 42, hvorfra mikrobiologiske patogener er adskilt. F.eks. når sentrifugeringsbeholderen har et volum på fra 12 til 14 ml kan en nål (lengde 3,81 cm; utvendig diameter 1,27 mm) anvendes for å fjerne alt bortsett fra 1,3 til 1,7 ml av den behandlete blod-prøven 42. Som vist foretrekkes det at hoveddelen av rest-blod-prøve fjernes fra det innvendige av sentrifugeringsbeholderen 22 ved et punkt motsatt av sideveggen nær den øvre kanten av den glatte overflaten 34 for ikke å forstyrre sjiktet av mikrobiologiske patogene som er dannet på og i grenseflaten av de to væsker og på sideveggen av sentrifugeringsbeholderen 22 nær den øvre ende av nevnte kantede jevne overflate 34. Hoveddelen av restblodet fjernes imidlertid i dette trinn, men en liten del rest-blod bør levnes i sentrifugeringsbeholderen 22, slik at av den totale væske som blir tilbake omfatter underlagsvæsken fra 4,7 til 28,6 volum%. Det foretrekkes at ikke mere enn ca. 20 volum% skal være nevnte underlagsvæske fordi større mengder av nevnte underlagsvæske kan påvirke uheldig morfolo-gien til mikrobiologiske patogene kolonier i etterfølgende patogene veksttrinn som brukes i prosessen.

Såsnart hoveddelen av den behandlede rest-blodprøve er blitt fjernet kan begge nåler tas ut fra de injiserbare lukningsdeler 24 og 26, og sentrifugeringsartiklen 20 utsettes deretter for et andre blandetrinn som vist skjematisk i fig. 7. Imidlertid, om ønsket, kan luftenålen 24 levnes i stilling gjennom den injiserbare lukningsdelen 24 for å hjelpe til med fjerning av den pa-togenholdige væske i et senere trinn. Det andre blandetrinnet tjener til å resuspenderer mikrobiologiske patogener som er adskilt fra hoveddelen av rest-behandlet blodprøve 42, og som har dannet det ovenfor beskrevne sjikt. Resuspensjon av de mikrobiologiske patogener som således er samlet i den tilbakeværende mindre delen av rest-behandlet blodprøve 42 garanterer større og mer jevn gjenvinning.

Såsnart blandingstrinnet har resuspendert de mikrobiologiske patogener i en mindre del av rest-behandlet blodprøve 42, kan blandingen av mikrobiologiske patogener i den rest-behandlede blodprøven og underlagsvæsken med høy densitet fjernes fra sentrif ugeringsartiklen 20. Dette trinnet er vist i fig. 8. Som ovenfor angitt kan om ønsket den luftende hypodermiske nål 44 innsettes gjennom den injiserbare lukningsdel 24 for å mulig-gjøre lettere fjerning av de gjenværende bestanddeler. Sprøyten 46 med påsatt hypodermisk nål kan deretter injiseres gjennom den injiserbare lukningsdelen 26 for å trekke blandingen 48 ut av underlagsvæsken 28, mindre gjenværende deler av rest-blodprø-

ve 42 og mikrobiologiske patogener som foreligger deri. Det må bemerkes at særlig god gjenvinning kan oppnåes hvis den hypodermiske nålen som brukes for å fjerne disse bestanddelene injiseres på den nedre enden av den vinklete glatte overflaten 34. Det antas at vinklen på overfLaten 34 delvis tjener som en trakt hvori den gjenværende væske som inneholder de mikrobiologiske patogener strømmer. Blandingen 48 av flytende under-lagsvæske 28 med høy densitet og den gjenværende mindre delen av rest-behandlet blodprøve 4 2 med de gjenvunne mikrobiologiske patogener bør være 1 - 1/2 ml væske. Denne væske fordeles deretter på bakterievekstmedia. Dette trinn er skjematisk illu-strert i fig. 9 i tegningen. Med den ovenfor angitte apparatur kan materialet fordeles som følger: En blod-agar-plate kan oppta 0,3 ml av blandingen og platen kan inkuberes ved 36°C i en aerob atmosfære. To blod-agar-plater kan oppta 0,3 ml av den vandige løsningen og kan inkuberes ved 36°C under anaerobe betingelser.En sjokolade-agar-plate kan motta 0,3 ml av den vandige løsningen og kan inkuberes ved 36°C i en behol-der. Sabouraud-platen kan oppta 0,3 ml av blandingen og kan inkuberes ved 25°C i en aerob atmosfære. Vekstmediene bør kontrolleres daglig for ettersyn av kolonier. Mikroskopiske analyseteknikker

