FI60888B - Foerfarande foer upptaeckande av patogena mikroorganismer i ett vaetskeformigt prov och vid foerfarandet anvaendbar anordning - Google Patents

Description

t l reti KUULUTUSJULKAISU £ Γ) Q O O

Ma [b] O1) UTLAggNINGSSKRIFT 6UÖ88 C (45j Patentti myönnetty 13 04 1932 Patent meddelat (51) Kv.ik.Vci.3 C 12 Q 1/24, C 12 M 1/24 SUOMI-FINLAND (21) Patenttihakemus — Patencanseknlnj 773237 (22) H»k*ml*pllvt— Anattknlngsdaf 28.10.77 ' ' (23) AlkupMvt —Glltifhetsda* 28.10.77 (41) Tullut Julkiseksi — Blivlt offentllf 06.05.78

Patentti· |a rekisterihallitus .... .... ... , .....

_ . . . . . _. . (44) Nlhtivlkslpanen ja kuuLJulkaisun pvm.—

Patent- och registerstyrelsen Ansekan uti·*! oeh «(.skriften publkerad 31.12.8l (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus —Begird prloritet 05.11. f 6

USA(US) 73927U

(71) J.K. and Susie L. Wadley Research Institute and Blood Bank, 9000 Harry Hines Boulevard, Dallas, Texas, USA(US) (72) Gordon Lee Dom, Dallas, Texas, USA(US) (74) Oy Kolster Ab (54) Menetelmä nestemäisen näytteen sisältämien patogeenien mikro-organismien havaitsemiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen laite -Förfarande för upptäckande av patogena mikroorganismer i ett vätske-formigt prov och vid förfarandet användbar anordning

Keksinnön kohteena on menetelmä nestemäisen näytteen mahdollisesti sisältämien patogeenien mikro-organismien havaitsemiseksi panemalla näyte suljettuun, steriiliin linkoamisvyöhykkeeseen ja linkoamalla, jotta mainittu näyte painautuisi nestemäisen väliaineen pintaa vastaan, ja erottamalla tämän jälkeen mainittu nestemäinen väliaine ja siinä olevat patogeeniset mikro-organismit mainitusta linkoamisvyöhykkeestä ja analysoimalla se mainittujen patogeenisten mikro-organismien toteamiseksi. Keksinnön kohteena on myös edellä mainitussa menetelmässä käyttökelpoinen laite.

Verenmyrkytys, joka tarkoittaa patogeenien mikro-organismien läsnäoloa ✓ veressä, on kaikkein vakavimpia infektioita. Vaikka nykyaikainen lääketiede onkin tarjonnut hyvän mikro--organismi- ja sienilääkkeiden valikoiman, on verenmyrkytyksen aiheuttama kuolleisuus n. 25 %. Lisäksi verenmyrkytykseen liittyvä shokki lisää kuolleisuutta yli 60 %:n. Uuvuttavat sairaudet, suuret leikkaukset, iirmunosuppressiivisten lääkkeiden nauttiminen tai syöväntorjuntalääkitys tekevät potilaat erityisen herkiksi verenmyrkytyksille.

2 60888

Tehokas ja nopea antibioottihoito on tärkeä torjuttaessa verenmyrkytystä. Sen tähden lääkärin tulee niin nopeasti kuin mahdollista ensinnäkin selvittää onko potilaassa verenmyrkytys, ja lisäksi tunnistaa patogeeninen mikro-organismi ja tämän mikro-organismin herkkyys antibiooteille. Siten oikea ja ajoissa tehty verenmyrkytyksen määritys perustuu potilaan veren hyvin nopeaan ja tehokkaaseen kvantitatiiviseen analyysiin. Lisäksi on potilaan veren kvantitatiivisen analyysin aikana ehdottoman tärkeää, että verinäyte ei kontaminoidu laboratorioympä-ristöstä peräisin olevilla patogeeneillä mikro-organismeilla.

Kolmea analyyttistä järjestelmää on tavallisesti käytetty mikro-organismien määrittämiseksi jostakin kehon nesteestä. Nämä kolme tavanomaista järjestelmää ovat liemiviljelymenetelmä, valumenetelmä ja suodatusmenetelmä. Jokaisella näistä menetelmistä on omat haittansa eikä millään niistä mikro-organismeja pystytä nopeasti havaitsemaan verinäytteestä. Yleensä liemiviljelymenetelmä ei ole kvantitatiivinen, ja valumenetelmä samoin kuin suodatusmenetelmä (käyttäen kiinteää matriisi suodatinta) ovat avoimia systeemejä, jotka ovat alttiina ulkoisille kontaminaatioille, esimerkiksi patogeenejä mikro-organismeja voi joutua viljelmään laboratorion ilmasta ja henkilökunnasta.

Viime aikoina on kehitetty parannettu menetelmä ja laite mikro-organismien määrittämiseksi näytenesteestä, esimerkiksi verestä (ks. US-patentti n :o 3 928 139).

Tämän parannetun menetelmän mukaan nopeaan ja kvantitatiiviseen patogeenien mikro-organismien määrittämiseen kehonesteen näytteessä päästään käyttämällä nestemäistä suodatusainetta. Nestemäinen näyte pannaan nestemäiselle suodatus-aineelle suljetussa steriilissä vyöhykkeessä. Nestemäisen suodatusaineen tiheys on suurempi kuin näytteen ja se käsittää steriilin vesiliuoksen, joka ottaa selektiivisesti vastaan patogeenejä mikro-organismeja näytteestä. Suljettu steriili vyöhyke lingotaan sen jälkeen näytteen pakottamiseksi nestemäistä suodatus-ainetta vastaan ja saamaan patogeenit mikro-organismit selektiivisesti kulkemaan siihen ja siten erottumaan näytteestä. Seuraavaksi nestemäinen suodatusaine, joka sisältää patogeenit mikro-organismit, erotetaan jäljelle jääneestä näyte-nesteestä ja nestemäisen suodatusaineen näytteitä saatetaan erilaisiin viljely-olosuhteisiin .

Edellä kuvattu parannettu menetelmä tarjoaa hyvin nopean ja tehokkaan menettelytavan patogeenien mikro-organianien erottamiseksi näytteestä. Nestemäisen suodatusainemenetelmän edullisen suoritusmuodon mukaisesti verinäyte hujoi-tetaan ennen linkoamisvaihetta, mikä saa nestemäisen suodatusaineen selektiivisesti vastaanottamaan patogeeniset mikro-organismit. Muita esikäsittelyaineita, kuten koaguloitumisen estoaineita, käytetään myös verinäytteen preparointiin. Jotkut edellä mainitussa parannetussa menetelmässä käytetyn edullisen nestemäisen suodatusaineen aineosat ovat sopimattomia käytettäväksi joidenkin esikäsittely- 3 60888 ja/tai hajotusaineiden kanssa. Lisäksi tällaiset aineet sekoittuvat nestemäisen suodatusaineen kanssa, jos ne lisätään siihen ennen ajankohtaa, jolloin verinäyte lisätään suljettuun steriiliin vyöhykkeeseen, ja kun tällaiset aineet kerran ovat näin sekoittuneet, ne eivät voi poistua nestemäisestä suodatusaineesta riittävän nopeasti käsitelläkseen verta tehokkaasti. Sen tähden on tarpeen joko altistaa verinäytteet ulkoisen kantaminoitumisen mahdollisuudelle sekoittamalla verinäyte esikäsittely- ja/tai hajotusaineiden kanssa ennen näytteen tuomista suljettuun steriiliin systeemiin, tai käyttää erikoislaitetta, jolloin käsittelyaineet voivat olla suljetun systeemin sisällä, mutta erillään nestemäisestä suodatusaineesta, kunnes laite pannaan käyntiin. Tämäntyyppinen laite on esitetty US-patenteis-sa n:o 3 875 012 ja 3 932 222.

Lisäksi edellä kuvattu parannettu menetelmä patogeenien mikro-organismien havaitsemiseksi verinäytteistä käsittää nestemäisen suodatusaineen käytön sentri -fugiputkessa, jossa on itsetiivistyvä sulkuelin, jonka läpi voidaan pistää injektioneula, putken päässä, jota vastaan verinäyte ja nestemäinen suodatusaine pakotetaan linkoamalla. On havaittu, että jotkut raskaammista patogeeneistä mikro-organismeistä, jotka nestemäinen suodatusaine ottaa vastaan, voivat linkoa-misvoiman vaikutuksesta kulkea koko suodatusainekerroksen läpi, ja ne joutuvat siten sentrifugiputken pohjan lähelle, ja ellei nestemäisen suodatusaineen erottamisen ja talteenoton aikana noudateta suurta huolellisuutta, voivat jotkut patogeenit mikro-organismit jäädä sentrifugiputkeen. Uskotaan, että patogeenien mikro-organismien häviötä tällaisissa tapauksissa tapahtuu, koska kulkiessaan koko suodatusainekerroksen läpi, patogeenit mikro-organismit asettuvat sentri-fugiputken seinämän ja injektioon käytettävän sulkukappaleen muodostamaan rakoon.

