SE447485B - Forfarande vid bestemning av patogena mikroorganismer samt anordning for anvendning vid forfarandet - Google Patents

Description

4-47 485 k) att läkaren vet så snabbt som möjligt inte endast huruvida patienten lider av septikemi utan även identiteten för de ifrågavarande mikro- organismerna och dessas reaktion på antibiotiska medel. Riktig och i tid utförd diagnos av septikemi beror sålunda på en mycket hastig och effektiv kvantitativ analys av patientens blod. Vidare är det av bety- delse under den kvantitativa analysen av patientens blod att blodprovet inte förorenas av patogener från laboratoriet.

Tre analytiska system har konventionellt använts för att be- stämma närvaron av mikroorganismer i en kroppsvätska. Dessa konven- tionella system innefattar den teknik som arbetar med flytande buljong- kultur, den s.k. "hä1lplattmetoden“ och filtreringsmetoden med använd- ning av ett fast matrixfilter. Vart och ett av dessa system har sina olägenheter och inget av dessa möjliggör hastig påvisning av mikro- organismer i blodprovet. Helt allmänt är flytande buljong-metoden inte kvantitativ och hällplattmetoden och filtreringsmetoden (med användning av ett fast matrixfilter) är öppna system som kan kontamineras utifrån! t.ex. genom införing av patogener i kulturen från laboratorieatmosfä- ren och personalen. _ Helt nyligen har en förbättrad-metod och apparatur utvecklats för bestämning av närvaro av mikrobiella organismer i ett vätskeprov innefattande exempelvis blod. Denna metod beskrives i den amerikanska patentskriften 3 928 139. - Enligt denna förbättrade metod åstadkommas en hastig och kvanm titativ påvisning av mikrobiella patogener i ett prov av en kropps- vätska genom användning av ett vätskefiltermedíum. Vätskeprovet placer: på det flytande filtermediet inom en begränsad steril zon. Vätskefiltei mediet har en densitet som är större än vätskeprovets och innefattar -en steril vattenlösning, som selektivt mottar mikrobiella patogener frs vätskeprovet. Den begränsade sterila zonen underkastas därefter centri» fugering för att bringa vätskeprovet mot vätskefiltermediet och föror- saka att mikrobiella patogener selektivt passerar in däri och därvid separeras från kroppsvätskeprovets massa. Därefter separeras vätske- filtermediet innehållande de mikrobiella patogenerna från återstoden ar vätskeprovet och portioner av vätskefiltermediet underkastas olika kulw turbetingelser.

Den ovan beskrivna förbättrade metoden utgör ett mycket hastig och effektivt sätt för separation av mikrobiella patogener från ett. vätskeprov. Enligt den föredragna utföringsformen för den flytande vätskefiltermetoden lyseras blodprovet före centrifugeringssteget, vil* ket förorsakar att de mikrobiella patogenerna selektivt mottages av det 3 447 485 flytande filtermedietfi Andra förbehandlingsmedel såsom anti-koaguleran- de medel användas även för framställning av blodprovet. Vissa komponen- ter i det föredragna flytande filtermedíet som användes vid den för- bättrade metoden som diskuterats ovan är icke kombinerbara med vissa av förbehandlingsmedlen och/eller lyseringsmedlen. Vidare blandas sådana medel med vätskefiltermediet om de tillsättes därtill före den tidpunkt vid vilken blodprovet tillsättes i den begränsade sterila zonen och när de en gång blandats kan sådana medel inte avlägsnas från vätskefilter- mediet hastigt nog för att effektivt behandla blodet. Det är därför nödvändigt att antingen utsätta blodproven för möjligheten för yttre kontamination genom blandning av blodprovet med förbehandlingsmedlen och/eller lyseringsmedlen före införing av provet i ett slutet sterilt system, eller också kan man använda en speciell apparatur, varvid behandlingsmedlen kan förefinnas i det slutna systemet, men avskilt från vätskefiltermediet tills apparaten tages i bruk. Apparatur av denna typ anges i de amerikanska patentskrifterna 3 875 012 och 3 932 222.

Den ovan beskrivna förbättrade metoden för påvisning av mikro- biella patogener i blodprov innefattar vidare användning av ett vätske- filtermedium i ett centrifugeringskärl, vilket innefattar en förslut- ningsanordning, varigenom injektion kan utföras, vid kärlets slut mot vilket blodprovet och vätskefiltermediet pressas genom centrifuge- ringen. Det har visat sig att vissa av de tyngre mikrobiella patoge- nerna som mottages av vätskefiltermediet kan passera, under inverkan av den kraft som åstadkommas av centrifugeringen, fullständigt genom vätskefiltermediet och kommer då att förefinnas vid centrifugerings- kärlets botten, och om inte stor försiktighet iakttages under separa- tionen och utvinningen av vätskefiltermediet kan vissa av dessa mikro- biella patogener bli kvar oupptäckta. Det antages att förlusten av mikrobiella patogener i sådana fall förekommer på grund av att de mikrobiella patogenerna, när de passerar fullständigt genom vätske- filtermediet, fastnar i den smala springa som bildas mellan centri- fugeringskärlets vägg och förslutningsanordningen varigenom injektion kan utföras.

Det är sålunda önskvärt att åstadkomma en sluten steril metod för separation och koncentrering av mikrobiella patogener, som antages förefinnas i ett blodprov, utan att det är nödvändigt att i förväg blanda blodprovet i en potentiellt kontaminerande omgivning och utan att det är nödvändigt att använda speciellt konstruerad apparatur för att åstadkomma förfarandets förbehandlingssteg. Vidare är det särskilt 447 485 önskvärt att öka utvinningen av de mikrobiella patogenerna som selek- tivt separerats och koncentrerats från ett vätskeprov.

Enligt föreliggande uppfinning tillhandahålles ett förfarande för påvisning av mikrobiella patogener, som antages förefinnas i ett vätskeprov. Närmare bestämt avser uppfinningen ett förfarande för på- visning av mikrobiella patogener, som antages vara närvarande i ett vätskeprov, genom centrifugering av en begränsad steril zon inne- hållande vätskeprovet, varvid centrifugeringen av vätskeprovet utföres i närvaro av ett icke-toxiskt, med vatten icke blandbart flytande dämpningsmedel med hög densitet, vars densitet är högre än provvätskans densitet, så att man bringar väsentligen samtliga mikrobiella patogener att passera ut ur provvätskan. Förfarandet enligt uppfinningen känne- tecknas av att de mikrobiella patogenerna genom centrifugeringen tvingas att inträda i nämnda dämpningsmedel men inte passera därigenom, så att den övervägande andelen av de närvarande patogenerna koncentre- ras i nämnda dämpningsmedel och i skiljeytan mellan nämnda dämpnings- medel och provvätskan. Patogenerna i dämpningsmedlet och den ringa mängd provvätska, som ligger intill skiljeytan mellan dämpningsmedlet och provvätskan, separeras sedan från den övre delen av provvätskan ett de sålunda uppsamlade patogenerna bestämmes på i och för sig känt sätt: Förfarandet kan användas i samband med samtliga typer av kroppsvätskor, såsom blod, benmärg, spinal- och pleuralvätska, urin och liknande.

Dessutom kan förfarandet användas på varje prov innehållande mikroorga- nismer för att koncentrera och separera mikroorganismerna från anti- mikrobiella faktorer som eventuellt är närvarande i vätskeprovet,' exempelvis livsmedel, såsom mjölk och liknande. När förfarandet använ- des i samband med ett blodprov, innefattar det helt allmänt avsättning av ett lyserat blodprov på ett relativt tunt skikt av ett icke-toxiskt, med vatten icke blandbart, hydrofobt, flytande dämpningsmedel med hög densitet. Sådana dämpníngsmedel är kombinerbara med lyserande och andra blodbehandlingsmedel och dessa medel separerar hastigt från dämpnings- medlet i blandning därmed. För att undvika möjlig kontamination kan sålunda ett blodprov företrädesvis injiceras i en steril, begränsad zon, innehållande både dämpningsmedlet som beskrivits ovan och en effektiv mängd av ett lyserande och/eller något annat blodbehandlingsmedel, så att blodprovet behandlas in situ. Det lyserade blodprovet, som före- finnes inom den begränsade sterila zonen, underkastas därefter centri- fugering, som tvingar hlodprovet mot dämpníngsmedlet som likaledes 447 485 förefinnes däri. Det har visat sig att efter sådan centrifugering kommer väsentligen alla de mikrobiella patogener som förefinnes i ett lyserat blodprov att passera ut ur suspension och tillvaratages i ett skikt som ligger intill skiljeytan mellan dämpningsmedlet och blod- provet i sig. De mikrobiella patogenerna kommer i realiteten att penetrera skiljeytan mellan dämpningsmedlet och blodprovet och inträda i dämpningsmedlet eller förbli på ytan eller intill ytan av dämpnings- medlet och ingen eller väsentligen ingen del därav passerar fullstän- digt genom dämpningsmedlet. Detta står i motsats till användningen av ett vätskefiltermedium, som selektivt mottager mikrobiella patogener och genom vilket vissa av mikroorganismerna kan passera fullständigt och bli inneslutna mellan centrifugeringskärlets vägg och förslut- ningsanordningen varigenom injektion kan utföras. Det skikt av mikro- biella patogener som bildas enligt föreliggande uppfinning kan därefter tillvaratagas utan väsentlig förlust genom separation av dämpnings- medlet och en ringa andel av det kvarvarande blodprov, som förefinnes intill skiljeytan mot dämpningsmedlet, från huvuddelen av provet.