kan anvendes. Antallet av mikrobiologiske patogener i én ml blod kan bestemmes ved å multiplisere antallet .kolonier med en kor-reks jonsf aktor. Denne korreksjonsfaktor tar hensyn til gjenvin-ningshastigheten for en gitt organisme, blodvolumene og underlagsvæsken med høy densitet som anvendes og mengden av endelig blanding som settes på platen. I det generelle eksempel som er angitt ovenfor er korreksjonsfaktoren 1,4.

Det skal igjen bemerkes at de eksakte prosesstrinn, apparatur og utstyr, og typer av kulturmedia som anvendes i den detaljerte utførelsesformen som ovenfor er angitt, kan variere som ønsket. F.eks. kan alle kjente midler anvendes for å blande blodprøven med antikoagulanten og/eller lyseringsmidlet. Dessuten kan i noen tilfeller uttagningstrinnet av hoveddelen av blodprøven 4 2 som er vist i fig. 6 helt elimineres og bare en liten del av blodprøven 4 2 som inneholder resuspenderte mikrobiologiske patogener kan tas ut fra bunnen av sentrifugeringsartiklen 20 sammen med underlagsvæske 28 med høy densitet som vist i fig. 8. Forskjellige andre modifikasjoner kan anvendes ved fremgangsmåten,

om ønsket.

EKSEMPEL

Dette eksempel ble utført for å tilveiebringe sammenlignings-

data mad hensyn til gjenvinningsgraden av mikrobiologiske patoge-

ner fra blodprøver når den flytende filtermediumsteknikk som er beskrevet i US-patent nr. 3.928.139 ble anvendt sammenlignet med gjenvinninger av mikrobiologiske patogener som erholdes ved å anvende underlagsvæsketeknikken ifølge foreliggende oppfinnelse .

De teknikker som anvendes i dette eksempel er identifisert i tabell I enten som "Flytende Filtermedium" eller "Utjevningsmiddel". Den informasjon som står i parentes direkte under tek-nikkangivelsen angir det brukte flytende filtermedium (f.eks. 50 % sukrose) i de flytende filtermediumsforsøk og anvendt utjevningsmiddel (f.eks. "Fluorinert FC-48") i uinderlagsvæskeforsø-kene. Hver prøve prøvet (1-21 som er oppført i tabell I) ble fremstilt av 7 ml<1>s prøver av sterilt lysert blod fra friske blodgivere, idet hver prøve ble inokulert med 0,3 ml av forskjellige kjente konsentrasjoner av et humant patogen (enten Escheri-schia coli eller Candida albicans, slik som vist i tabell I).

I hvert av de utførte prøveforsøk ble en sentrifugeringsartikkel 20, slik som vist og beskrevet ovenfor, anvendt enten de. flytende filtermediumsteknikk eller underlagsvæsketeknikken ble brukt. For å undersøke virkningen av anvendelsen av en overflate anbragt i det vesentlige komplementært til vinklen, hvorved artikkel 20 sentrifugeres, var noen av de anvendte artikler 20 gummi-korker med flat, glatt, innvendig overflate slik at den indre overflaten av bunnproppen var i plan med bunnflaten når denne sto -opprett. Disse bunnproppene er angitt som "horisontal" i tabell I. Det ble også anvendt spesielt fremstilte bunnlukningsdeler som var laget ved å bruke vanlige gummipropper i forbindelse med enten en vanlig badekarspropp eller en silikon-basert harpiks,