Siten on toivottavaa käyttää suljettua, steriiliä menetelmää verinäytteessä mahdollisesti olevien patogeenien mikro-organismien erottamiseksi ja väke-vöimiseksi tarvitsematta esisekoittaa verinäytettä voimakkaasti kontaminoivassa ympäristössä käyttämättä erikoisesti suunniteltua laitetta menetelmän esikäsit-telyvaiheen suorittamiseksi.

Tämän keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti saadaan menetelmä patogeenien mikro-organismien havaitsemiseksi, joita näytenesteen epäillään sisältävän. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) mainittu näyte, kuten veri, luuydinneste, selkäydinneste, keuhkopussi-neste tai virtsa, puristetaan linkoamalla 1500-3000 x g:ssä kerrosta muodostavaa nestettä vastaan, joka neste on myrkytön mainituille patogeenisille mikro-organismeille, hydrofobinen ja veden kanssa sekoittamaton, ja jonka tiheys on suurempi kuin mainitun näytteen tiheys, kuten inerttiä fluoroitua hiilivetyä vastaan, jonka tiheys on noin 1,2-2,0 g/cm^, kiehumapiste noin 90-210°C ja keskimääräinen mole- 11 60888 kyylipaino noin 300-850, jolloin annetaan keskipakovoiman vaikuttaa niin pitkä aika, että patogeeniset mikro-organismit ehtivät siirtyä mainittuun kerrosta muodostavaan nesteeseen asti, mutta ne eivät ehdi kulkea tämän nestekerroksen läpi, jotta pääosa läsnäolevista patogeenisistä mikro-organismeista väkevöityy kerrosta muodostavaan nesteeseen ja tämän ja nestemäisen näytteen rajapintaan, b) linkoamisen jälkeen poistetaan nestemäisen näytteen pääosa koskematta sen alinta osaa, joka lepää kerrosta muodostavan nesteen päällä, jotta ei poisteta rajapinnassa tai lähellä sitä olevia patogeenisiä mikro-organismeja, ja c) analysoidaan jäljellä oleva, kerrosta muodostavan nesteen ja nestemäisen näytteen alimman osan sekä patogeeniset mikro-organismit käsittävä aineseos.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa kaikentyyppisille kehon nesteille, kuten verelle, luuydin- ja selkäydinnesteelle, keuhkopussinesteelle, virtsalle jne. Lisäksi menetelmää voidaan soveltaa mihin tahansa näytteeseen, joka sisältää mikro-organismeja, mikro-organismien väkevöimiseksi ja erottamiseksi mistä tahansa mikrobien vastaisista tekijöistä, joita on läsnä näytenesteessä, esimerkiksi elintarvikkeissa, kuten maidossa jne. Yleensä, käytettynä verinäytteen yhteydessä, menetelmä käsittää hajotetun verinäytteen kerrostamisen suhteellisen ohuelle kerrokselle suuren tiheyden omaavaa, ei-myrkyllistä, veden kanssa sekoittamatonta, hydrofobista kerroksen muodostavaa nestettä. Tällainen kerroksen muodostava neste on yhteensopiva hajotus- ja muiden veren käsittelyaineiden kanssa ja tällaiset aineet erottuvat nopeasti tästä kerroksen muodostavasta nesteestä niiden sekoittuessa sen kanssa. Mahdollisen kontaminoitumisen estämiseksi verinäyte edullisesti ruiskutetaan steriiliin suljettuun vyöhykkeeseen, joka sisältää sekä edellä kuvatun kerroksen muodostavan nesteen että tehokkaan määrän ha-jotusainetta ja/tai muita verenkäsittelyaineita, joten verinäytettä käsitellään in situ. Suljetun steriilin vyöhykkeen sisältämä verinäyte lingotaan, jolloin verinäyte painautuu sentrifugiastiassa olevaa kerroksen muodostavaa nestettä vastaan. On havaittu, että tällaisen linkoamisen aikana pääasiallisesti kaikki hajotetun verinäytteen sisältämät patogeenit mikro-organismit siirtyvät näytteestä ja kerääntyvät lähelle kerroksen muodostavan nesteen ja näytteen rajapintaa. Patogeenit mikro-organismit jopa läpäisevät tämän rajapinnan, joten linkoaminen on lopetettava ennen kuin ne ovat kulkeneet koko tämän nestekerroksen läpi. Tätä on verrattava nestemäisen suodatusaineen käyttöön, joka selektiivisesti vastaanottaa patogeenejä mikro-organismeja, ja jonka ainekerroksen läpi jotkut mikro-organismeista voivat kulkea täydellisesti ja joutua suljetuksi sentrifugiastian seinämän ja sulkuelimen väliin. Sensijaan patogeenien mikro-organismien kerros, joka muodostuu keksinnön mukaisessa menetelmässä, voidaan ottaa talteen ilman oleellista häviötä yksinkertaisesti erottamalla kerroksen muodostava neste ja pieni osa sen päällä olevaa verinäytettä. Niinpä kerroksen muodostajan läsnäolo hajotetun verinäytteen linkoamisen aikana sallii patogeenien mikro-organismien 5 60888 lääkeaineista ja antipatogeenisista tekijöistä. Talteenoton jälkeen patogeenit mikro-organismit voidaan analysoida sekä kvantitatiivisesti että kvalitatiivisesti .

Lingottaessa näyte painautuu kerroksen muodostavan nesteen pintaa vastaan pääasiallisesti kohtisuorassa kulmassa. Kerroksen muodostava neste jakautuu sulkuelimen sisäpinnalle ja täyttää sentrifugiastian seinän ja sulkuelimen välisen tilan estäen raskaampien patogeenien mikro-organismien pääsyn tähän rakomai-seen tilaan. Käytettäessä "pyörivä kuppi"-tyyppistä sentrifugia, tulisi sulku-elimen sisäpinnan olla kohtisuorassa sentrifugiastian pohjaa vastaan, ja käytettäessä kulmaroottori-tyyppistä sentrifugia, on sulkuelimen tasainen sisäpinta kulmassa, joka on komplementtikulma kulmalle, jossa linkoaminen suoritetaan.

Tämä rakenne tekee mahdolliseksi käyttää yleisesti saatavia kulmaroottorisentri-fugeja, joissa sentrifugiputket ovat vinossa kulmassa akselin suhteen, ja todellisuudessa antaa lyhyemmän tien kuljettavaksi patogeenille mikro-organismille näytenesteen läpi ennen sen rikastumista kerroksen muodostavan nesteen sisäpinnan läheisyydessä. Lyheramästä kulkutiestä on seurauksena suurempi keskimääräinen keksipakovoima, joka kohdistuu patogeenisiin mikro-organismeihin näytenesteen sisällä. Linkoamisesta tällä sentrifugiastialla on seurauksena patogeenisten mikro-organimien rikastuminen kerroksen muodostavan nesteen ja näytteen rajapinnalle ja osittain sentrifugiastian sivuseinämään. Näin rikastuneet patogeenit mikro- organismit voidaan helposti koota ja poistaa linkoamisen jälkeen. Siten pinnan sijainti sentrifugiastiassa sellaisessa kulmassa, että verinäyte ja kerroksen muodostava neste painautuvat pintaa vastaan pääasiallisesti kohtisuorassa kulmassa linkoamisen aikana takaa, että kerroksen muodostava neste sijoittuu pääasiallisesti tasaisesti yli pinnan, niin että se täysin sulkee kaikki välitilat, jotka pidättäisivät patogeenejä mikro-organismeja. Lisäksi tämän erikoisesti suunnitellun sentrifugiastian käytöstä on seurauksena linkoamistehokkuuden nousu: linkoaminen voidaan suorittaa pienemmällä g-arvolla, tai lyhyemmässä ajassa kuin tavanomaisessa linkoamisessa.

Keksinnön mukaisen menetelmän edullisen suoritusmuodon mukaisesti veren-hajoitus- ja muut verenkäsittelyaineet, joita käytetään verinäytteen valmistamiseen, sijaitsevat sentrifugiastiassa kerroksen muodostavan nesteen kanssa, joka ei sekoitu käsittelyaineliuoksen kanssa. Tämä on suuri etu verrattuna edellä kuvattuihin tavanomaisiin nestemäisiin suodatusaineisiin, joissa on aineosia, jotka ovat yhteensopimattomia joidenkin verenkäsittelyaineiden kanssa. Lisäksi tavanomaiset nestemäiset suodatusaineet ovat vesipitoisia, joten ne sekoittuvat verenkäsittelyaineiden kanssa.