Närvaron av dämpningsmedlet under centrifugeringen av det lyserade blodprovet möjliggör sålunda att mikrobiella patogener separeras från det lyserade blodprovet såväl som från eventuellt närvarande läkemedel och antipatogena faktorer däri. Efter tillvaratagandet kan de mikro- biella patogenerna analyseras både kvantitativt och kvalitativt.

Enligt föreliggande uppfinning åstadkommes sålunda ett icke- toxiskt, med vatten icke blandbart, hydrofobt flytande dämpningsmedel med hög densitet för utvinning och separation av mikrobiella patogener från ett vätskeprov i en centrifugeringszon. Det har visat sig att användning av ett sådant dämpningsmedel antingen enbart eller till- sammans med ett vätskefiltermedium medför en väsentligt ökad utvinning av mikrobiella patogener, som har separerats från ett blodprov. Helt allmänt kan man såsom dämpningsmedel använda inerta vätskor, som är icke-toxiska för mikrobiella organismer och som är icke blandbara med vatten samt är hydrofoba och uppvisar hög densitet, dvs. en densitet som är högre än provvätskans densitet. Det antages att dessa dämpnings- medel på grund av sin höga densitet ger en dämpande effekt på mikro- biella patogener, som tvingas att passera ut ur suspension i ett blod- prov vid centrifugering. De mikrobiella patogenerna uppfångas och tryckes mot skiljcytan mellan blodprovet i sig och dämpníngsmedlet.

På detta sätt förloras inte mikrobiella patogener till mellanrum, som 447 485 kan förefinnas på ytan av den begränsade sterila zonen, mot vilken de tvingats genom centrifuqeringen.

Enligt en ytterligare utföringsform av uppfinningen åstad- kommes en ny anordning för utvinning av mikrobiella patogener ur ett vätskeprov.

Närmare bestämt avser uppfinningen en anordning för användning vid förfarandet enligt uppfinningen för påvisning av mikrobiella pato- gener, som antages vara närvarande i en provvätska. Anordningen inne- fattar en innesluten centrifugeringsbehållare, som är förseglingsbart försluten med en förslutningsanordning varigenom injektion kan utföras, varvid behållarens inre innefattar ett evakuerat utrymme, som hålles vid ett tryck som är lägre än atmosfärstrycket, gränsande därtill ett icke-toxiskt, med vatten icke blandbart flytande dämpningsmedel med hög densitet, varvid nämnda dämpningsmedel har en densitet som är högre än provvätskans densitet. Anordningen kännetecknas av att dämpningsmedlet kan uppsamla väsentligen samtliga mikrobiella patogener som passerar ut ur suspensionen från provvätskan utan förlust av mikrobiella patogener till springor eller utrymmen i nämnda centrifugeringsbehållare.

Den nya anordningen uppvisar en slät, kontinuerlig yta inuti en centrifugeringsbehållare, så att vid centrifugering av centrifu- geringsbehållaren det vätskeprov som centrifugeras tvingas mot ytan väsentligen i rät vinkel. Ytan utgöres av den inre änden av en förslut- ningsanordning, varigenom injektion kan utföras, för behållaren, som uppvisar det ovan beskrivna dämpningsmedlet beläget därpå. Dämpnings- medlet fördelas på den inre ytan av nämnda förslutningsanordning, varigenom injektion kan utföras, och fyller de springor och mellanrum, som kan förefinnas mellan centrifugeringskärlets vägg och förslut- ningsanordningen, varigenom injektion kan utföras, för att förhindra inneslutning av några av de tyngre mikrobiella patogener, som kan passera till dämpningsmedlet under centrifugeringen. När man använder en contrifug av typen "svängande korg" skall den inre ytan av förslut- ningsanordningen, varigenom injektion kan utföras, vara vinkelrät mot bottnen av nämnda förslutningsanordning. När en vinkelrotorcentrifug användes är vidare den släta inre ytan av förslutningsanordningen, varigenom injektion kan utföras, belägen inuti centrifugeringsbehålla- ren vid en vinkel, som utgör komplementvinkeln till den vinkel, vid vilken centifugeringen sker. Denna unika konstruktion möjliggör använd- ning av vanligt förekommande vinkelcentrifuger och resulterar i reali- 447 485 teten i en kortare väglängd för patogenerna genom vätskeprovet innan de centrifugeras mot dämpningsmedlets inre yta. Denna kortare våglängd resulterar i en större medelkraft (g-kraft) som påföres de mikrobiella patogenerna inom vätskeprovet. Centrifugering med detta unikt konstrue- rade centrifugeringskärl resulterar i att patogenerna koncentreras nära skiljeytan mellan dämpningsmedlet och vätskeprovet och delvis på cent- rifugeringsbehållarens sidovägg. De så koncentrerade mikrobiella patogenerna uppsamlas och avlägsnas lätt från centrifugeringskärlet.

Genom att anordna ytan inuti centrifugeringsbehållaren vid en sådan vinkel att blodprovet och dämpningsmedlet tvingas mot ytan i en väsent- ligen rät vinkel under centrifugeringen säkerställes att dämpnings- medlet fördelas väsentligen likformigt över ytan, så att eventuella springor och liknande som uppfångar mikrobiella patogener fullständigt tillslutes. Ett sådant arrangemang ger kortare väg för patogenerna och sålunda större medelcentrifugalkraft på patogenerna för åstadkommande av en mer effektivt koncentrerad avsättning av dessa, vilken lätt kan avlägsnas ur centrifugeringskärlet. Användningen av denna speciellt konstruerade centrifugeringsanordning resulterar vidare i ökad centri- fugeringseffektivitet, emedan centrifugeringen kan utföras vid lägre g-värden inom samma tidsperiod som vid konventionell centrifugering eller vid samma g-värden på en kortare tidsperiod än vid konventionellt förfarande.

Enligt en föredragen utföringsform av uppfinningen kan vidare blodlyserande och andra blodbehandlingsmedel, som användes för att framställa ett blodprov, placeras i en vattenlösning inuti centrifuge- ringskärlet i kontakt med det flytande dämpningsmedlet. Det flytande dämpningsmedlet har högre densitet än nämnda vattenlösning och är hydrofobt och med vatten icke blandbart och kommer därigenom att upp- bära vattenlösningen. Om centrifugeringskärlet skakas under lagring och transport, blandas vidare det lyserande medlet eller något annat blod- behandlingsmedel med dämpningsmedlet. När centrifugeringskärlet under- kastas centrifugering separerar (sedimenterar) emellertid det flytande dämpningsmedlet med hög densitet och medger blodbehandlingsmedlen att blandas med blodprovet inuti kärlet. Detta utgör en stor fördel i jäm- förelse med de ovan beskrivna konventionella flytande filtermedierna, vilka innehåller komponenter som icke är kombinerbara med vissa blod- behandlingsmedel, och eftersom de konventionella flytande filterme- dierna är baserade på vatten, blandas de vidare med de vattenhaltiga 447 485 blodbehandlingsmedlen om de två materialen är i kontakt med varandra och hindrar dem från att effektivt diffundera därifrån och inverka på ett blodprov som förefinnes i kärlet.