"Sylgard 134",

for ved dette å fremstille en bunnflate med artikkel

20 som med hensyn til veggene av artikkel 20 ville ha en vinkel hovedsakelig lik komplementærvinklen som artikkel 20 ble sentrifugert med. De undersøkte prøvene ved bruk av sentrifuge-ringsartikler som anvendte vinklete bunnpropper er oppført som sådanne i tabell I og det anvendte materiale (enten bade-kars propp eller "Sylgard") for å fremstille den vinklete overflaten også angitt. Sentrifugeringene som ble utført i forbindelse med hver av prøvene som oppgitt i tabell I ved anvendelse av vinklete bunnpropper ble utført i en vinkelrotor-sentrifuge hvori sentrifugeringsvinklen var nær 56° . Således ga disse sentrif ugeringsartiklene som besto av vinklete bunnpropper (vinklet med en nær 34°'s vinkel) en bunnflate med nær perpendikulær vinkel til sentrifugalkraftens retning. Videre ble disse prøvene som hadde en horisontal bunnpropp (som vist i tabell I) sentrifugert i en kurv-sentrifuge, som under bruk bevirker at sentrifugeringsartiklen 20 roteres i et plan nær parallelt med hori-sontalplaten. Således virket sentrifugalkraften i en retning nær loddrett på overflaten av de horisontale bunnproppene.

Når den flytende filtermediumteknikken ble anvendt, inneholdt hver av artiklene 20 1,2 ml av en vandig løsning inneholdende 1,5 vekts% gelatin og den vektkonsentrasjon sukrose som indikeres i tabell I. Hver av artiklene 20 ble snudd og kjølt til 4°C i snudd stilling før den inokulerte blodprøven ble tilsatt. Etter at hver av artiklene 20 hadde fått den tilsiktede mengde blodprø-ve som inneholdt den kjente mengde human-patogen, ble den plasert i et vannbad i fortsatt snudd stilling. Vannbadet var innstilt på 4 2°C og gelatinen fikk smelte. Hveit rør ble deretter sentrifugert i nær 56°'s vinkel i en rotorsentrifuge. Sentrifugering ble utført i 30 minutter ved en relativ sentrifugalkraft på 1500 eller 3000 g slik som angitt i tabell I.

På dette punkt i fremgangsmåten som ble brukt i forbindelse med noen av prøvene (heretter benevnt som "3" innledningsfremgangs-måte) ble en 10 ml's sprøyte innført gjennom bunnproppen for å ta ut 6,7 ml rest-blodprøve. Derpå ble sentrifugeringsartikkel 20 gjort til gjenstand for blanding i en vortex-blander i

1/2 til 2 minutter. Etter blandetrinnet ble 1,5 ml av det tilblandede filtermedium og den del av blodprøven som er tilbake i artikkel 20 fjernet ved en-vanlig sprøyte med påsatt nål. I andre prøver ble trinnet som fjernet en hoveddel av rest-blod-prøven etter sentrifugering ikke benyttet, I dette tilfelle

ble 1,5 ml av det flytende filtermedium og blodprøven som er nær bunnproppen tatt ut fra bunnen av sentrifugeringsartikkel 20 direkte etter sentrifugering. 1,5 ml som omfattet en blanding av flytende filtermedium og restblodprøve samt de oppsamle-te mikrobiologiske patogener ble deretter blandet etter å ha blitt tatt ut fra artikkel 20 i rekkefølge for å gi en relativt jevn fordeling av komponentene ved anbringelse av prøven på plate. Forskjellen i disse to fremgangsmåtene er indikert i tabell I under betegnelsen "Antall innføringer" som betegner hver for-søksprøve som ifølge fremgangsmåten har enten to eller tre inn-føringer. I tilfelle av tre innføringer er den første innføring for injisering av blodprøven, den andre innføring for fjerning av hoveddelen av blodprøven etter sentrifugering men før blanding, og den tredje innføring er for uttak av det gjenværende væskefiltermedium og den gjenværende del av blodprøven. I de to innføringsfremgangsmåter er den første innføring for injeksjon av blodprøven i artikkel 20 og den andre innføringen er for uttak fra bunnen av sentrifugeringsartiklen 20 av nær 1,5 ml til-blandet væskefiltermedium og blodprøve.