Tämä keksintö käy helpommin ymmärrettäväksi tutkimalla piirroksia, joista: kuva 1 on poikkileikkauskuva tämän keksinnön mukaisesta edullisesta sentrifugiastiasta 20, ja 6 60888 kuvat 2-9 esittävät keksinnön mukaisen menetelmän vaiheita, jossa menetelmässä käytetään kuvan 1 mukaista sentrifugiastiaa .

Keksintö kohdistuu myös keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoiseen laitteeseen, joka käsittää suljetun sentrifugiastian 20, joka on itsetiivisty-västi suljettu sulkuelimillä 24 ja 26, jolloin astian sisäosa käsittää tyhjän tilan 32, jota pidetään ilmakehän painetta alemmassa paineessa, tämän pohjalla olevan suuren tiheyden omaavan, ei-myrkyllisen, veden kanssa sekoittumattoman, hydrofobisen kerroksen muodostavan nesteen 28, kuten inertin fluoroidun hiilivedyn, jonka tiheys on noin 1,2-2,0 g/cm3, kiehumapiste noin 90-210°C ja keskimääräinen molekyylipaino noin 300-850, joka neste pystyy kokoamaan pääasiallisesti kaikki nestemäisestä näytteestä poistuvat patogeenit mikro-organismit, ilman että hukataan patogeenejä mikro-organismeja sentrifugiputken välitiloihin. Sentrifugiastia 20 käsittää edullisesti pitkän putkimaisen sentrifugiputken 22, jossa on tavanomainen sulkuelin 24, jonka läpi voidaan pistää injektioneula ja joka tiivisti sulkee sen yläpään, sekä uutta rakennetta oleva sulkuelin 26, joka tiiviisti sulkee sen alapään. Kun sentrifugiastiaa 20 käytetään tämän keksinnön menetelmän edullisessa suoritusmuodossa patogeenien mikro-organismien havaitsemiseksi, voidaan sekä sopiva määrä kerroksen muodostavaa nestettä 28 että veren-käsittelyaineita 30 sijoittaa siihen etukäteen, varastoimiskelpoisen järjestelmän saamiseksi.

Sentrifugiputki 22 voi olla silikonoitua lasia tai kovamuovia, kuten poly-karbonaattia tai polypropeenia. Sulkuelimet 24 ja 26 voivat olla itsetiivistyvää kumia. Sulkuelimillä 24 ja 26 on kummassakin lovet, 24a ja vastaavasti 26a, tavallisten injektioneulojen läpiviennin helpottamiseksi. Tyhjötila 32 pidetään ilmakehän painetta alemmassa ennalta määrätyssä paineessa, niin että sentrifugi-astiaan voidaan injektoida tunnettu määrä nestettä, ilman että syntyy ylimääräistä painetta, joka aiheuttaisi sulkuelinten 24 ja 26 siirtymisen paikoiltaan sentrifugiputken 22 päistä.

Viitaten erityisesti sulkuelimeen 26, joka on sentrifugiputken 22 alapäässä, havaitaan, että sulkuelimen 26 sisäpinta 34 muodostaa vinon kulman sentrifugiputken 22 seinämään nähden.

On huomattava, että sentrifugiastia 20 on erityisesti suunniteltu käytettäväksi kulmaroottorisentrifugissa ja että sisäpinnan 34 kulma on roottorin kulman komplementtikulma. On kuitenkin huomattava, että tämän keksinnön mukaista laitetta voidaan myös käyttää tavanomaisessa "pyörivä kuppi"-tyyppisessä sentrifugissa. Jälkimmäisessä tapauksessa pinnan 34 tulee olla kohtisuorassa sentrifugiastian 20 pohjaa vastaan ja sitä käytetään muutoin samalla yleisellä tavalla, kuten seuraa-vassa kuvataan kuvassa 1 esitetylle sentrifugiastialle 20. Pinnan 34 tulee olla sileä ja pääasiallisesti vapaa välitiloista ja raoista, joihin patogeenit mikro-organismit voivat kerääntyä. Lisäksi ympyrämuotoisen tiivistysalueen pinnan 34 ympärillä, jossa sulkuelin 26 kohtaa sentrifugiputken 22 seinämät, tulee olla mahdollisimman pieni, niin että rajapinta ei muodosta laajaa ympyränmuotoista τ 60888 rakoa, johon patogeenit mikro-organismit voivat kerääntyä.

Miten edellä mainittiin, sileän pinnan 3i» kaltevuuskulma sentrifugiput-ken 22 seinämän suhteen määräytyy sentrifugin mukaan, ja käytettäessä kulma -roottorisentrifugia, jossa siis putket ovat vinossa kulmassa akselin suhteen, on pinta 3^ kömpiementtikulmassa roottorin suhteen. Kun roottorikulmat ovat väliltä n. 60-10°, on pinnan 3^ kulma, eli kaltevuuskulma 36 sentrifugiputkessa, vastaavasti väliltä 30-80°. Kaltevuuskulma 36, joka on esitetty kuvassa 1, on n. 3¾°. Siten esimerkiksi, kun sentrifugiastia 20 sijoitetaan kulmaroottorisentri-fugiin, jossa linkoaminen tapahtuu n. 56°:een kulmassa, sen sisältämät nesteet painautuvat pintaa 3^ vastaan pääasiallisesti kohtisuorassa kulmassa.

On huomattava, että kuten kuvassa 1 on esitetty, sulkuelin 26 on muodostettu yhdestä kumikappaleesta. Tällainen tulppa voidaan valmistaa monista eri aineista, jotka antavat sileän pinnan ja hyvän tiivistyksen sentrifugiputken 22 seinämän kanssa, ja jotka ovat injektioneulalla läpäistävissä eivätkä ole myrkyllisiä patogeeneille mikro-organismeille. Eräs tapa valmistaa tällainen tulppa on tehdä se in situ käyttäen ainetta, joka voidaan kaataa sentrifugiputkeen 22, sen jälkeen, kun tavallinen kumitulppa, kuten sulkuelin 2U, on pantu sentrifugiputken 22 alapäähän. Aineen tulee olla riittävän juoksevaa ja sen kovettumis-ajan tulee olla kyllin pitkä. Kbvetuttuaan aine muodostaa sileän pinnan 3^ ja hyvän tiivisteen sentrifugiputken 22 seinien kanssa. Esimerkkejä tällaisista aineista ovat tavalliset kylpyammeen tiivistysaineet ja silikonipohjaiset hartsit, jotka valmistetaan matalaviskoosisessa nestemäisessä muodossa ja jotka kovettuvat muodostamaan joustavan aineen. Esimerkki jälkimmäisestä ainetyypistä on silikonipohjainen nestemäinen hartsi, jota myydään kauppanimellä SYLGARD 13^ ja jota tuottaa Dow Corning, Midland, Michigan. Käytettäessä mainittua ainetta on suotavaa käsitellä sentrifugiputken 22 sisäseinämää pohjustusaineella hyvän tiivistyksen varmistamiseksi kovettuneen silikonihartsin ja sentrifugiputken 22 seinän välillä. Sopiva pohjustusaine on DC 1200 (valmistaja Dow Corning).

Niinpä esimerkiksi sileä kalteva pinta 3l, joka on esitetty kuvassa 1 yhtenäisen sulkuelimen 26 sisäpintana, voidaan valmistaa pohjustamalla sentrifugiputken 22 sisäseinämä pohjustusaineella, kuten edellä mainitulla DC 1200:11a, panemalla paikoilleen tavallinen kumitulppa, kuten sulkuelin 2kt kaatamalla tietty määrä nestemäistä silikonipohjaista hartsia, kuten SYLGARD 13^, sentrifugiputkeen 22, sijoittamalla koko putki haluttuun kaltevuuskulmaan ja kovettamalla silikoni-hartsi sopivissa olosuhteissa joustavan tulpan muodostamiseksi. Oikea kaltevuus-kulma voidaan helposti muodostaa linkoamalla putkea, jossa on kovettuvaa hartsia.