Uppfinningen kan lätt förstås på basis av de bifogade rit- ningarna, vari fig. 1 utgör en tvärsektionsvy av den föredragna centrifuge- rinqsanordningen enligt uppfinningen; och fig. 2 - 9 visar steg i det förbättrade förfarandet för påvis- ning av míkrobiella patogener med användning av anordningen enligt fig. l.

Nedan beskrives en föredragen utföringsform av den förbättrade centrifugeringsanordningen enligt uppfiningen under hänvisning till fig. 1. Såsom visas, utgöres anordningen 20 av ett förlängt, rörformigt centrifugeringskärl 22 uppvisande en konventionell förslutningsanord- ning 24, varigenom injektion kan utföras, som förseglingsbart till- sluter dess övre ände, samt en ny förslutningsanordning 26, varigenom injektion kan utföras och som förseglingsbart tillsluter den lägre änden därav. När anordningen 20 skall användas vid den föredragna ut- föringsformen av förfarandet för påvisning av mikrobiella patogener enligt uppfinningen kan en effektiv mängd av ett dämpningsmedel 28 sam: blodbehandlingsmedlen 30 förefinnas däri.

Centrifugeringskärlet 22 kan vara tillverkat av silikonerat glas eller hårdplast, t.ex. polykarbonat eller polypropen. Förslut- nings-anordningarna 24 och 26, varigenom injektion kan utföras, kan bestå av självtillslutande gummiproppar. Förslutningsanordningarna 24 och 26, varigenom injektion kan utföras, uppvisar båda inskärningar 24a resp. 26a för att underlätta injektion med användning av vanligt före- kommande medicinska injektionsnålar. Det evakuerade utrymmet 32 hålles vid ett lägre tryck än atmosfärstrycket och vid ett förutbestämt värde, så att centrifugeringskärlet kan mottaga en känd vätskemängd genom injicering genom förslutningsanordningen 24, varigenom injektion kan utföras, utan att ett alltför högt tryck uppbygges i det inre därav, vilket skulle kunna åstadkomma att förslutningsanordningarna 24 och 26, varigenom injektion kan utföras, förskjutes från centrifugeringskär- lets 22 öppningar.

Med avseende särskilt på förslutningsanordningen 26, varigenom injektion kan utföras, vid den lägre änden av centrifugeringskärlet 22 bör observeras att den inre ytan 34 av förslutningsanordningen 26 är belägen vid en vinkel i förhållande till centrifugeringskärlets 22 väggar. 447 485 Det bör observeras att anordningen 20 är speciellt anordnad för att användas inuti en vinkelrotorcentrifug och att vinkeln för den inre ytan 34 utgör komplementet till rotorns vinkel. Det bör emellertid observeras att anordningen enligt föreliggande uppfinning kan användas i en konventionell Centrifug av typen svängande korg. I det senare fallet skall ytan 34 vara vinkelrät mot bottnen av anordningen 20 och användes i övrigt på samma allmänna sätt som beskrives nedan för anordningen 20, som visas i fig. l. Ytan 34 skall vara slät och väsentligen fri från springor och sprickor, vari mikrobiella patogener kan inneslutas. Den cirkulära förseglingsytan runt ytan 34, där materialet i förslutninge- anordningen 26, varigenom injektion kan utföras, möter centrifugerings- kärlets 22 väggar, skall vara tätt förseglad, så att skiljeytan inte utgör en stor cirkulär springa, vari mikrobiella patogener kan inkomma.

Lutningsvinkeln för den släta ytan 34 i förhållande till centrifugeringskärlets 22 väggar bestämmas alltefter den centrifuge- ringsanordning, vari anordningen 20 skall centrifugeras.

Såsom diskuterats ovan, är det så att när en Centrifug av typen svängande korg användes, kommer ytan 34 att vara vinkelrät mot bottnen av anordningen 20. När emellertid en vinkelrotorcentrifug användes upp- visar ytan 34 komplementvinkeln till rotorns vinkel. När rotorvinklarna varierar från ungefär 60° till l0° kommer sålunda i allmänhet vinkeln *för ytan 34 eller lutningsvinkeln 36 inom centrifugeringskärlet att på motsvarande sätt variera från 30° till 80°. Lutningsvinkeln som åskåd- liggöres medelst hågen 36 är sålunda i allmänhet komplementvinkeln till den vinkel, vid vilken anordningen 20 vilar inom centrifugen under centrifugeringen. Exempelvis är lutningsvinkeln 36 i fig. l ungefär 34°.

När sålunda anordningen 20 placeras i en vinkelrotorcentrifug, vari centrifugeringen sker vid ungefär 56°, tvingas vätskor som förefinnes i anordningen 20 mot ytan 34 vid en väsentligen rät vinkel.

Det bör observeras att förslutningsanordningen 26, varigenom injektion kan utföras, enligt avbildningen i fig. l är utformad av ett enda gummistycke. Emellertid kan ytan 34 åstadkommas genom användning av en plugg av material intill den inre ytan av en vanlig gummipropp, såsom exempelvis förslutningsanordningen 24, varigenom injektion kan utföras. En sådan plugg kan tillverkas av vilket som helst av ett antal material, vilka ger en slät yta och en god försegling mot centrifuge- ringskärlets 22 vägg, genom vilka injektion kan utföras och vilka är icke-toxiska i förhållande till mikrobiella patogener. Ett sätt att framställa en sådan plugg är att göra detta in situ med användning av 4-47 485 ett material som kan hällas in i centrifugeringskärlet 22 när man förs: infört en vanlig gummipropp, såsom förslutningsanordningen 24, vari- genom injektion kan utföras, i centrifugeringskärlets 22 lägre ände.

Materialet skall vara tillräckligt flytande och ha härdningstider, som 'är tillräckligt långa för att medge att centrifugeringskärlet 22 place~ ras i önskad lutningsvinkel med det resultatet att materialet flyter till den önskade lutningsvinkeln och sedan härdas. Efter härdning ger materialet en slät yta 34 och en god försegling mot centrifugerings- kärlets 22 väggar. Exempel på sådana material är vanliga badkarstät- ningsmedel och silikonbaserade plaster som erhålles i lågviskös flytande form och som härdar till ett elastomert material. Ett exempel på den senare materialtypen är ett silikonbaserat flytande harts som försäljes under handelsnamnet "SYLGARD 134" av Dow Corning, Midland, Michigan, USA. När ett material såsom SYLGARD användes är det ibland tillrådligt att använda en primer på centrifugeringskärlets 22 inre vägg för att säkerställa en god försegling mellan härdad SYLGARD och centrifugeringskärlets 22 vägg. En lämplig primer försäljes under handelsnamnet “DC 1200" av Dow Corning. Sålunda kan man exempelvis framställa en slät lutande yta 34, vilken återges i fig. l som den inre ytan av en enhetlig förslutningsanordning 26, varigenom injektion kan utföras, genom att primer-behandla centrifugeringskärlets 22 inre vägg med en lämplig primer för silikonbaserat harts, såsom "DC 1200", varefter man inför en vanlig gummipropp, såsom den som återges som förslutningsanordningen 24, varigenom injektion kan utföras, häller ett flytande silikonbaserat harts, såsom SYLGARD 134, i centrifuge- ringskärlet 22, placerar hela kärlet i önskad lutningsvinkel och härda: hartset under lämpliga betingelser under bildning av en elastomerplugg med en slät yta 34 med den önskade lutningsvinkeln intill en vanlig gummipropp. Tätningsmassa av badkarstyp och liknande material kan an~ vändas på samma allmänna sätt om så önskas, och den rätta lutnings- vinkeln kan erhållas genom centrifugering av anordningen, som inne- håller det icke-härdade pluggbildande materialet, i en centrifug av den typ vari anordningen skall användas.

När den släta ytan 34 bildats, antingen genom införing av en enhetlig förslutningsanordning 26, varigenom injektion kan utföras, eller genom en kombination av en gummipropp och en plugg av material såsom beskrivits ovan, kan en effektiv mängd av dämpningsmedlet enligt uppfinningen införas i anordningen 20. Den använda mängden dämpnings- 447 485 ll medel skall vara tillräcklig för att fullständigt täcka ytan 34 vid centrifugering, men inte så stor att den avsevärt begränsar den blod- mängd, som anordningen 20 kan mottaga. Den använda mängden dämpnings- medel kan variera med parametrarna för det speciellt valda systemet, exempelvis propparnas dimensioner, volym av kvarvarande blod och flyktighet för det använda dämpningsmedlet. En föredragen mängd dämp- ningsmedel kan utgöra från ungefär 3,3 till 30,0 volymprocent, baserat på volymen av blandningen av dämpningsmedel och kvarvarande blodprov som avlägsnas från anordningen 20 och testas med avseende på närvaro av mikrobiella patogener.