I begge tilfeller, enten to eller tre innføringsmetoder

ble anvendt, ble 5 prøver som inneholdt 0,3 ml hver av de 1,5 ml tatt ut fra bunnen av artikkel 20 satt på 5 forskjellige plater. Etter inkubering ble disse prøvene.sammenlignet med kon-trolplater fremstilt ved å tilsette den samme kjente mengde mikrobiologiske patogener som ble injisert i den prøvede blodprø-ven til en saltløsning og 0,3 ml av denne saltløsning satt på plate på hver av 5 agar-plater. Prosent gjenvinning basert på sammenligningen av prøveplatene for kontrollplatene er oppført i tabell I.

Fremgangsmåten som ble anvendt med hensyn til hver blodprøve

som ble prøvet ved bruk av underlagsvæsketeknikken var som følger. En sentrifugeringsartikkel 20 ble fremstilt ved å bruke enten en propp med horisontal eller vinklet bunn som ovenfor nevnt. Hver sentrifugeringsartikkel 20 som ble brukt i under-lagsvæskefremgangsmåten inneholdt 0,3 ml "Fluorinert FC-48".

7 ml lysert blod som hadde blitt blandet med et kjent antall mikrobiologiske patogener ble deretter injisert gjennom topp-proppen på artikkel 20. Det neste trinnet var å sentrifugere hver av artiklene 20 i den samme vinkelrotorsentrifuge som ble anvendt ved den flytende filtermediumsteknikken. Sentrifugerings-tiden var 30 minutter og den relative sentrifugalkraften som ble pålagt var 1500 g eller 3000 g som vist i tabell I. Når 3 inn-føringsteknikker ble anvendt, ble nær 5,8 ml rest-blodprøve tatt ut ved innføring av en 10 ml's sprøyte gjennom bunnproppen. Når de 2 innføringssystemer ble anvendt, ble ingen slik innføring eller uttak gjort. I hvert tilfelle ble 1,5 ml, omfattende nær 1,2 ml rest-blodprøve og 0,3 ml "Fluorinert" tatt ut fra bunnen av sentrifugeringsartikkel 20. 5 prøveplater ble derpå fremstilt ved bruk av 0,3 ml av den tilblandete rest-blodprøve og "Fluorinert"! hvert tilfelle. Disse prøveplatene ble inkubert og deretter sammenlignet med kontrollplater som var blitt fremstilt på samme måten som ovenfor omtalt i forbindelse med den flytende filtermediumteknikken. Prosent gjenvinning ved anvendelse av underlagsvæsketeknikken ble derpå utregnet og oppført i tabell

I.

Selv om en eksakt teori for å forklare de erholdte data som følge av dette eksperiment ikke kan oppsettes, kunne den lave gjenvinningsgraden av prøve 2 i tabell I (hvor den flytende filtermediumteknikken ble benyttet ved bruk av 50% sukrose og en horisontal bunnpropp) være et resultat av mikrobiologiske patogener som blir fanget langs den indre kanten av den horisontale bunnproppen nær veggen i sentrifugeringsartikkel 20.

Ved å sammenligne resultatene i prøve nr. 1 med dem i prøve nr. 3, som igjen anvendt den flytende filtermediumteknikk og en horisontal propp, men ikke ble gjennomført ved bruk av 3 inn-før ingsf remgangsmåten , vil det sees at gjenvinningsgraden av prøve nr. 3 er sterkt forbedret. Dette kunne forklares ved det faktum at fordi mindre relativ sentrifugalkraft ble pålagt, ble de mikrobiologiske patogener ikke så sterkt presset ned i spal-ten mellom bunnproppen og veggene i artikkel 20. Videre tillater 3 innføringsteknikken gjenvinning av alle mikrobiologiske patogener som er blitt resuspendert i den gjenværende del av blodprøven. Når 2 innføringsfremgangsmåten anvendes kan noen av de resuspenderte mikrobiologiske patogener bli tilbake i den gjenværende del av blodprøven.

En sammenligning av prøve nr. 15 med prøve nr. 17 viser de forbedrete resultater som er mulig ved å anvende underlagsvæsketeknikken ifølge foreliggende oppfinnelse. I prøve nr. 15, som i prøve nr. 17, ble en horisontal bunnpropp anvendt, antallet innføringer var 3, og den relative sentrifugalkraft var den samme som i prøve nr. 17 (3000). De forbedrete resultater ved bruk av underlagsvæsketeknikken antas å være et resultat av bruken av underlagsvæske som ikke tillater mikrobiologiske patogener å gå gjennom dette og gå tapt på grenseflaten mellom veggene til artikkel 20 og bunnproppen.

