JPS61155955A - 血液試料からリンパ球および単球を分離する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 分離すべき二相の比重の中間比重を有すチクソトロピッ
クゲル状物質を用いて血液試料中の軽質相と重質相を分
離する方法が、米国特許第３，８５２．１９４号に概説
されている。ゲル状物質と血液試料を一緒に遠心分離器
にかけることにより、ゲル状物質は流動し、分離すべき
相間に膜を形成する。

この膜により、通常の実験技術を用いて上相を除去する
ことができる。

該特許には多神のゲル状物質の使用が示唆されている。

即ち、これに必要な性質として以下の三基準が掲げられ
ている。

（イ）分離する二相の比重の中間比重 （ロ）分離する二相に対し化学的不活性、および（ハ）
静置状態で本質的に流動しない（半硬直）米国特許第３
，９２０，５４９には該特許第３，８５２．１９４の方
法の改良が開示されており、ゲル状物質の比重より大き
い比重を有す固体成分の使用による改良である。「エネ
ルギザ−（ｅｎｅｒＱｉＺｅｒ　）　Ｊと称される固体
成分は通常血液収集管の底に置かれ、遠心分離の間ゲル
状物質と密着しており、ゲル状物質が管壁に沿って上昇
するのを容易にする。従って、血液分画弁の分離が促進
され、かつ二相分離が清潔になる。

米国特許第４，１９０，５３５には、凝固防止血液から
のリンパ球、単球および血小板抽出方法が教示されてい
る。これは下記の基本的三段階方法である。

（１）血液成分と化学的に不活性であり、比重が１．０
６〜１，０７７ｆｆ／ｃｃ間にある水不溶性、チクソト
ロビックゲル状物質を凝固防止血液試料に入れ、 （２）重い赤血球と血漿、血小板、リンパ球および単球
との間に膜を形成するに充分な時間、ゲル状物質−血液
試料を１２００Ｇ以上の力で遠心分離した後、 （３）血漿、血小板、リンパ球および単球を膜上力より
採取する。

特許方法にはその時広く利用されている分離技術の改良
も包含されている。凝固防止ヒト血液からリンパ球およ
び単球を分離するこの方法では、スエーデン国つプサラ
のファーマシアファインケミカルズ社（Ｐ　ｈａｒｍａ
ｃｉａ　　Ｆ　ｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　　ＡＢ〉
が市販している比重１．０７７９／ｃｃのニュート＞Ｒ
体「フイコールーペイク（Ｆ　１ｃｏｌｌ　−Ｐａｑｕ
ｅ（登録商標）」を用い、約４００〜５００Ｇで約３０
〜４０分開面球を浮遊力遠心分離しようとするものであ
る。しかしながら、フイコールーペイク流体を使用する
方法では下記の如き問題が生じている。

（イ）最初、血液試料をピペットでフイコールーベイク
流体上に移す間、白血球の該流体表面より下への展開が
生じ、フイコールーペイクの比重が減少しリンパ球およ
び単球の分離が不充分となり、 （ロ）遠心分離中に血液中の軽質相がフイコールーベイ
ク媒質中に移送される際、４００〜５００Ｇで生じる浮
遊力が小さいため媒質を通過して上昇することができず
、 （ハ）フイコールーベイク流体は幾分水溶性であり、か
つ遠心速度を増すと血液中への溶解度が高くなり比重低
下が生じるので、４００〜５００Ｇ以上の遠心力を用い
ることができず、 （ニ）遠心分離終了後、該流体のニュートン特性のため
にフイコールーペイク流体の上からのリンパ球および単
球の採取には充分な注意を要し、かつ （ホ）この分離技術では完結のため少なくとも一時間を
必要とするので、より省費時間の少ない方法が切望され
ている。

１２００Ｇ以上の遠心力で膜形成能を有すチクソトロビ
ック、非ニユートン、水不溶性ゲル状物質を用いること
により、該特許第４，１９０，５３５号に開示された方
法はフイコールーベイク流体を用いるよりも速く、かつ
より完全な分離ができる。

ゲル分ＩＩＩＩｌ管を用いたヒト血液試料からの単核血
球（リンパ球や単球）の分離に関する長期的研究により
、分離性能は血液試料採取時からの経過時間の函数であ
ることが示されている。従って、新鮮な採取血液では純
度８５％以上で単核血球は定量的に回収されており、血
液採取後相対的に僅か時間が経過した後は、回収血球は
未分離の全白血球数に近似している。

血液採取摸の時間経過とともに、ゲル膜上に沈積した単
核血球の顆粒球による汚染が増加することでこの現象は
実証されている。図１においで、三種類の異なる血液試
料についての分離性能に対する時間の影響が、１４００
Ｇで１０分間遠心分岨した後のゲル膜上に回収された単
核血球の百分率で示されている。図から判るように、新
鮮な採取血液試料では純粋な単核血球が得られているが
、僅か３０分経過で血球純度低下が目立ち、２時Ｉ２！
１後にはその低下が著しい。従って、性能の急激な低下
は患者にとって重要な問題である。例ば、白血球、特に
リンパ球の正確な測定は組織適合性決定に非常に大切な
ものである。免疫抑制に要す薬物治療の型と程度を決定
しなければならない場合に、リンパ球機能の表示が要求
される。