Kun sileä pinta 3^ on muodostettu, lisätään tehokas määrä tämän keksinnön mukaista kerroksen muodostavaa nestettä sentrifugiastiaan 20. Käytetyn kerroksen muodostavan nesteen määrän tulisi olla riittävä peittämään täydellisesti pinta 3*4 lingottaessa, mutta ei niin suuri, että se merkittävästi rajoittaisi veren määrää, jonka sentrifugiastia 20 voi vastaanottaa. Kerroksen muodostavan nesteen 8 60888 määrä riippuu mm. tulppien rakenteesta, jäljelle jääneen veren tilavuudesta ja nesteen haihtuvuudesta. Edullinen määrä kerroksen muodostavaa nestettä on n.

3,3-30,0 tilavuus-^, laskettuna kerroksen muodostavan nesteen ja tämän päällä lopussa olevan näyteosan tilavuudesta, siis näytteen yläosan poistamisen jälkeen. Kerroksen muodostavan nesteen tulisi olla myrkytön patogeeneille mikro-organismeille ja suhteellisen inertti tutyylikumin, silikonikumin ja muuntyyppisten elastomeerien suhteen, joita käytetään edellä kuvattujen injektioon käytettävien sulkukappaleiden valmistukseen. Kerroksen muodostavan nesteen tiheys voi olla vä-liitä n. 1,2-2,0 g/cm , edullisen alueen ollessa väliltä n. 1,6-2,0 g/cm . Sopivia kerroksen muodostavia nesteitä ovat fluoratut hiilivedyt, joiden molekyylipainot ovat väliltä n. 300 - n. 850. Lisäksi, fluoratut hiilivedyt, joilla on edellä esitetyt ominaisuudet ja jotka haihtuvat suunnilleen samalla nopeudella kuin vesi, kun kerroksen muodostavaa nestettä sisältävä seos on pantu tavallista tyyppiä olevalle viljelylevylle, ovat edullisia. Sopiva kiehumapiste on n. 90 - 210°C, ja edullisesti n. 100 - 1*+0°C. Kerroksen muodostavalla nesteellä tulisi myös olla alhainen höyrynpaine, jotta sulkuelin ei poistuisi putkesta valmistusvaiheiden, kuten esimerkiksi autoklaavikäsittelyn, aikana. Fluorattujen hiilivetyjen, joita kauppanimellä FDJORINERT myy 3M Company, Minneapolis, Minnesota, on havaittu toimivan hyvin. Varsinkin FLUORINERT-tuotteet FC-75, FC-U8 ja FC-*+3 on havaittu olevan erityisen käyttökelpoisia. Nämä aineet ovat kirkkaita, värittömiä nesteitä, kiehumapiste 90-210°C, tiheys 1,2-2,0 g/cm^ ja keskimääräinen molekyylipa!no 3ΟΟ-85Ο. On ilmeistä, että kerroksen muodostava neste tiivistää sisätiloja, murtumia ja rakoja sekä sentrifugiputken 22 sileällä pinnalla 3¾ ja rajapinnalla sentrifugiputken 22 seinämien ja sulkukappaleen 26 välissä. Siten patogeenit mikro-organismit, jotka muuten voivat jäädä suljetuiksi tällaisiin välitiloihin eikä niitä sen tähden saataisi talteen, saadaan tarkemmin talteen. Lisäksi ilmeisesti kerroksen muodostava neste pehmentää patogeenisten mikro-organismien törmäystä pakotettaessa niitä ulos suspension sisältämästä näytteestä linkoamisen aikana. Tämä vähentää patogeenisten mikro-organismien vaaraa vaurioitua, mitä muutoin törmäyksessä voisi tapahtua.

Sen jälkeen, kun kerroksen muodostava neste on kerrostettu sentrifugi-astiaan 20, kerrostetaan siihen myös vesiliukoisia verenkäsittelyaineita 30. Tällaiset käsittelyaineet voivat olla esimerkiksi soluja hajottavia aineita ja/tai koaguloitumisen estoaineita. Mitä tahansa sopivaa soluja hajottavaa, mikro-organismeille myrkytöntä ainetta voidaan käyttää. Eräs edullinen tällainen soluja hajottava aine on puhtaan saponiinin vesiliuos. Tosin on huomattava, että monien saponiinien tiedetään olevan myrkyllisiä patogeeneille mikro-organismeille. Kuten kuitenkin US-patentissa n:o 3 883 *+25 on esitetty, on kehitetty menetelmä myrkyllisten aineosien poistamiseksi tällaisista saponiineista. Käyttökelpoinen sapo-niiniliuos voi myös sisältää koaguloimisen estoaineen ja/tai hapen poistajan.

9 60888

Edullinen koaguloituraisenestoaine on natriumpolyanetolisulfonaatti (SPS) tai hepariini. Natriumpolyanetolisulfonaatti on edullinen, koska se ei toimi ainoastaan koaguloitumisen estoaineena, vaan estää myös granulosyyttäen ja monosyyttien fagosyyttisen aktiivisuuden. On edullista, että tätä käsittelyaineen vesipitoista liuosta on ainakin 1,0 tilavuus-# kokonaisnesteestä keskipakoputkessa 22 käsittäen käsittelyliuoksen, näytenesteen ja kerroksen muodostajan, ja edullisesti n. 7,6 - n. 17,5 tilavuus-# siitä.

Kun käsittelyaineet 30 on kerrostettu sentrifugiastiaan 20, voidaan sulku-elin 2h panna paikoilleen ja tila 32 saattaa haluttuun ilmakehän painetta alempaan paineeseen.

Viitaten kuviin 2-9 esitetään kaavamaisesti analyysi sarja, joka kuvaa tämän keksinnön erästä edullista suoritusmuotoa. Esimerkkinä voidaan menettely, joka suoritetaan tämän keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti patogeenien mikro-organismien havaitsemiseksi verinäytteessä, mukavasti suorittaa laitteistolla, joka käsittää seuraavat osat: edellä kuvattu sentrifugiastia 20, joka sisältää kerroksen muodostavaa nestettä 28 ja verenkäsittelyaineet 30; astia voi olla tilavuudeltaan 12-1¾ ml, steriili lasiruisku ja kertakäyttöinen injektioneula (pituus: 3,81 cm; ulkoläpimitta: 1,7 mm), steriili lasiruisku ja kertakäyttöinen injektioneula (pituus: 2,5¾ cm; ulkoläpimitta: 0,8l mm), injektioneula (pituus: 1,59 cm; ulkoläpimitta: 0,5 mm), jonka sisään on pantu puuvillaa (tätä neulaa käytetään poistoputkena), 3 veri-agar-levyä, suklaa-agar-levy ja sabouraud-levy.

Havaitaan, että lukuunottamatta sentrifugiastiaa 20 voidaan käyttää eri tyyppisiä hyvin tunnettuja laboratoriolaitteita ja viljelyväliaineita tämän keksinnön mukaisen uuden menetelmän suorittamiseen. Erityisesti on huomattava, että edellä esitetyt viljelyväliaineet ovat pelkästään esimerkkejä ja ovat yleensä edullisia käytettäviksi tavallisimpien tunnettujen patogeenien mikro-organismien havaitsemiseen. Ehdotetut veri-agar-levyt ovat tavallisesti käytettyjä veri-agar-levyjä, joissa on lampaan verta ja perusravintoainetta, kuten sokeria, joita pidetään koossa jähmettävällä agar-aineella Petri-maljalla. Suklaa-agar-levy on suunniteltu tiettyjen arkojen patogeenien mikro-orgamismien, esim. hemophilus-baktoerin kasvattamiseen. Sabouraud-levy on erikoisesti suunniteltu sienien kasvattamiseen.

Erilaisia laitteita voidaan käyttää tämän keksinnön menetelmässä, vastaavasti voidaan edellä lueteltuja laitteita ja aineita sopivasti käyttää tämän keksinnön piirissä seuraavansa esitetyllä tavalla. Sentrifugiastiu 20, joku on esitetty kuvassa 1, käyttöä varten se aluksi asetetaan niin, että sulkuolin 2b ίο 6088 8 sileine kaltevine pintoineen 3l on astian 20 alapäässä, niin että kerroksen muodostava neste 28 ja verenkäsittelyaine 30 lepäävät sileällä kaltevalla pinnalla 3l. On huomattava, että asian valaisemiseksi kuvassa 2 on kuvattu kaksi erillistä nestetasoa, jotka edustavat kerroksen muodostavaa nestettä 28 ja käsittelyainetta 30. Käytännössä voi muodostua näiden kahden aineen pysymätön emulsio tai seos, mikä ei millään tavalla vaikuta vahingollisesti tässä esitettyyn menetelmään, koska näiden kahden nesteen erottuminen lingottaessa tapahtuu nopeasti.