Videre, en sammenligning av prøve nr. 9 med prøve nr. 11 viste fordelene som oppnåes ved å anvende en vinkelpropp sammenlignet med den horisontale bunnproppen. Da betingelsene og teknikkene i prøvene nr. 9 og 11 er fullstendig identiske bortsett fra det faktum at i prøve nr. 11 ble en vinklet propp anvendt, kan den foreliggende forbedring i gjenvinningsgrad i prøve nr. 11 frem for prøve nr. 9 bare tilskrives bruken av en vinklet bunnpropp anbragt med en vinkel med hensyn til veggene i artikkel 20 som er komplementær til den vinkel ved hvilken artikkel 20 ble sentrifugert. En sammenligning av prøve nr. 10 og prøve nr. 12 illustrerer på lignende måte de forbedrete resultater som ble oppnådd ved å anvende en vinklet bunnpropp ved høyere relative sentrifugalkrefter (3000). For å vise at "Fluorinert" som ble brukt i foreliggende oppfinnelse, var ikke-toksisk og at triklortrifluoretan som ble brukt i US patent 3.087.364, var toksisk, ble det fremstilt like deler av "Fluorinert FC-48" i en serie og triklortrifluoretan i en annen serie med bakterier oppslemmet i en næringsvæske (trypticase soyavæske). "Fluorinert FC-48" hadde en densitet på 1,9 4 g/cm , en molvekt på ca. 52 5 og et kokepunkt på 174°C. Henholdsvis "Fluorinert" eller triklortrifluoretan ble forsiktig blandet med bakteriene i nærings-vaesken over et tidsrom på 4 timer. Deretter ble prøver av væskefasen av hvert materiale plassert på næringsagar (trypticase soyaagar) for å sikre en avløftbar telling som viste den relative toksisiteten til disse materialer. Resultatene er angitt i tabell 2 nedenfor.

Tabell 2 viser klart at triklortrifluoretan er meget toksisk overfor disse organismer, mens "Fluorinert" ikke er det.

I nærvær av triklortrifluoretan var antallet levedyktige bakterier alltid mindre enn den opprinnelige nullkontroll-telling - den forårsaket dødelighet. Når på den annen side "Fluorinert" ble anvendt, var bakteriene i stand til å vokse i nærvær derav, og etter 4 timer hadde antallet levedyktige bakterier øket til mellom 3 og 23 ganger. Videre har rekon-

f struksjonseksperimenter med 21 forskjellige patogene mikro-' organismer vist at blodkulturbæreren som inneholder "Fluori-nert" ikke var toksisk overfor noen av disse mikroorganismer .

Da underlagsvæsken dertil må pålegges et trykk på 62,5 cm

Hg inne i vakuumrøret, blir triklortrifluoretanet pålagt

62,5 cm Hg trykk og det fordampes fullstendig hvilket betyr at det ikke kan være en væske under de betingelser hvorunder underlagsvæsken i foreliggende oppfinnelse skal brukes.

En prøve av diklortetrafluoretan som ble anvendt i eksempel 17(d) i US patent 3.087.365 leveres i en sylinder da det bare foreligger i væskeform ved temperatur under +4 C. Denne forbindelse kan åpenbart ikke brukes som underlagsvæske i foreliggende oppfinnelse.

De halogenerte hydrokarbonløsningsmidler som er beskrevet: i US patent 3.087.365 er toksiske forbindelser overfor patogene mikroorganismer (slik de må være for å virke som ekstraksjons-.løsningsmiddel innenfor rammen av ovennevnte US patent), og de er videre flyktige og ikke-væskeformige når de anbringes i et vakuumrør. Det som kreves av underlagsvæsken i foreliggende oppfinnelse er at den ikke er giftig ovenfor patogene mikroorganismer, er hydrofob, ublandbar med vann og kan bære væskeprøven inn i røret. Selv om 'Fluorinert" materiale som er beskrevet ovenfor har disse egenskaper, har også andre materialer disse egenskaper såsom metyl- og fenylsubstituerte polyoksysiloksaner som ._ . Tsilicone DC 550<*>