Dämpningsmedlet enligt uppfinningen kan helt allmänt innefatta en hydrofob, med vatten icke blandbar vätska med hög densitet. Såsom angivits ovan, avses med uttrycket "hög densitet" i föreliggande sam- manhang att dämpningsmedlets densitet är högre än provvätskans. Dess- utom skall dämpningsmedlet vara icke-toxiskt i förhållande till mikro- biella patogener och relativt inert med avseende på butylgummi, sili- kongummi och andra typer av elastomerer som användes vid tillverkning av de ovan beskrivna förslutningsanordningarna, varigenom injektion kan utföras. Densiteten hos dämpningsmedlet är från 1,6 g per cma till 2,0 g per cma. Helt allmänt föredrages fluorerade kolväten med de ovan beskrivna egenskaperna och med molekylvikter inom intervallet från 300 till 850. Vidare föredrages fluorerade kolväten med de ovan angivna egenskaperna, vilka avdunstar med ungefär samma hastighet som vatten när provet innehållande dämpningsmedlet placeras på en odlingsplatta av vanlig typ. Sålunda kan man använda dämpningsmedel med de ovan be- skrivna egenskaperna och kokpunkter från 90°C till 2l0°C och före- trädesvis från l00°C till l40°C. Dämpningsmedlet skall även ha ett ång- tryck, som inte bryter loss förslutningsanordningen, varigenom injek- tion kan utföras, från röret under tillverkningsstegen, såsom exempel- vis under autoklavbehandling. Fluorerade kolväten som försäljes under handelsnamnet “FLUORINERT" av 3M Company, Minneapolis, Minnesota, USA, har visat sig fungera väl som dämpningsmedel. Närmare bestämt har typerna "FC-75", "FC-48" och "FC-43" ur "FLUORINERT"-serien visat sig vara särskilt användbara. Även om den exakta funktion som sådana dämpande medel uppvisar inte är helt känd, antages det att de förbättrar utvinningen av mikro- biella patogener, som passerat ur suspension i ett centrifugerat blod- prov, på åtminstone två sätt. För det första tjänar dämpningsmedlet 447 485 l2 till att försegla mellanrum, sprickor och liknande både på den släta ytan 34 i centrifugeringskärlet 22 och vid skiljeytan mellan Centri- fugeringskärlets 22 väggar och förslutningsanordningen 26, varigenom injektion kan utföras. Mikrobiella patogener som annars skulle kunna bli inneslutna i sådana utrymmen och sålunda inte bli tillvaratagna utvinnes sålunda tillsammans med dämpningsmedlet 28 när detta avlägsnas från anordningen 20. För det andra antages det att dämpningsmedlet verkar dämpande på den kraft, med vilken de mikrobiella patogenerna tvingas ut ur suspension i ett blodprov under centrifugering. Denna dämpande effekt minskar risken för skada på de mikrobiella patogenerna, som annars skulle kunna uppkomma vid stöt. Vidare är det så att även om vissa av de mikrobiella patogenerna i realiteten kan passera in i dämp- ningsmedlet, kommer väsentligen inga att passera fullständigt därigenom och huvuddelen kommer att bildas på dess yta vid skiljeytan mellan dämpningsmedlet 28 och blodprovet och ansamlas i ett skikt.

När dämpningsmedlet 28 avsatts inuti centrifugeringsanord- ningen 20 kan även vattenlösliga behandlingsmedel 30 för blodet av- sättas däri. Sådana behandlingsmedel kan exempelvis innefatta lyse- ringsmedel och/eller anti-koagulerande medel. Varje lämpligt lyserande medel kan användas för såvitt det är icke-toxiskt i förhållande till mikroorganismer. Ett lämpligt sådant lyserande medel är en vattenlös- ning av en icke-toxisk saponin. Det bör observeras att många saponiner är kända för att vara toxiska för mikrobiella patogener. Såsom emeller- tid framgår av den amerikanska patentskriften 3 883 425, anges däri en metod för avlägsnande av de toxiska komponenterna från hitintills såsom toxiska ansedda saponiner. Helt allmänt kan det toxiska saponinmateria- let avtoxifieras enligt den uppfinning som anges i den amerikanska patentskriften 3 883 425 och de erhållna renade materialen kan användas inom ramen för uppfinningen. Dessutom kan vattenlösningen av saponin innehålla ett anti-koagulerande medel och/eller ett medel som avlägsnar syre. Ett föredraget anti-koagulerande medel är natriumpolyanetol- sulfonat (SPS) eller heparin. Natriumpolyanetolsulfonat föredrages, emedan det inte bara verkar såsom ett anti-koagulerande medel utan också inhiberar den fagocytiska aktiviteten hos granulocyter och mono- cyter och den normala antibakteriella aktiviteten hos blodserum. Det föredrages att vattenlösningen av behandlingsmedlet utgör minst 1,0 volymprocent av den totala vätskan i centrifugeringskärlet 22 inne- -fattande behandlingslösningen, provvätskan och dämpningsmedlet, och företrädesvis från ungefär 7,6 till ungefär 17,5 volymprocent därav. 447 485 13 När behandlingsmedlen 30 har införts i centrifugeringsanord- ningen 20 kan förslutningsanordningen 24, varigenom injektion kan utföras, införas i läge och utrymmet 32 evakueras till önskat tryck, som är lägre än atmosfärstrycket.

I fig. 2 - 9 åskådliggöres schematiskt en analyssekvens i form av vn föredragen utföringsform av uppfinningen. Såsom ett exempel genomföres ett förfarande enligt en utföringsform av uppfinningen för påvisning av mikrobiella patogener i ett blodprov och därvid användes lämpligen följande apparatur: Den ovan beskrivna centrifugeringsanordningen 20 innehållande dämpningsmedlet 28 och blodbehandlingsmedlen 30 - kärlet kan ha en volym av 12 - l4 ml.

En steril glasinjektionsspruta och en injektionsnål av engångstyp (längd 3,81 cm; yttre diameter 1,7 mm); en steril glasinjektionsspruta och en injektionsnål av engångstyp (längd 2,54 cm; yttre diameter 0,81 mm); en injektionsnål (längd 1,59 cm; yttre diameter 0,5 mm) med bomull infört såsom täckning (använd såsom ventil); tre blodagarplattor; en chokladagarplatta; en Sabouraud-platta.

Det bör observeras att med undantag av centrifugeringsanord- ningen 20 eller någon motsvarande anordning kan olika typer av välkänd laboratorieapparatur och kulturmedier användas för att utföra det nya förfarandet enligt uppfinningen. Det bör särskilt observeras att de kulturmedier som angivits ovan endast utgör exempel och föredrages i allmänhet för användning vid påvisning av de mest vanliga mikrobiella patogenerna. De föreslagna blodagarplattorna utgör konventionellt använda blodagarplattor, som i realiteten utgöres av fårblod och ett basnäringsmedel, såsom socker, som sammanhålles med ett stelnande agar- medel på en petriplatta. Chokladagarplattan är anordnad för tillväxt av vissa patogener, t.ex. hemophilus. Sabouraud-plattan är särskilt lämp- lig för odling av svampar.

Under det att sålunda olikartad apparatur kan användas vid förfarandet enligt uppfinningen, kan ovan angivna apparatur och mate- rial lämpligen användas vid tillämpning av uppfinningen på nedan angivet sätt.

För användning av centrifugeringsanordningen 20 enligt fig. l anbringas denna initiellt så att förslutningsanordningen 26, varigenom 447 485 14 injektion kan utföras, med sin släta vinklade yta 34 förefinnes vid anordningens 20 lägre ände, så att dämpningsmedlet 28 och blodbehand- lingsvätskan 30 vilar mot den släta vinklade ytan 34. Det bör observe- ras att för illustrationsändamål anges i fig. 2 två separata vätske- nivåer, som representerar dämpningsmedlet 28 och behandlingsvätskan 30.