Seuraavaksi ennalta määrätty määrä verinäytettä 38, joka on otettu potilaalta, esimerkiksi 7 nil verta, injektoidaan sentrifugiastian 20 tyhjötilaan, kuten kuvassa 3 on esitetty käyttäen tavallisen tyyppistä ruiskua 1+0. Vaihtoehtoisesti näyte voidaan imeä suoraan astiaan 20 käyttäen standardi-kaksoisneulaa, joka on varustettu tavanomaisella tyhjöverenimulaitteella, jollaista myy kauppa-merkillä "Vacutainer" Beckten Dickenson. Sitten astiaa 20, joka sisältää verinäytteen 38, verenkäsittelyaineen 30 ja kerroksen muodostavan nesteen 28, sekoitetaan sen varmistamiseksi, että verenkäsittelyaine 30 täydellisesti sekoittuu verinäytteen 38 kanssa, kuva k.

Sen jälkeen, kun verinäytettä 38 on käsitelty tällä tavalla, lingotaan sentrifugiastia 20 verinäytteessä 1+2 olevien patogeenien mikro-organismien saattamiseksi pois suspensiosta ja keräytymään suuren tiheyden omaavan kerroksen muodostavan nesteen 28 ja jäljelle jääneen näytteen osan rajapinnalle. Jotkut patogeenit mikro-organismit kerrostuvat todellisuudessa sentrifugiputken 22 sivu-seinälle lähelle sileän pinnan 3l+ yläreunaa kohtaan 22a. Tämä linkoamisvaihe on esitetty kaavamaisesti kuvassa 5. Linkoamisnopeus ja -aika voi vaihdella laajalti riippuen sentrifugiastian 20 materiaalista ja sentrifugityypistä. Linkoaminen voidaan sopivasti suorittaa keskipakovoimalla n. 1 500 - 6000 x g, ja edullisesti n. I5OO - 3000 x g. Kuten kuvassa 5 on esitetty, käytetään kaltevuuskulmaroot-torisentrifugia, jossa sentrifugiastia 20 asetetaan esimerkiksi 56°:een kulmaan (esitetty kaarella 1+3) linkoamisen ajaksi. Niinpä, jos sileä kalteva pinta 3I+ on 3l+°:een kulmassa sentrifugiastian 20 sisäseiniin nähden, painautuvat käsitelty verinäyte 1+2 ja kerroksen muodostava neste 28 sileää kaltevaa pintaa 3I+ vastaan suhteellisen kohtisuorassa kulmassa linkoamisen aikana. On huomattava, että käytettäessä pyörivä-kuppi1inkoa, sentrifugiastiaa 20 lingotaan pääasiallisesti 0°:een kulmassa vaakatason suhteen. Niinpä tässä tapauksessa tason 3I+ kulma on n. 90°, ja sulkuelin 26 voidaan korvata kumisella sulkuelimellä, jolla on tasainen sisäpinta.

Kun linkoamisvaihe on loppuun suoritettu, voidaan sentrifugiastia 20 poistaa sentrifugista ja pääosa käsitellystä verinäytteestä 1+2, josta siis patogeenit mikro-organismit on erotettu, voidaan poistaa (siinä olleet patogeenit mikro-orgunisrnit ovat kerääntyneet näytteen pohjalle, jättäen täten näytteen yläosan pääasiallisesti vapaaksi patogeeneistä mikro-organismeista). Tämä vaihe on esi- 11 608 8 8 tetty kuvassa 6. Poistamisen helpottamiseksi pistetään poistoneula 1+1+, joka on puuvillalla täytetty injektioneula, sulkuelimen 2b läpi. Toinen injektioneula, johon on liitetty ruisku 1*5, voidaan sitten pistää sulkuelimen 26 läpi käsitellyn verinäytteen k2 pääosan, josta siis patogeenit mikro-organismit on erotettu, poistamiseksi. Kun sentrifugiastian tilavuus on 12 - n. lU ml, käytetään sopivasti neulaa, jonka pituus on 3,81 cm ja ulkoläpimitta 1,27 mm, ja verinäytteestä h2 jätetään vain alin osa noin 1,3-1,7 ml. On edullista, että mainittu pääosa käsitellystä verinäytteestä imetään sentrifugiputken 22 sisältä kohdasta, joka on mahdollisimman kaukana kaltevasta pinnasta 3*+, patogeenit mikro-organismit sisältävän kerroksen sekoittumisen välttämiseksi, joka kerros sijaitsee näiden kahden nesteen rajapinnan läheisyydessä, lähellä kaltevan pinnan 3l+ yläreunaa. Verinäytettä jätetään sentrifugiputkeen senverran, että jäljelle jääneestä neste-seoksesta kerroksen muodostavan nesteen osuus on n. 1+,7-28,6 tilavuus-#, edullisesti alle n. 20 tilavuus-#, koska suuremmat määrät voivat vaikuttaa vahingollisesti patogeenien mikro-organismien pesäkkeiden morfologiaan patogeenien mikro-organismien viljelykokeissa.

Kun pääosa käsitellystä verinäytteestä on poistettu, kumpikin injektioneula voidaan poistaa sulkuelimistä 2b ja 26, ja sentrifugiastia 20 ravistetaan varovaisesti sen sisällön sekoittamiseksi, kuva 7. Haluttaessa voidaan poisto-neula 1+1+ jättää paikoilleen sulkuelimeen 2b seuraavaa vaihetta varten. Käsitellyn verinäytteen b2 alempaan osaan ja kerrosta muodostavaan nesteeseen kerääntyneiden patogeenien mikro-organismien uudelleensuspendoiminen takaa suuremman ja tasaisemman talteenoton. Tämän jälkeen patogeenejä mikro-organismeja sisältävä seos poistetaan sentrifugiastiasta 20, kuva 8. Kuten edellä esitettiin, voidaan haluttaessa poistoneula H pistää sulkuelimen 2b läpi jäljellä olevien aineosien poistamisen helpottamiseksi. Ruisku 1+6, johon on liitetty injektioneula, pistetään sulkuelimen 26 läpi kerroksen muodostavan nesteen 28, käsitellyn verinäytteen b2 pienemmän jäljelle jääneen osan ja siinä olevien patogeenisten mikro-organismien muodostaman seoksen 1+8 poistamiseksi. Havaitaan, että erityisen hyvään talteenottoon päästään, jos näiden aineosien poistamiseen käytetty injektioneula pistetään kaltevan pinnan 3*+ alapäähän, koska se muodostaa eräänlaisen suppilon, johon patogeenit mikro-organismit sisältävä nesteseos virtaa. Seoksen 1+8 tilavuuden tulisi olla n. 1,5 ml. Tämä seos jaetaan sitten "bakteerien viljely-väliaineeseen, kuva 9· Seos voidaan jakaa esimerkiksi seuraavasti:

Yhdelle veri-agarlevylle pannaan noin 0,3 ml seosta ja levy inkuboidaan 36C fcissa aerobisessa atmosfäärissä. Kahdelle veri-agarlevylle pannaan noin 0,3 ml seosta ja ne inkuboidaan 36°C:ssa anaerobisessa ympäristössä. Yhdelle suklaa-agarlevylle pannaan noin 0,3 ml seosta ja se inkuboidaan 36°C:ssa. Sabouraud-levylle pannaan noin 0,3 ml seosta ja se inkuboidaan 25°C:ssa aerobisessa ympäristössä. Ktsvuväliaine tarkistetaan päivittäin pesäkkeiden läsnäolon suhteen 12 60888 käyttäen mikroskooppisia analyysimenetelmiä. Patogeenien mikro-organismien lukumäärä yhdessä ml:ssa verta määritetään kertomalla pesäkkeiden lukumäärä korjaus-kertoimella, joka ottaa huomioon mikro-organismin talteenottonopeuden, verinäytteen ja kerroksen muodostavan nesteen tilavuudet sekä levylle siirretyn seosmäärän. Edellä esitetyssä esimerkissä korjauskerroin on 1,1+, Jälleen on huomattava, että keksinnön mukaisen menetelmän prosessivaiheet, laitteet ja varusteet, ja viljelyväliainetyypit voivat vaihdella. Niinpä voidaan käyttää tunnettua laitetta verinäytteen sekoittamiseksi koaguloimisen estoaineen ja/tai veren hajotusaineen kanssa. Joissakin tapauksissa vaihe, jossa verinäytteestä 1+2 poistetaan pääosa (kuva 6), voidaan jättää pois, jolloin suoraan poistetaan verinäytteen 1+2 alin, suspendoituja patogeenejä mikro-organismeja sisältävä osa sentrifugiastian 20 pohjalta yhdessä kerroksen muodostavan nesteen 28 kanssa, vrt. kuva 8. Monet muutkin muunnelmat ovat mahdollisia, f

Seuraava esimerkki on esitetty tämän keksinnön ymmärtämisen helpottamiseksi.