Dette materialet er påvist å virke som underlagsvæske i foreliggende oppfinnelse fordi det ikke er giftig overfor patogene mikroorganismer, hydrofobt, ikke-blandbart med vann og kan bære væskeprøven. Dette materialet oppsamler effektivt de patogene mikroorganismer ved grenseflaten mellom væskeprøven og underlagsvæsken. For videre å vise at "Silicone DC 55o"ikke er toksisk og den relative toksisiteten til "Fluorinert" til "Silicone DC 55o" ble det fremstilt flere prøver hvor 2 ml trypticase soyavæske ble Inokulert med de nødvend-ige mikroorganismer som er beskrevet i tabell 3 nedenunder og deretter ble tilsatt hver 2 ml "Fluorinert" eller 2 ml Silicone DC 550". Rørene ble rørt 4 timer og så oppbevart ved 36°C. Forsøksresultatene er angitt i tabell 3 nedenunder.

For videre å påvise at triklortrifluoretanet ikke på noen

måte er ekvivalent med underlagsvæsken i foreliggende oppfinnelse, ble to ytterligere forsøksserier foretatt. I hver serie ble en lik mengde fysiologisk saltvann inneholdende vegetative celler og sporer inneholdende Bacillus subtilis celler satt

til en ekvivalent mengde triklortrifluoretan i en serie og "Fluorinert FC-4 8"i en annen serie. Rørene ble kraftig blandet i 3 minutter og man fant følgende:

A. Triklortrifluoretan - 3 faser ble dannet:

1. Et øvre vandig turbid sjikt som inneholdt hovedsakelig vegetative celler. 2. En meget tett grenseflate som hovedsakelig inneholdt sporer som var blitt frigjort fra de sporeholdige celler, 3. En klar triklortrifluoretanfase uten sporer, inklusjonslegemer av vegetative celler.

B. "Fluorinert" - to faser ble dannet:

1. En øvre turbid og vandig fase inneholdende vegetative celler og sporeholdige celler. 2. En vandig "Fluorinert*emulsjonsfase inneholdende vegetative celler og sporeholdige celler. ;13et erholdtes ikke separasjon *av vegetative celler fra de sporeholdige celler eller sporer alene.

Det er åpenbart at den type løsningsmidler som brukes i US patent 3.087.365 ikke er underlagsvæsker som ikke er toksiske overfor patogene mikroorganismer, hydrofobe, ublandbare med vann og i stand til å bære en væskeprøve i et rør, fordi disse materialer er meget toksiske overfor bakterieorganismer og meget flyktige.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte ved påvisning av patogene mikroorganismer i en væskeprøve, hvori væskeprøven plasseres innenfor en avgrenset steril sentrifugeringssone og sentrifugeres for derved å tvinge væskeprøven mot et flytende medium som er ikke-toksisk for de patogene mikroorganismer og har en større densitet enn væskeprøven, og mottas av dette medium, og væskemediet og de patogene mikroorganismer deretter separeres fra sentrifugeringssonen og analyseres med hensyn på disse patogene mikroorganismer, karakterisert ved at væskeprøven ved sentrifugering i sentrifugeringssonen tvinges mot en underlagsvæske omfattende et inert fluorert hydrokarbon med en densitet i området 1,2 -til 2,0 g/cm 3 og en molekylvekt i omradet 300-850 hvilket er ikke-toksiskt for de patogene mikroorganismer, hydrofobt, ikke-blandbart med vann og har en større densitet enn væskeprøven og derved kan bære væske-prøven, idet hovedsakelig ingen av de patogene mikroorganismer kan passere gjennom underlagsvæsken, hvorved hovedsakelig alle patogene mikroorganismer går gjennom væskeprøven og oppsamles ved grenseflaten mellom væske-prøven og underlagsvæsken.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender et fluorert hydrokarbon med et kokepunkt fra 93°C til 215°C.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at sentrifugeringen utføres i en vinkelsentrifuge og underlagsvæsken bæres av en overflate i den avgrensede sterile sentrifugeringssone som har en skrå vinkel deri som er komplementær til den vinkel som den avgrensede sterile sentrifugeringssone er plassert i i vinkelsentrifugen mens sentrifugeringen utføres, idet overflaten er slik plassert at væskeprøven tvinges mot underlagsvæskens overflate i en hovedsakelig loddrett vinkel på denne under sentrifugeringen. I