I praktiken kan en icke-stabil emulsion eller blandning av dessa två vätskor uppkomma beroende på hanteringen, så att de två distinkt åt- skilda vätskeskikten inte alltid är närvarande. Denna instabila bland- ning av dämpningsmedel 28 och blodbehandlingsvätska 30 påverkar på intet sätt ogynnsamt metoden enligt uppfinningen, emedan separation av de två vätskorna hastigt sker vid centrifugering.

Därefter injiceras en förutbestämd mängd av ett blodprov 38 som tagits från patienten, t.ex. 7 ml blod, in i det evakuerade ut- rymmet i centrifugeringsanordningen 20, såsom visas i fig. 3, med användning av en vanlig injektionsspruta 40. Alternativt kan provet dragas direkt in i anordningen med användning av en standard- och en dubbelnålfixtur, försedd med konventionella vakuumanordningar för bloduttagning, såsom sådana som försäljes under beteckningen “Vacutainer“ av Beckten Dickenson. Därefter underkastas anordningen 20, innehållande blodprovet 38, blodbehandlingsvätskan 30 och dämpningsmed- let 28, blandning för att säkerställa att blodbehandlingsmedlen 30 fullständigt blandas med blodprovet 38. Detta blandningssteg visas schematiskt i fig. 4. ' Efter det att blodprovet 38 behandlats på detta sätt centri- fugeras anordningen 20 för att bringa de mikrobiella patogenerna i det behandlade blodprovet 42 att passera ut ur suspension och ansamlas intill skiljeytan mellan dämpningsmedlet 28 och det återstående vätske- provet. Vissa mikrobiella patogener avsättes i realiteten på centri- fugeringskärlets 22 sidoväggar intill den övre änden av den släta ytan 34 vid punkten 22a. Detta centrifugeringssteg visas schematiskt i fig. 5. Hastigheten och tiden för centrifugeringen kan variera i hög grad beroende på konstruktionsmaterialet i centrifugeringsanordningen och den använda centrifugeringsapparaturen. Centrifugeringen kan lämpligen utföras vid en gravitation mellan ungefär 1500 och 6000 g och företrädesvis vid ungefär 1500 - 3000 g. Såsom framgår av fig. 5, användes en vinkelrotorcentrifug, som ger centrifugeringsanordnignen 20 en vinkel av exempelvis 56° (åskådliggjord medelst bågen 44) under V centrifugeringen. Om sålunda den släta vinklade ytan 34 har en vinkel 447 485 av 34" i förhållande till centrifugeringsanordningens 20 inre väggar, kommer det behandlade blodprovet 42 och dämpningsmedlet 28 att tvingas mot den släta vinklade ytan 34 i en förhållandevis rät vinkel under centrifugeringen. Det bör observeras att när man använder en Centrifug av typen "svängande korg", centrifugeras anordningen 20 vid väsentligen 0” i förhållande till en horisontell yta. I ett sådant fall blir vin- keln för ytan 34 sålunda ungefär 90° och man kan använda en gummiför- slutning med en platt inre yta och varigenom injektion kan utföras i stället för förslutningsanordningen 26, varigenom injektion kan utföras.

När centrifugeringssteget är fullbordat kan centrifugerings- anordningen 20 avlägsnas från centrifugen och den övervägande delen av det behandlade blodprovet 42, från vilket mikrobiella patogener sepa- rerats, kan avlägsnas. Det bör observeras att i föreliggande sammanhang hänför sig uttrycket "återstående behandlat blod" eller "återstående blod" till ett blodprov, som har centrifugerats så att de däri när- varande mikrobiella patogenerna ansamlats på botten av provet och sålunda kvarlämnar den "återstående" andelen av provet väsentligen fri från mikrobiella patogener. Detta steg visas i fig. 6. För att under- lätta avlägsnandet införes en ventilationsnål 44, exempelvis i form av en vanlig injektionsnål med bomull i ena änden genom förslutningsanord- ningen 24, varigenom lnjektion kan utföras. En andra injektionsnål med en spruta 45 fäst därtill kan sedan införas genom förslutningsanord- ningen 26, varigenom injektion kan utföras, för avlägsnande av en övervägande andel av det återstående behandlade blodprovet 42, från vilket mikrobiella patogener har separerats. När exempelvis centrifu- geringskärlet har en volym av från 12 till ungefär 14 ml, kan en nål (längd 3,81 cm; yttre diameter 1,27 mm) användas för att avlägsna hela mängden utom ungefär 1,3 - 1,7 ml av det behandlade blodprovet 42.

Såsom visas, föredrages det att den övervägande andelen av det åter- stående blodprovet uttages från det inre av centrifugeringskärlet 22 vid en punkt mittemot sidoväggen intill den övre lutande änden av den släta ytan 34, för att man skall undvika att störa det skikt av mikro- biella patogener som bildats på och i skiljeytan mellan de två väts- korna och på sidoväggen av centrifugeringskärlet 22 intill den övre änden av nämnda lutande släta yta 34. Den övervägande andelen av det återstående blodet avlägsnas i detta steg; en ringa andel av det åter- stående blodet skall emellertid lämnas kvar i centrifugeringskärlet 22, 447 485 16 så att av den totala kvarvarande vätskan dämpningsmedlet utgör från 4,7 % till 28,6 %, beräknat på volymen. Det föredrages att inte mer än ungefär 20 volymprocent utgöres av dämpningsmedlet, emedan större mängder dämpningsmedel kan skadligt påverka morfologin för mikrobiella patogenkolonier vid efterföljande patogenodlingssteg som användes vid förfarandet. ' När den övervägande andelen av det behandlade återstående blodprovet avlägsnats, kan båda nålarna borttagas från förslutnings- anordningarna 24 och 26, varigenom injektion kan utföras, och centri- fugeringsanordningen 20 underkastas därefter ett andra blandningssteg, som schematiskt visas i fig. 7. Om så önskas kan emellertid ventila- tionsnålen 44 lämnas i läge i förslutningsanordningen 24, varigenom injektion kan utföras, för att medverka vid avlägsnandet av patogen- haltig vätska i ett senare steg. Det andra blandningssteget tjänar till att resuspendera mikrobiella patogener, som separerats från den över- vägande andelen av det återstående behandlade blodprovet 42 och vilka bildat det ovan beskrivna skiktet. Resuspension av de så uppsamlade mikrobiella patogenerna i den kvarvarande mindre andelen av det återstående behandlade blodprovet 42 säkerkställer större och mer enhetlig utvinning.

När blandningssteget har resuspenderat de mikrobiella pato- generna i en mindre andel av det återstående behandlade blodprovet 42 kan blandningen av mikrobiella patogener i det återstående behandlade blodprovet och dämpningsmedlet med hög densitet avlägsnas från centrifugeringsanordningen 20. Detta steg belyses i fig. 8. Såsom angivits ovan, kan om så önskas den ventilerande injektionsnålen 44 införas genom förslutningsanordningen 24, varigenom injektion kan utföras, för att medge lättare avlägsnande av de kvarvarande bestånds- delarna. Injektionssprutan 46 med anbringad injektionsnål kan därefter föras genom förslutningsanordningen 26, varigenom injektion kan ut- föras, för utdragning av blandningen 48 av dämpningsmedel 28, en mindre mängd återstående blodprov 42 och däri förefintliga mikrobiella pato- gener. Det bör observeras att särskilt god utvinning kan åstadkommas om den injektionsnål som användes för att avlägsna dessa beståndsdelar införes vid den lägre änden av den vinklade släta ytan 34. Det antages att vinkeln för ytan 34 delvis verkar såsom en tratt, vari den kvar- varande vätskan innehållande de mikrobiella patogenerna flyter. Bland- ningen 48 av dämpningsmedel 28 med hög densitet och den kvarvarande 447 485 17 mindre andelen av det återstående behandlade blodprovet 42 med till- varatagna mikrobiella patogener utgör ungefär l,5 ml vätska. Denna vätska fördelas sedan på bakterietillväxtmedier. Detta steg belyses schematiskt i fig. 9. Med den ovan beskrivna apparaturen kan materialet fördelas på följande sätt: En blodagarplatta kan mottaga 0,3 ml av blandningen och plattan inkuberas vid 36°C i en aerob atmosfär. Två blodagarplattor kan mottaga 0,3 ml av vattenlösningen och inkuberas vid 36°C i en anaerob omgivning. En chokladagarplatta kan mottaga 0,3 ml av vattenlösningen och inkuberas vid 36°C i en ljusskål. Sabouraud-plattan kan mottaga 0,3 ml av blandningen och inkuberas vid 25°C i en aerob omgivning.