Es imer kki

Esimerkissä suoritetaan vertailu US-^patentissa n:o 3 928 139 esitetyn menetelmän, jossa käytetään nestemäistä suodatusväliainettä, ja tämän keksinnön mukaisen menetelmän välillä. Taulukossa I on menetelmistä käytetty nimitystä "nestemäinen suodatusaine" ja vastaavasti "kerroksen muodostava neste", jolloin suluissa olevat tiedot esittävät käytettyä nestemäistä suodatusainetta (esim.

50-$ sakkaroosiliuos) ja vastaavasti käytettyä kerroksen muodostavaa nestettä (esim. Fluor inert FC-1+8). Jokainen tutkittu näyte (1-21 taulukossa I) on valmistettu 7 ml:n steriileistä hajotetuista verinäytteistä, jotka on saatu terveiltä verenluovuttajilta, ja jokainen näyte ympättiin 0,3 ml:11a ihmiselle patogeenejä mikro-organismeja tunnetuissa eri väkevyyksissä (joko Escherichia coli tai Candida albicans, kuten taulukossa I on esitetty).

Kaikissa kokeissa käytettiin edellä kuvattua sentrifugiastiaa 20, käytet-tiinpä sitten nestemäistä suodatusainetta tai kerroksen muodostavaa nestettä. Vaikutuksen tutkimiseksi, kun käytetään pintaa, joka on sijoitettu pääasiallisesti kömpiementtikulmaan kulman suhteen, jolla astia 20 lingotaan, jolloin joissakin astioista 20 käytettiin kumitulppia, joilla oli tasaiset, sileät sisäpinnat, niin että pohjatulpan sisäpinta oli vaakasuorassa tasossa, kun astia 20 oli pystyasennossa. Näistä pohjatulpista käytetään nimitystä "vaakasuora" taulukossa I. Käytettiin myös erikoisvalmisteisia pohjan sulkuelimiä, jotka oli valmistettu käyttäen tavallisia kumitulppia yhdessä joko tavallisen kylpyammetiiviistysaineen tai silikonipohjaisen hartsin (kauppanimi SYLGARD 13*+, myy Dow Corning, Midland, Michigan) kanssa, pohjapinnan saamiseksi astiaan 20, jolla astian 20 seinämien suhteen tulisi olla kulma, joka on pääasiallisesti sen kulman, jossa astiaa 20 lingotaan, kömpiementtikulma. Linkoamiset, jotka suoritettiin jokaisen taulukossa I luetellun näytteen yhteydessä käyttäen viistettyä pohjatulppaa, suoritettiin 13 60888 kulmaroottorisentrifugissa, jossa putket olivat kaltevassa kulmassa akselin suhteen ja linkoamiskulma oli n. 56°. Niinpä niillä sentrifugiputkilla, joissa oli viistetyt pohjatulpat (viistetty n. 3^°:een kulmaan) oli pohjapinta pääasiallisesti kohtisuorassa kulmassa keskipakovoiman suuntaan nähden. Lisäksi ne näytteet, joilla käytettiin vaakasuoria pohjatulppia ( kuten taulukossa I on nimetty) lingot-tiin pyörivä kuppi-tyyppisessä sentrifugissa, joka toiminnan aikana panee sentri-fugiastian 20 pyörimään tasossa, joka on pääasiallisesti yhdensuuntainen maan tason kanssa. Siten keskipakovoimaa käytettiin suunnassa, joka oli pääasiallisesti kohtisuora vaakasuorien pohjatulppien pintaa vastaan.

Kun käytettiin nestemäistä suodatusväliainettä, pantiin jokaiseen astiaan 20 1,2 ml vesiliuosta, joka sisälsi 1,5 paino-% gelatiinia, sekä sakkaroosia, jonka väkevyys on esitetty taulukossa I. Jokainen astioista 20 käännettiin ylösalaisin ja jäähdytettiin i*°C :seen tässä asennossa ennen ympätyn verinäytteen lisäämistä. Sen jälkeen, kun jokainen astia 20 oli saanut tarvittavan määrän verinäytettä, joka sisälsi tunnetun määrän ihmiselle patogeenejä mikro-organismeja, se pantiin vesihauteeseen edelleen nurinkäännettynä. Vesihaude asetettiin k2C 5C:seen ja gelatiinin annettiin sulaa. Jokainen putki lingottiin sitten n.

56°:n kulmassa roottorisentrifugissa. Linkoaminen kesti 30 minuuttia ja linkoa-misvoima oli 1500 tai 3000 x g, kuten taulukossa I on osoitettu.

Käsitelty verinäyte voitiin poistaa kahdella eri tavalla: "kolmen sisäänpiston" menetelmän mukaan pistettiin 10 ml:n ruisku pohja-tulpan läpi n. 6,7 ml :n jäljelle jäänyttä verinäytettä poistamiseksi. Sitten astia 20 saatettiin sekoitettavaksi pyörre sekoittimessa n. 1/2-2 minuutiksi. Sekoi-tusvaiheen jälkeen 1,5 ml sekoitettua suodatusainetta ja osa verinäytteestä, joka oli jäänyt astiaan 20, poistettiin tavallisella ruiskulla, johon oli liitetty neula. (Ensimmäinen sisäänpisto on verinäytteen injektointia varten, toinen sisäänpisto on suurimman osan verinäytteestä poistamista varten linkoamisen jälkeen, mutta ennen sekoittamista, ja kolmas sisäänpisto on jäljelle jääneen nestemäisen suodatusaineen ja verinäytteen alemman osan poistamista varten).

"Kahden sisäänpiston" menetelmän mukaan 1,5 ml nestemäistä suodatusainet-ta ja verinäytettä lähellä pohjatulppaa imettiin astian 20 pohjalta suoraan linkoamisen jälkeen. Nämä 1,5 ml, jotka käsittivät nestemäisen suodatusaineen ja verinäytteen alemman osan, johon patogeenit mikro-organismit olivat kerääntyneet sekoitettiin aineosien suhteellisen tasaisen jakautumisen saamiseksi. (Ensimmäinen sisäänpisto on verinäytteen injektointia varten astiaan 20 ja toinen sisään-pisto on n. 1,5 ml:n sekoitettua nestemäistä suodatusainetta ja verinäytettä imemistä varten astian 20 pohjalta.

Nämä kaksi menetelmää on esitetty taulukossa I merkinnällä "sisäänpistojen lukumäärä", mikä tarkoittaa jokaista näytettä menettelyn jälkeen, jossa on joko kaksi tai kolme sisäänpistoa.

^ 60888

Kummassakin tapauksessa levitettiin seuraavassa vaiheessa 5 näytettä, joista kukin sisälsi 0,3 ml astian 20 pohjalta imetystä 1,5 mlrsta, 5 agar-levyl-le. Inkuboinnin jälkeen näitä näytteitä verrattiin vertailulevyjen kanssa, jotka oli valmistettu lisäämällä sama tunnettu määrä patogeenejä mikro-organismeja, kuin mikä injektoitiin tutkittavaan verinäytteeseen, suolaliuokseen ja levitettiin 0,3 ml tätä suolaliuosta kullekin 5 agarlevylle. Prosentuaalinen talteenotto, joka perustuu näytelevyjen vertailuun vertailulevyjen kanssa, on esitetty taulukossa I.

Käytettäessä kerroksen muodostavaa nestettä, meneteltiin seuraavalla tavalla. Valmistettiin sentrifugiastia 20, jossa oli joko vaakasuora tai viistetty pohjatulppa, kuten edellä esitettiin. Jokainen astia 20 sisälsi 0,3 ml Fluorinert FC-i+ö (kirkas, väritön, fluoroitu hiilivety; kp. 150-200°C, tiheys

O

1,7-2,0 g/cnr ja keskimääräinen molekyylipaino U00-600, valmistaa 3 M Company, Minneapolis, USA'). Tämän jälkeen injektoitiin 7 ml hajotettua verta, joka oli kontaminoitu tunnetulla lukumäärällä patogeenejä mikro-organismeja, astian 20 yläpään tulpan läpi. Seuraavana vaiheena oli astioiden 20 linkoaminen samassa kulmaroottorisentrifugissa, jota käytettiin nestesuodatusainemenetelmässä. Linkoamisaika oli 30 minuuttia ja suhteellinen keskipakovoima oli 1500 tai 3000 3000 x g, kuten taulukossa I on esitetty. Kolmen sisäänpiston menetelmässä poistettiin n. 5,8 ml verinäytettä 10 ml:n injektioruiskun avulla pohjatulpan läpi. Kahden sisäänpiston menetelmässä tämä vaihe puuttui. Kimmassakin tapauksessa poistettiin astian 20 pohjalta 1,5 ml seosta, joka sisälsi n. 1,2 ml verinäytettä (alin osa) ja 0,3 ml Fluorinertiä. Sitten valmistettiin 5 näytelevyä, käyttäen 0,3 ml saatua seosta kussakin tapauksessa. Näytelevyt inkuboitiin ja verrattiin myöhemmin vertailutevyihin, jotka oli valmistettu samalla tavalla kuin edellä esitettiin, nestesuodatusväliainemenetelmän yhteydessä. Prosentuaalinen talteenotto käytettäessä kerroksen muodostajamenetelmää on esitetty taulukossa I.