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert' ved at sentrifugeringen utføres i en kurvsentrifuge og underlagsvæsken bæres av en plan innvendig overflate i den avgrensede sterile sentrifugeringssone, slik at væskeprøven tvinges mot den flytende underlagsvæskens overflate i en hovedsakelig perpendikulær vinkel til denne plane overflate under sentrifugeringen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at underlagsvæsken og de oppsamlede patogene mikroorganismer fjernes fra den sterile sone ved først å fjerne hoveddelen av væskeprøven derfra og deretter fjerne en resterende blanding av resten av væskeprøven, de patogene mikroorganismer og underlagsvæsken, hvori underlagsvæsken foreligger i mengde fra 3,3 til 30 volum-% derav.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for påvisning av patogene mikroorganismer i blod, karakterisert ved at man anbringer et væskeprøvebehandlingsmedium omfattende et blodlysemiddel i en vandig løsning i sentrifugeringsbeholderen i kontakt med underlagsvæsken, væskeprøven blandes med væskeprøvebehandlingsmediet for behandling av førstnevnte og den avgrensede sterile sone sentrifugeres deretter, hvorved væskeprøven tvinges mot underlagsvæsken og hovedsakelig alle de patogene mikroorganismer oppsamles ved grenseflaten mellom væskeprøven og underlagsvæsken.

7. Anordning for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter en lukket sentrifugebeholder (20) som er selvtettende lukket med lukningsorganer (24) og (26), hvorunder beholderens indre del omfatter et tomt rom (32) som holdes på et trykk under atmosfæretrykket, et inert fluorert hydrokarbon med en densitet på 1,2 til 2,0 g/cm , et kokepunkt på 90-210°C og en gjennomsnittlig molekylvekt på 300 til 850, som befinner seg på bunnen derav og ikke er giftig, er ikke-blandbart med vann, er hydrofobt og danner et sjikt, hvilken væske er i stand til å oppsamle hovedsakelig alle de patogene j mikroorganismer som skilles ut fra den væskeformige prøjvenj uten at noen <p>atogene mikroorganismer går tapt i sentri-fugerørets mellomrom.

8. Anordning ifølge krav 7, karakterise n-t v e d at væsken (28) som danner et sjikt foreligger i en mengde på 3,3 til 30,0 volum-%, fortrinnsvis 4,7 til 2 8,6 volum-%.

9. Anordning ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at væsken (28) som danner et sjikt er et inert, væskeformig fluorert hydrokarbon med en densitet på 1,7 til 2,0 g/cm"^, et kokepunkt på 125 til 200°C og en gjennomsnittlig molekylvekt på 350 til 600.

10. Anordning ifølge ett av kravene 7 til 9, karakterisert ved at den omfatter: a) en lukket sentrifugebehoIder (20) med en nedre og en øvre del, hvilke er selvtettende lukket med lukningsorganet (24) og (26) hvorigjennom en injeksjonsnål kan stikkes, b) et lukningsorgan (26) som befinner seg i den nedre del, hvis øvre flate danner en skrå vinkel med sentrifuge-røret (22) hvilken vinkel er komplementærvinkeleh til den sentrifugerte sentrifugebeholder, c) en effektiv mengde av et inert fluorert hydrokarbon med en densitet på 1,2 til 2,0 g/cm 3, et kokepunkt på 90 - 210°C og en gjennomsnittlig molekylvekt på 300-850, og somjar ikke-giftig, ikke-blandbartmed vann, hydrofobt og danner et sjikt og befinner seg på sentrifugebeholderens (20) bunn, og d) en effektiv mengde av et ikke-giftig oppdelingsmiddel (30) som befinner seg i sentrifugebeholderen (20).

11. Anordning ifølge krav 10, karakterisert ved at lukningsorganets (26) øvre flate saumen med séntrifuge-røret dannet en vinkel på 30 til 80°, fortrinnsvis 34°.