Tillväxtmedierna skall undersökas dagligen med avseende på närvaro av kolonier. Mikroskopisk analysteknik kan användas. Antalet mikrobiella patogener i 1 ml blod kan bestämmas genom multiplikation av antalet kolonier med en korrektionsfaktor. Denna korrektionsfaktor beaktar utvinningsgraden för en given organism, de använda volymerna av blod och dämpningsmedel med hög densitet och den slutliga mängden av bland- ningen. I det allmänna exemplet ovan är korrektionsfaktorn 1,4.

Det bör åter observeras att de exakta förfarandestegen, appa- raturen och utrustningen och de vid den ovan i detalj beskrivna utfö- ringsformen använda typerna av kulturmedier kan varieras alltefter önskan. Exempelvis kan alla kända medel användas för att blanda blod- provet med det anti-koagulerande och/eller lyserande medlet. Dessutom kan i vissa fall steget innefattande uttagning av den större andelen av blodprovet 42, som visas i fig. 6, helt uteslutas och endast en ringa andel av blodprovet 42 innehållande de resuspenderade mikrobiella patogenerna uttagas från botten av centrifugeringsanordningen 20 tillsammans med dämpningsmedlet 28 med hög densitet, såsom visas i fig. 8. Olika andra modifikationer kan användas vid förfarandet allt- efter önskan.

Följande exempel underlättar förståelsen av uppfinningen utan att begränsa dess omfång.

Exempel Detta exempel genomfördes för att fastställa jämförande data med avseende på procentuell utvinning av mikrobiella patogener från blodprov med användning av den vätskefiltermedium-teknik, som anges 1 den amerikanska patentskriften 3 928 139 i jämförelse med den utvin- ning av mikrobiella patogener som erhölls med användning av dämpnings- 447 4-85 18 medelstekniken enligt föreliggande uppfinning.

Den teknik som användes i detta exempel identifieras i tabell l såsom antingen "vätskefiltermedium" eller "dämpningsmedel".

Den information som förekommer inom parentes direkt under teknik- identifikationen anger det använda flytande filtermediet (t.ex. 50 % sackaros) i testerna med flytande filtermedium och det använda dämp- ninqsmedlet (t.ex. "Fluorinert FC-48") i testerna med dämpningsmedel.

Varje testat prov (l - 21 enligt förteckningen i tabell l) framställdes av 7 ml-prov av sterilt lyserat blod från friska blodgivare, varvid varje prov inokulerades med 0,3 ml av olika kända koncentrationer av en human patogen (antingen Escherichia coli eller Candida albicans, såsom anges i tabell l).

I vart och ett av de utförda provtesterna användes en centri- fugeringsanordning 20, såsom visats och beskrivits ovan, oavsett om tekniken med flytande filtermedium eller dämpningsmedelstekniken använ- des. För att undersöka effekten av användningen av en yta anordnad vid väsentligen komplementvinkeln för anordningen 20 när denna centrifuge- rades hade vissa av anordningarna 20 gummiproppar med platta, släta inre ytor, så att den inre ytan av bottenproppen var horisontell med bottenplanet när anordningen 20 ställdes upprätt. Dessa bottenproppar betecknas "horisontella" i tabell l. Vidare användes speciellt till- verkade bottenförslutningsanordningar, framställda med användning av vanliga gummiproppar tillsammans med antingen vanligt badkarskitt eller silikonbaserat plastmaterial som försäljes under handelsnamnet "SYLGARI 134" av Dow Corning, Midland, Michigan, USA, för framställning av en bottenyta inuti anordningen 20, som med avseende på väggarna i anord- ningen 20 hade en vinkel, som väsentligen utgjorde komplementvinkeln till den vinkel, vid vilken anordningen 20 centrifugerades. Prov testa- de med användning av centrifugeringsanordningar uppvisande vinklade bottenproppar identifieras som sådana i tabell l och det använda mate- rialet (antingen badkarskitt eller "SYLGARD") för framställning av den vinklade ytan anges likaledes. De centrifugeringar som utfördes i sam- band med Vart och ett av de i tabell l angivna proven med användning av den vinklade bottenproppen utfördes i en vinkelrotorcentrifug, vari centrifugeringsvinkeln var ungefär 56°. De centrifugeringsanordningar som uppvisade vinklade bottenproppar (vinklade vid ungefär 34°) upp- visade sålunda en hottonyta, som var väsentligen vinkelrät mot centri- fugalkraftens riktning. De prov som uppvisade en horisontell botten- 447 485 19 propp (enligt identifikationen i tabell 1) centrifugerades vidare i en centrifug av typen svängande korg, som under centrifugering bringar anordningen 20 att rotera i ett plan som är väsentligen parallellt med horisontalplanet. Centrifugalkraften verkade sålunda i en riktning som var väsentligen vinkelrät mot ytan på de horisontella bottenpropparna.

När tekniken med flytande filtermedium användes, innehöll var och en av anordningarna 20 1,2 ml av en vattenlösning innehållande 1,5 viktprocent gelatin och den viktkoncentration sackaros, som anges i tabell l. Var och en av anordningarna 20 inverterades och kyldes till 4°C i omvänt läge innan det inokulerade blodprovet tillfördes. När var och en av anordningarna 20 mottagit den avsedda mängden blodprov inne- hållande den kända mängden human patogen, placerades desamma i ett vattenbad i fortfarande inverterat tillstånd. Vattenbadet hölls vid 42°C och gelatinet fick smälta. Varje rör centrifugerades sedan vid ungefär 56° vinkel i en rotorcentrifug. Centrifugeringen utfördes under minuter och vid en relativ centrifugalkraft av 1500 eller 3000 g, såsom anges i tabell 1.

Vid denna tidpunkt i det förfarande som användes i samband med vissa av proven (nedan betecknade såsom "tre"-införingsförfarandet) infördes en lO ml spruta genom bottenproppen för avlägsnande av 6,7 ml återstående blodprov. Därefter underkastades centrifugeringsanordningen blandning i en vortex-blandare under ungefär 0,5 - 2 minuter. Efter blandningssteget avlägsnades l,5 ml av det blandade filtermediet och den andel av blodprovet som fanns kvar i anordningen 20 medelst en gemensam spruta med anbringad sprutspets. Vid andra prov användes inte steget med avlägsnande av en övervägande andel av det återstående blodprovet efter centrifugeringen. I detta fall togs l,5 ml av det flytande filtermediet och blodprovet intill bottenproppen från bottnen av centrifugeringsanordningen 20 direkt efter centrifugeringen. De 1,5 ml, som bestod av en blandning av flytande filtermedium och återstående blodprov såväl som de uppsamlade mikrobiella patogenerna, blandades efter uttagning från anordningen 20 för att åstadkomma en relativt likformig fördelning av komponenterna vid påföring av provet på en platta. Skillnaderna mellan dessa två förfaranden anges i tabell l under beteckningen "antal införingar", som anger att ifrågavarande testprov behandlats enligt förfarandet med antingen två eller tre in- föringar. När det gäller tre införingar, avser den första insprutning av blodprovet, den andra avlägsnande av den övervägande andelen av 447 485 blodprovet efter centrifugering men före blandning, medan den tredje införingen avser avlägsnande av kvarvarande vätskefiltermedium och kvarvarande andel av blodprovet. Vid förfarandena med två införingar avser den första införingen insprutning av blodprovet i anordningen 20 -och den andra avlägsnande från bottnen av centrifugeringsanordningen 20 av ungefär 1,5 ml blandat vätskefiltermedium och blodprov.

I båda fallen, oavsett huruvida förfarandet med två eller tre införingar användes, togs fem prov innehållande 0,3 ml vardera av de 1,5 ml som uttagits från bottnen av anordningen 20 och anbringades på fem separata plattor. Efter inkubering jämfördes dessa prov med kont- rollplattor, framställda genom tillsats av samma kända mängd mikro- biella patogener, som insprutats i det testade blodprovet, till en saltlösning och påföring av 0,3 ml av denna saltlösning på var och en av fem agarplattor. Den procentuella utvinningen, baserat på jämförelsen mellan provplattorna och kontrollplattorna, anges i tabell 1.