Vaikka ei voida esittää tarkkaa teoriaa tulosten selittämiseksi, jotka on saatu tämän kokeen mukaisesti, saattaisi näytteen n:o 2 pieni talteenotettu määrä taulukossa I (jolloin käytettiin nestemäistä suodatusainetta; 50-% sakka-roosiliuos ja vaakasuora pohjatulppa) johtua patogeenien mikro-organismien joutumisesta loukkuun pitkin vaakasuoran pohjatulpan sisäreunaa lähelle astian 20 seinämää. Verrattaessa näytteen n:o 1 tuloksia näytteen n:o 3 tuloksiin, jossa käytettiin kolmen sisäänpiston menetelmää, nähdään, että talteenottomäärä näytteessä n :o 3 on suuresti parantunut. Tämä voitaisiin selittää sillä tosiasialla, että käytettäessä pienempää suhteellista keskipakovoimaa eivät patogeenit mikro-organismit ehtineet kerääntyä pöhjatulpan ja astian 20 seinän väliseen rakoon. Lisäksi kolmen sisäänpiston menetelmä sallii kaikkien patogeenien mikro-organismien, jotka on uudelleen suspendoitu jäljelle jääneeseen verinäytteeseen, talteenoton. Käytettäessä kahden sisäänpiston menetelmää saattavat jotkut uudelleen 15 60888 suspendoiduista patogeeneistä mikro-organismeista jäädä verinäytteen yläosaan.

Näytteen n:o 15 vertaaminen näytteeseen n:o 17 osoittaa parantuneet tulokset, jotka ovat mahdollisia käytettäessä tämän keksinnön mukaista menetelmää. Näytteellä n:o 15 samoin kuin näytteellä n:o 17 käytettiin vaakasuoraa pohjatulp-paa, sisäänpistojen lukumäärä oli kolme ja suhteellinen keskipakovoima oli suma kuin näytteessä n:o 17 (3000 x g). Käytettäessä keksinnön mukaista menetelmää uskotaan parantuneiden tulosten aiheutuvan kerroksen muodostavan nesteen käytöstä, joka ei laske patogeenejä mikro-organismeja kulkemaan lävitseen pohjalle asti ja joutuvan suljetuksi putken 20 seinämien ja pohjatulpan väliselle rajapinnalle.

Edelleen osoittaa näytteen n:o 9 vertaaminen näytteeseen n:o 11 etuja, jotka saavutetaan käyttämällä viistettyä tulppaa verrattuna vaakasuoraan pohja-tulppaan. Koska olosuhteet ja menetelmät esimerkeissä n:o 9 ja 11 ovat täsmälleen samat, paitsi että näytteessä n:o 11 käytettiin viistettyä tulppaa, voidaan parannuksen, joka todettiin esimerkin n:o 11 talteenottomäärässä verrattuna esimerkkiin n:o 9, katsoa aiheutuvan ainoastaan viistetyn pohjatulpan käytöstä, joka on sijoitettu astian 20 seinämiin nähden kulmaan, joka on kulman, jossa astiaa 20 lingottiin, komplementtikulma. Näytteen n:o 10 vertaaminen näytteeseen n:o 12 kuvaa samalla tavalla saatuja parempia tuloksia, kun käytetään viistettyä pohja-tulppaa, jolloin suhteellinen keskipakovoima oli 3000 x g.

16 6088 8 w oj C -=t a vo * u -3·α-^>— οη,-,-ρ— + 1 oj >- +J o +1 +1 +1 +1 +1 +| +| +| la +| +| H -P Λ

to P LA A Ο 0Π O LA LT\ O '— ON OO

E-tO VOAOVVOONOxVOONOOCOCTc

H I 3 *H OJ -M -o +> 3 3 fl ¢) fi M P -X -H to OX

'— G > ooooooooooo r OJO ooooooooooo

W G -X AO AO AO AO AO A

OJ ·Η to K H ft *-ro»-ro--m,-onT-m*- I I :3 g I p u :3 O H :3 :3 p :3 to tn G 0

•H -H OJ P

co ft'Hj! ajojmcMtomajojoorom 3 P, 3333333333 Q, PPi-,ft,ft,ft,ft,ft,ft,ft,3|

Η OOOOOOOOOOpH

P P P P P P P 3 P P 3 p P to eg 33333333033 ® CO CD CD CO CO CD CD CO CO CO p, '£* IS -3½ -31¾¾ O 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 'Hm d w >>>>>>>>>> >ϋ r;

M

0 a -¾

Eh 0) D Ί) ο; ς, -4-3 -P -4-^ n I Ί <ϋαί<υωα>α;ω^ω w ω GGGGGG30o αία; •H -—· ·Η *-—- ·Η ^-v «H ---- ·Η .·—n. ·Η - £ ö C £* £ cöcn<öcnaJtocöWcdwcow !§g go go go go go 3 « rt rt g P-H -P ·Γ-t -P -H p *H p -H P Ή 3 — 3 -—-3--- 3 — 3 — ® H .3 H rt M rt H rt p rtrH -Pao -P CO P CO P CO Pco Ό -H TD ·0 Ό -H Ό ·Η Ό »rl Ό ·Η Μ ρ- 3 Ρ Μ _} 3 p- 3

Q to 0 3 O m Q tn Oto O to OI OI OI OI OI

Po Po Po Po Po ΡΟ'ΰο'ΡοΌο'Ρο'Ρο too 3 0 tnO too toO cnO O h, O ft O ft Opt, Op, :3 ft, ft, ft, ft, ft, ft,3|t|;3 p p p S G3G3GGaGGGG3 0p0pBp0p0p h oaoaoaoaoaoa ft, ft, ft, ft, ft,

OJ GaGaGaGäGaGaGoGOGOGoGO

p •h3-h3-h3-h3-h3-h3 0JöOJGOJGO)COJG

OJ :3 to :3 to :3 to :3 to :3 to :3 W 3-,-1 CO -H 3 -h 3 -H to -h rt Θ B S Ö 0 0 J.Sftl^ftiMftHjilfti^ift, 3 flJ^S.4J*iftOJ'6%OJ%*<l)*%a>**OoOoOoOoOo 5 P P P P p p ft-t^ftfcJGofti^ft,^

30 30 30 30 30 30 G H G H G H G H G H

OJA 3 A 3 A 3 VO 3ftO 3VO 3t, II ft 3 ft 1) ft 3[t, a —^ a a ^ a ^ a— a— a -S- a —- a --- a -S a -- 3

»H

•H -H A! a B o 33 -HSrrES = = = re 3 . -H ft, W) O G 3

O ft, 3 a -H

PM 60 OH

3 -3 ft, 3 0

ft BO WO

3

-P

6 ?.

ac *-c\jto^iAvoc— goono^- 1T 60888 G CM VO v

<D «— CU CO t— VO

-PO +| +| +| +| +1 +1 +| H -p ___ Ό aj -p co oo o on c\i co o\ o

Eho on on p- i/\ σ\ σ\ on *—

H I

Φ 3 -O--ρω® h o S

2 ΛΙΉ Ö0 tn O

β > X O oooooo o <1)0 o oooooo o h ö « O LO Ο O UH O LTN o O -H ro (¾ H P« ro r-rorO'-ΓΟ'- en I I :® C I 2 U :® OH®

:® -P :® tn en ö S

•rH »H (lj P

o ft-o 3 tn oi oj on m on on on cd o. ® ® ® ® ® ft PlPPPPPOIdl

^ H -prdOOOOO-PTt-PO

® s -p p or z 2 2 2 2 +? b £ b o-p o®®tn tn tn tn tn o ® ® o ® d p d -phOft® ® ® ® ® H->tjOft-pbOft -P -«-s tn H ft 24 3 3 -M 3 tn H ft tn H ft