Det förfarande som användes för varje blodprov, som testades med användning av dämpningsmedelstekniken, var följande. En centrifuge- ringsanordning framställdes med användning antingen av en horisontell eller en vinklad bottenpropp, såsom beskrivits ovan. Varje centrifuge- ringsanordning 20 som användes vid dämpningsmedelsförfarandet innehöll 0,3 ml "Fluorinert FC-48". 7 ml lyserat blod som kontaminerats med ett känt antal mikrobiella patogener insprutades sedan genom topp-proppen ; anordningen 20. Nästa steg var att centrifugera var och en av anord- ningarna 20 i samma vinkelrotorcentrifug som användes vid tekniken med flytande filtermedium. Centrifugeringstiden var 30 minuter och den använda relativa centrifugalkraften var antingen 1500 g eller 3000 g, såsom anges i tabell 1. När tekniken med tre införingar användes uttogs ungefär 5,8 ml återstående blodprov genom införing av en 10 ml spruta genom bottenproppen. När systemet med två införingar användes utfördes inte detta steg. I vartdera fallet uttogs 1,5 ml, innefattande ungefär 1,2 ml återstående blodprov och 0,3 ml "Fluorinert" från bottnen av centrifugeringsanordningen 20. Fem provplattor framställdes därefter med användning av 0,3 ml av blandningen av återstående blodprov och "Fluorinert" i vartdera fallet. Dessa provplattor inkuberades och jämfördes därefter med kontrollplattor, som framställts på samma sätt som beskrivits ovan i samband med tekniken med flytande filtermedium.

Den procentuella utvinningen vid användning av dämpningsmedelstekniken beräknades därefter och anges i tabell l. 447 485 21 Även om_en exakt teori för att förklara de data som erhölls vid detta försök inte kan anges, kan den låga utvinningen för prov nr 2 i tabell 1 (varvid vätskefiltermediumtekniken användes med användning av 50 % sackaros och en horisontell bottenpropp) vara ett resultat av att de mikrobiella patogenerna blir inneslutna längs den inre kanten av den horisontella bottenproppen intill väggen av centrifugeringsanord- ningen 20. Vid jämförelse av resultaten för prov nr l med resultaten för prov nr 3, varvid man åter använde vätskefiltermediumtekniken och en horisontell propp, men med användning av tre-införingsförfarandet, framgår att utvinningsgraden för prov nr 3 är i hög grad förbättrad.

Detta kan förklaras av det förhållandet att emedan mindre relativ centrifugalkraft användes, blev de mikrobiella patogenerna inte så tätt packade i sprickan mellan bottenproppen och väggarna i anordningen 20.

Vidare medger tre-införingstekniken utvinning av samtliga mikrobiella patogener som blivit resuspenderade i den kvarvarande andelen av blod- provet. När två-införingsförfarandet användes kan en viss del av de resuspenderade mikrobiella patogenerna lämnas kvar i den återstående andelen av blodprovet.

En jämförelse mellan prov nr 15 och prov nr 17 visar de förbättrade resultat som är möjliga när man använder dämpningsmedels- tekniken enligt uppfinningen. För prov nr 15, liksom för prov nr 17, användes en horisontell bottenpropp, antalet införingar var tre och den relativa centrifugalkraften var densamma som för prov nr 17 (3000).

De förbättrade resultaten vid användning av dämpningsmedelstekniken antages bero på användningen av dämpningsmedlet som inte medger att mikrobiella patogener passerar därigenom och går förlorade vid skilje- ytan mellan väggarna i anordningen 20 och bottenproppen.

Vidare visar en jämförelse mellan prov nr 9 och prov nr ll de fördelar som erhålles med användning av en vinklad propp i jämfö- relse med en propp med horisontell botten. Emedan betingelserna och förfarandet vid proven nr 9 och ll är exakt identiska, bortsett från det förhållandet att för prov nr ll användes en vinklad propp, kan den erhållna förbättringen med avseende på utvinningsgraden för prov nr ll i förhållande till utvinningsgraden för prov nr 9 endast till- skrivas användningen av en vinklad bottenpropp, belägen vid en vinkel med avseende på väggarna av anordningen 20, som utgör komplementvinkeln till den vinkel, vid vilken anordningen 20 centrifugeradcs. En jäm- förelse mellan prov nr l0 och prov nr 12 visar på liknande sätt de 447 485 0 . 22 överlägsna resultat som erhålles när man använder en vinklad botten-v propp vid högre relativa centrifugalkrafter (3000). 447 485 23 H + æm ooom m øßfl¥:fi> Hwømëmwflflnmëmn = = .NM ^mw5fim|wnmwHæmv ^=æw|om vnmsflhoßfißç N.H H mm oomfi m @mfixn«> Hwømsmwflflsmëmm = = .~- I Tëïum vuwnflnozfimí N + mæ ooom m Hfimvsomflhom Hmumëmwflwsmëmm = = .ofi .l ^=®fi|Omw nfHQflflfflOßfimmr-v w + m.Hæ oomfl m aflmwcomflhom flmwmëwwnfinmëmø : = Å I ^=æ«lom PnmsfinosHm=v N + om ooom N Hflwvcomfinom fiwuwEmwfl«nmEmQ = = .x I Tëïom pnmnfiåøflmí wfi + mm oomfi N Hfiwpnowflnom Hwøwëwwnfinmëmm = = .w I Amoämxomm fiomv mfi + mm ooom m Haøvfiomflnom ë§flwwEfiwvHflMmxmPm> = = .Q l Awohmxomm Rømv m + om oomfi m flfiwvnomfihow Esw@mEnmwHwmmxmpm> = = .: I Amohmzumm &omv wfi + mm ooom N Hflwvsomflnom E5«@w&hmPfifi@mxmvm> = = ¿ l Awohmxomm fiomv w + om ooma m flfimwsomfinom ES«ømsnmpH@mwxmvm> = = .f I Awohmxomw Romv m + am ooom N Hfimvsomwnom E5fiumahw»HfimwxmPm> : = f I Amohmxomm Romv Hfi + mm oomfi N fiflmpsomwpom EzflømEhmvHwmmxmPm> flfloo mflsownwsomm .4 mnwflGw>v5 Pwmnxflmwñmfihudwo hmwnwhwwflfi Gwmopmm Lä .w Ãfifiwnv PÉ Hmfiå mmoämuflfipom xüšwa flmflßofixfifiå Éä, ^mw:HmlønmwH>wv H Qflmmda Tæqfom »nmfin Såå 447 485 H H mm ooom M vmnmxwmnv @mHxq«> Hmwmsmwsfinmemn = = .fiw ñwwøflmnppfix ^=æ«|o@ p»wnfl»°sH@=v md H Hm oomfi m |m»«x@wpv @@Hznfi> Hwømsmwsfismsmn = = .CN Amwsfimuønmwflhmv ^=w«|um »fi@=fi»osHm=v 4 oofl coon m @mfixnH> Hwuwsmwnficmsmn = = .mfl 2 I ^mw§Hm|@h@wH»mv ^=w«|om »~mnfiHosHm=v 4 + mm oomfl M @ßHxnfi> Hmwwamwnflsmemn = = .wfi 1 ^=w4|om pnwsflnø:Hm=v w + mm ooom M flfiwpaomflhom Hwøwsmwnfinmsmn = = .>~ I ^m ohmxomm fiomv _ > + Nm oomfl m Hfiwpøomfinom a:fi@@e~m»Hfl@mxm»m> = = ..@H flmohmxomm .Ros _ y WH H mm ooom M ..Hfi@»:°wfl~0m esfi@@a«m»H««mxw»m> = = . 1mH 4 Éohmxomm Romv _ w H ow ooom N Hfimpaømfinom ssfi@@en@»flfi@@xmpm> = = 4..«H I Awohmxomm .momv NN + wm oomfi N Hfiwpnomflhom asH@wanm»Hfi@@xm»m> mqßofipfim mwfiønwo .MH äüwsffpfi Pmmhåmwsmfln »nu u ...åmsfinæ .wnfi . Qwm oæmm c & >fl»@Hw»v Umm Hm»:< mmowmcwflpom xflnxwa Hfimfipoäxfiä :gym mwsH@|p»fix ^=w«|om p»@:fi»ø§H@=v Tmvhowv a Qflmmuwa

Claims (20)

447 485 25 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för påvisning av mikrobiella patogener som antages vara närvarande i ett vätskeprov, företrädesvis för diagnostisering av septikemi, genom centrifugering av en begränsad steril zon innehållande nämnda provvätska, vilken centrifugering utföres i närvaro av ett icke-toxiskt, med vatten icke blandbart, flytande dämpningsmedel med hög densi- tet, vars densitet är högre än provvätskans densitet, så att man bringar väsentligen samtliga mikrobiella patogener att passera ut ur provvätskan, k ä n n e t e c k n a t därav, att de mikrobiella patogenerna genom centrifugeringen tvingas att inträda i nämnda dämpningsmedel men inte passera därigenom, så att den övervägande andelen av de närvarande patogenerna koncentreras i nämnda dämpningsmedel och i skiljeytan mellan nämnda dämpningsmedel och provvätskan; varefter patogenerna i dämpningsmedlet och den ringa mängd provvätska, som ligger intill skiljeytan mellan dämpningsmedlet och provvätskan, separeras från den övre delen av provvätskan, och att de sålunda uppsamlade patogenerna bestämmes på i och för sig känt sätt.

2. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att dämpningsmedlet är närvarande i en mängd som mot- svarar från ungefär 3,3 till 30,0 volymprocent, baserat på volymen av blandningen av dämpningsmedlet och den separerade provvätskan med de mikrobiella patogenerna.

3. Förfarande enligt patentkravet l eller 2, k ä n n e - t e c k n a t därav, att dämpningsmedlet är ett inert fluore- rat kolväte med en molekylvikt inom intervallet från 300 till 850.

4. Förfarande enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att det fluorerade kolvätet har en densitet från 1,6 till 2,0 g/cma och en kokpunkt av 90°C till 2l0°C. 447 485 26

5. Förfarande för påvisning av mikrobiella patogener enligt något av patentkraven l till 4, vilket vidare k ä n n e - t e c k n a s därav, att efter avsättning av nämnda prov- vätska genom centrifugering gentemot nämnda dämpningsmedel, varvid nämnda patogener som är närvarande i nämnda provvätska har tvingats att passera genom nämnda provvätska medelst den centrifugalkraft, som förorsakar att nämnda patogener inträder i dämpningsmedlet men inte passerar därigenom, så att majori- teten av de närvarande patogenerna koncentreras i dämpnings- medlet och i skiljeytan mellan det icke-toxiska dämpnings- medlet och provvätskan, (a) avlägsnas den övre andelen av provvätskan efter centri- fugering utan att det skikt av provvätskan, som ligger omedel- bart intill skiljeytan mellan provvätskan och nämnda dämp- _ ningsmedel, störes, så att patogener som ligger nära eller i skiljeytan inte avlägsnas; och (b) underkastas det kvarvarande dämpningsmedlet mikrobiella patogener samt återstoden av nämnda provvätska analys med avseende på patogener på i och för sig känt sätt.

6. Förfarande enligt patentkravet 5, vilket ytterligare k ä n n e t e c k n a s därav, att före analysen med av- seende på patogener blandas den kvarvarande provvätskan och nämnda dämpningsmedel och analyseras därefter med avseende på mikrobiella patogener på i och för sig känt sätt.

7. Förfarande enligt något av patentkraven l till 6 för påvisning av mikrobiella patogener i ett lyserat blodprov som antages innehålla suspenderade mikrobiella patogener och anti-patogena faktorer, k ä n n e t e c k n a t därav, att man ' (a) inuti ett evakuerat centrifugeringsrör placerar ett sterilt, med vatten icke blandbart, hydrofobt, flytande dämpningsmedel med hög densitet i en mängd motsvarande från ungefär 3,3 till 30,0 volymprocent, baserat på volymen av blandningen av dämpningsmedel och blodprov som skall analyse- ras med avseende på närvaro av mikrobiella patogener; 447 485 27 (b) avsätter blodprover på dämpningsmedlet inom det evakuerade centrifugeringsröret; (c) centrifugerar röret på sådant sätt att man tvingar blod- provet mot dämpningsmedlet och förorsakar att väsentligen samtliga mikrobiella patogener passerar ut ur suspensionen och samlas i ett skikt på dämpningsmedlet; (d) separerar en övervägande andel av det kvarvarande blod- provet från dämpningsmedlet och skiktet av mikrobiella pato- gener; (e) blandar skiktet av mikrobiella patogener med en kvar- varande ringa andel av det kvarvarande blodprovet; (f) avlägsnar den erhållna blandningen och dämpningsmedlet från centrifugeringsröret; (g) analyserar den erhållna blandningen och dämpningsmedlet med avseende på närvaro av mikrobiella patogener.

8. Förfarande enligt patentkravet 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att blodprovet lyseras inuti centrifugeringsröret.

9. Förfarande enligt patentkravet 8, k ä n n e t e c k n a t därav, att lyseringen åstakdommes medelst ett lyseringsmedel inuti centrifugeringsröret och blandning av blodprovet därmed före centrifugeringen.

10. Förfarande enligt något av patentkraven l till 9, k ä n- n e t e c k n a t därav, att centrifugeringsröret innefattar en bottenyta, varpå dämpningsmedlet avsättes, vilken är så belägen att blodprovet vid centrifugering tvingas mot dämp- ningsmedlet och bottenytan väsentligen rätvinkligt.

11. ll. Anordning för användning vid förfarandet enligt något av patentkraven l till 10 för påvisning av mikrobiella patogener som antages vara närvarande i en provvätska, vilken anordning innefattar en innesluten centrifugeringsbehållare som är för- seglingsbart försluten med ett förslutningsorgan, varigenom injektion kan utföras, vars inre innefattar ett evakuerat utrymme som hållas vid ett tryck som är lägre än atmosfärs- 447 485 28 tryck, liggande därintill ett icke-toxiskt, med vatten icke blandbart, flytande dämpningsmedel med hög densitet, varvid nämnda dämpningsmedel har en densitet som är högre än provvätskans densitet, k ä n n e t e c k n a d därav, att dämpningsmedlet kan uppsamla väsentligen samtliga mikrobiella _patogener, som passerar ut ur suspensionen av nämnda prov- vätska, utan förlust av nämnda mikrobiella patogener till mellanliggande utrymmen i nämnda centrifugeringsbehållare.

12. Anordning enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k n a d därav, att dämpningsmedlet är närvarande i en mängd som mot- svarar från ungefär 3,3 till 30 volymprocent, baserat på volymen av blandningen av dämpningsmedlet och den separerade provvätskan med de mikrobiella patogenerna.

13. Anordning enligt patentkravet 12, k ä n n e t e c k n a d därav, att dämpningsmedlet är närvarande i en mängd som mot- svarar från 4,7 till 2836 volymprocent, baserat på volymen av blandningen av dämpningsmedlet och den separerade provvätskan med mikrobiella patogener.

14. l4. Anordning enligt något av patentkraven ll till 13, k ä n - n e t e c k n a d därav, att dämpningsmedlet innefattar ett inert flytande fluorerat kolväte med en densitet från 1,6 till 2,0 g/cma.

15. Anordning enligt patentkravet 14, k ä n n e t e c k n a d därav, att det fluorerade kolvätet har en kokpunkt från 90°C till 2l0°C.

16. l6. Anordning enligt något av patentkraven ll till l5 för koncentrering av mikrobiella patogener i ett blodprov, k ä n - n e t e c k n a d därav, att liggande intill ett av de för- slutningsorgan, varigenom injektion kan utföras, förefinnes en plugg, varigenom injektion kan utföras, vilken har en yta som är anordnad vid en vinkel gentemot centrífugeringsbohållarens' inre, vilken vinkel är komplementvinkeln till den vinkel i 447 485 29 vilken artikeln centrifugeras, och att anordningen dessutom innehåller en effektiv mängd av ett icke-toxiskt lyserande medel.

17. Anordning enligt patentkravet 16, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den plugg, varigenom injektion kan utföras, är utsträckt och utgör en del av centrifugeringsbehållarens förslutningsorgan, varigenom injektion kan utföras.

18. Anordning enligt patentkravet 16 eller l7, k ä n n e - t e c k n a d därav, att vinkeln mellan ytan hos den plugg, varigenom injektion kan utföras, och centrifugeringsbehålla- rens inre är 30 till 80”.

19. Anordning enligt patentkravet 18, k ä n n e t e c k n a d därav, att vinkeln är 34°.

20. Anordning enligt patentkravet 16 eller 17, k ä n n e ~ t e c k n a d därav, att vinkeln mellan ytan hos den plugg, varigenom injektion kan utföras, och centrifugeringsbehålla- rens inre är ungefär 90°.