<d22 ·η >> H d d d d d •hSH-hSH

r-3 o ·ημρ® d ® ® ® ·Η M P -rt CO P

Ph > — -P > > > > > > ^' P > ^ -P

H

O

cd EH O (1) 0) ®

-p -p -p -P

tn o Φ Φ Φ tn tn <n <u e ö ö ö ® ® e ·η ^ th —' ·η ^ ·η — a e ö ®m d tn πω dtn ® tnQtnowoMO® ® ® ®-—' +> +» H -p ·Η -p ·Η ä —' ® ®-~- pao ®r_idHdH®HP0OP°O P co t»4 tlfl ®·Η tiH tJH tn p- tn -=J- tn 4

oi omotnocnotnoioi OI

HO POpSOPOdOHoHO HO

O fe tnotnotnoroOOftOPH O Ph p b n b b 2 2 2

Sp ödö®ö®o®Spä-P S -p

P Φ3Φ3Φ3Φ3 p P P

:® e® c3ö3ö3c3ö®ö® es ® S Φ Ö ·Η ® ·Η ω -H ® -H d φ β Φ Ö Φ Π H ω «h sd m :® tn td m td m m -h « -h tn -h 0) 3 P 0 0 0 0 3P3b3b p O O ® 0¾¾ 0)¾¾. 0¾¾ o o o o o o Φ ^ 2 ρρρρΡβΡΡΡΡ β PH tnotnotnotnoPH^H ph

® 9i(p ΦΙΛ<®1/ΝΦΙ/ΝΦΝΟΦ[χ-®Ρη ® C-H

s 3— a^ a ^ a'-- a ^ w ^ 3 -- ® •r-t •H -H 3 d 0 o _ m Φ ® -H d ö Φ I -h p d o

tö O Ö Φ HO

OP® 3 ·Η Π ·Η 4 2!« OH d 23

d ·η P tn o d H

Ph o O W o od=srs = = <v o :cd · · oj on _=t m no t— °o on 18 6 0 8 8 8 G yo (0¾¾ «- τ

α) I

f. o +1 +1 ^ P T- σ\ HO σ\ Oi

H I

(U ·Η «o ja p 3 3 a a) a

3 M -H

co O

'-T G > bO O O

0) O O O

Ph G X LC\ O

0 ·Η 3 K H ft >- ro

I I :cd G I 3 G (3 O rH :3 tcö p :3 3 3GB •H *H 0) P

CO Ph -ra ,!sj on on l i) 01 I -S I -ä _ ET -< 3 3 -33 -n ft Ggtn 3 g 3 3 rH Oli, P S !>> 0 3 P § .p ^ +3 3 p "— P* ·Ρ O >> o) ui O h di ui P“» -P ft.H ft -P ft-H ft «* ? M H > Ph 03 i—I t> Ph

-S ·Η >>-H rH *H >5-H H

^ O -H K·H p ·Η PJ -H 3 (_jP< > p p > r_ p p o 3

I—I

G

3

H

3 0)

P P

co CO

0) 0)

G G

3 3 > > 3 ^ 3 r-"

P CO P OO

33: M -3-

O I OI

nG o 'd o Q ft 2^

3^ G

a p a p :3 G 3 G 3

a 3 ö 3 G

H co G m -h

3 X Γ fti G

P 05 OO

3 G g G G

G G ft G H

^ £ £ $ S.

•H »H

g a co

3 3 3 G

3 I ·Η G 3

bO O C -HO

O G 3 Ή -H

P .M bD G P

3 »H Eh 3 rH

fG E O O 3 S

3

Is

E3 G CM CM

Claims (8)

1. Menetelmä nestemäisen näytteen mahdollisesti sisältämien patogeenien mikro- organismien havaitsemiseksi panemalla näyte suljettuun, steriiliin linko-amisvyöhykkeeseen ja linkoamalla, jotta mainittu näyte painautuisi nestemäisen väliaineen pintaa vastaan, ja erottamalla tämän jälkeen mainittu nestemäinen väliaine ja siinä olevat patogeeniset mikro-organismit mainitusta linkoamis-vyöhykkeestä, ja analysoimalla se mainittujen patogeenisten mikro-organismien toteamiseksi, tunnettu siitä, että a) mainittu näyte, kuten veri, luuydinneste, selkäydinneste, keuhkopussi-neste tai virtsa, puristetaan linkoamalla 1500-3000 x g:ssä kerrosta muodostavaa nestettä vastaan, joka neste on myrkytön mainituille patogeenisille mikro-organismeille , hydrofobinen ja veden kanssa sekoittumaton, ja jonka tiheys on suurempi kuin mainitun näytteen tiheys, kuten inerttiä fluoroitua hiilivetyä vastaan, jonka tiheys on noin 1,2-2,0 g/cm^, kiehumapiste noin 90-210°C ja keskimääräinen molekyylipaino noin 300-850, jolloin annetaan keskipakovoiman vaikuttaa niin pitkä aika, että patogeeniset mikro-organismit ehtivät siirtyä mainittuun kerrosta muodostavaan nesteeseen asti, mutta ne eivät ehdi kulkea tämän nestekerroksen läpi, jotta pääosa läsnäolevista patogeenisistä mikro-organismeista väkevöityy kerrosta muodostavaan nesteeseen ja tämän ja nestemäisen näytteen rajapintaan, b) linkoamisen jälkeen poistetaan nestemäisen näytteen pääosa koskematta sen alinta osaa, joka lepää kerrosta muodostavan nesteen päällä, jotta ei poisteta rajapinnassa tai lähellä sitä olevia patogeenisiä mikro-organismeja, ja c) analysoidaan jäljellä oleva, kerrosta muodostavan nesteen ja nestemäisen näytteen alimman osan sekä patogeeniset mikro-organismit käsittävä aine-seos -

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittua kerrosta muodostavaa nestettä on läsnä 3,3-30,0 tilavuus-%.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainenmenetelmä, tunne ttu siitä, että kerrosta muodostava neste on inertti, perfluoroitu hiilivety, jonka tiheys on noin 1,7-2,0 g/cm , kiehumapiste noin 125-200 C ja keskimääräinen molekyyli-paino noin 350-600.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käyttökelpoinen laite, tunnettu siitä, että se käsittää suljetun sentrifugiastian (20), joka on itsetiivistyvästi suljettu sulkuelimillä (24 ja 26), jolloin astian sisäosa käsittää tyhjän tilan (32), jota pidetään ilmakehän painetta alemmassa paineessa, 2° 60 8 8 8 tämän pohjalla olevan suuren tiheyden omaavan, ei-myrkyllisen, veden kanssa sekoittumattoman, hydrofobisen kerroksen muodostavan nesteen (28), kuten inertti fluoroitu hiilivety, jonka tiehys on noin 1,2-2,0 g/cm3, kiehumapiste noin 90-210°C ja keskimääräinen molekyylipaino noin 300-850, joka neste pystyy kokoamaan pääasiallisesti kaikki nestemäisestä näytteestä poistuvat patogeenit mikro -organismit, ilman että hukataan patogeenejä mikro-organismeja sentrifugi-putken välitiloihin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen laite, tunnettu siitä, että kerroksen muodostavaa nestettä (28) on läsnä noin 3,3-30,0 tilavuus-%, edullisesti 4,7-28,6 tilavuus-%.

6. Patenttivaatimusten 4 tai 5 mukainen laite, tunnettu siitä, että kerroksen muodostava neste on inertti, nestemäinen fluorattu hiilivety, jonka tiheys on noin 1,7-2,0 g/cm , kiehumapiste noin 125-200 C ja keskimääräinen molekyylipaino noin 350-600.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 4-6 mukainen laite, tunnettu siitä, että se käsittää: a) suljetun sentrifugiastian (20) , jossa on alapää ja yläpää, jotka ovat itsetiivistyvästi suljetut sulkuelimillä (24 ja26), joiden läpi voidaan pistää injektioneula, b) alapäässä olevan sulkuelimen (26), jonka yläpinta muodostaa vinon kulman sentrifugiputken (22) suhteen, joka kulma on lingottavan sentrifugiastian komplementtikulma, c) tehokkaan määrän suuren tiheyden omaavaa, ei-myrkyllistä, veden kanssa sekoitturaatonta, hydrofobisen kerroksen muodostavaa nestettä (28), joka on sentrifugiastian (20) pohjalla, ja d) tehokkaan määrän ei-myrkyllistä hajotusainetta (30), joka on sentri-fugiastiassa (20).

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen laite, tunnettu aiitä, että sulkuelimen (26) yläpinnan kulma sentrifugiputkeen nähden on noin 30°-80°, edullisesti 34°. 60888