図２では高温になると浮遊力減少が加速されることが示
されている。このように、図２の曲線は同一血液の二試
料について温度を変え、同一ゲルおよび方法を用いて実
施した単核血球量測定結果を示しており、図１で通論し
たように変化している。古い血液の純単核血球を採取す
ることができないことは、躾に用いるゲル状物質とは無
関係のように思われ、顆粒球の浮遊力の明白な変化によ
るものと考えられる。

正常な血液試料から異常なものまで１２察することによ
り、与えられた血球の型の密度集団内において血球密度
が広く変化していることが判る。血漿を通しての沈降速
度において、理論的条件下に移動する血球試料のＮ度を
数学的に検討すると、そのＷ５度集団上で各血球型のガ
ラス分布を示す。

そのガラス分布は尾引き赤血球に重なった顆粒球、尾引
ぎ顆粒球に重なったリンパ球および尾引きリンパ球に重
なった単球によるものである。

血球密度の重なりの増加が予期されるいくつかの方法が
ある。試験管での加令が血球型の重なりを生じさせる一
方法である。典型的な血球密度は多くの単一体の平均値
であり、正規分布の両端において試料は相当な重なりを
示すことが考えられる。病理学上の試料では血球集団の
重なりが変化することが考えられるが、事実その全集団
が位置を変えている。これらの条件が分離性能の変化に
著しく影響することが考えられる。

血球の密度と量の変化に寄与する機構を広く検討した。

細胞膜を通っての移送に関する三つの基本的考え方を見
い出した。即ち、拡教、促進移送および能動移送である
。種々の薬品により活性化されたり、妨害されたりする
６秤の独立した通路があり、この移送は複雑である。Ｎ
ａ”Ｋ＋水ポンプかかる移送システムの一つである。

血球環境の侵透圧の変化は　血球内外へのイオンの移送
に通じ、その結果水容全の変化が起こる。

この水容量の変化は先ず血球サイズと密度の変化に影響
する。血球体積＃１制に関し、［バイオシミ力　エト　
バイオフイジカ　アクタ（Ｂ　ｉｏｃｈｉｍｉｃａ　Ｅ
ｔ　３ｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　）　Ｊ　、　　
７７４　（１９８４）　。

１５９〜１６８ページ、エルス゛ビニ−サイエンスバブ
リッシャーズ社（Ｅ　ｌ５ｅｖｉｅｒ　Ｓ　ｃｉｅｎｃ
ｅ　　Ｐｕｂｆｉｓｈｅｒｓ　Ｂｖ　、　）に詳述され
ている。アイアール工／Ｌ／フＬ／ス（Ｉ　ＲＬ　　ｐ
ｒｅｓｓ）発行の第７章「ヨウ素化密度勾配媒質Ｊ　　
（Ｏｒ　、　Ｄ、　Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編集）には、密度
勾配液体血球分離技術と方法についての詳述がある。理
論的には、浸透圧が１０％増加すると血球密度が０．４
％増加し、血球半径が２．２％減少することが、その文
献には示されている［）　ｒ　、　Ｒｉｃｋｗｏｏｄに
よると、ナイコデンズ（ＮＶＣｏｄｅｎｚ　：登録商標
）とＮａ　ＣＲ，を用いて分離媒質密度と浸透圧とを独
立して調整できる。ナイコデンズはニューヨーク市つエ
ストバリイのアキュレイト　ケミカル　アンド　サイエ
ンティフィックコーポレーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が市販している密度勾配媒質の登
録商標であり、その分子量はａ２１で密度２．１３／ｓ
Ｊ！である。化合物乞はＮ、Ｎ’　−ビス（２，３−ジ
ヒドロキシプロピル）　−５−［Ｎ−（２，３−ジヒド
ロキシプロピル）アセトアミド］−２．４．６−トリヨ
ウ素−イソフタルアミドである。リンパ球から単球の分
離にこの媒質を用いること、および侵透圧の増加に伴な
い、単球の純度が変化することが記載されている。沈降
勾配が使用されている。

液状勾配媒質を用いる血球分離において、三つの型の勾
配が使用されている。その第一のものが沈降勾配である
。沈降速度の変化のため所定時間内に分離すべき一群の
血球は管底に集まり、残りは表層液体中に存在する。第
二、第三の型のものは浮遊密度勾配である。このうちの
一つは不連続勾配で、試料はその上に置かれる。沈降後
、一群の血球は勾配液体の上方に集まり、他の群はその
下方に集まる。他の一つは連続勾配と称されるもので、
この媒質では遠心分離により媒質中の巨大分子は底の方
へ動くことになり、連続密度勾配を形成する。この媒質
中の血球はその密度により勾配中に位置する。従って、
上述の密度集団の重なりが生じることが判る。

リンパ球は人の免疫システムで重要な役割を果している
。リンパ球は採取され、化学、生理学にお（プる免疫機
構の究明研究で重要な役割を果すものとして使用されて
いる。例ば、ガンや自己免疫症の研究で重要な役割を演
じ、モノクロナール抗体技術の基本的なものとなってい
る。多くの場合、顆粒球や赤血球によってリンパ球が汚
染されると、化学的架橋反応性のためにその試料は使用
できなくなる。このため、リンパ球分離方法では定常的
に９０％以上のｌ１ＩｉＩｆで製造できなければならな
い。

ゲル分１１を機構は通常の浮遊密度分離とは基本的に異
なるものである。前者では、密充填時の密度が１．０９
／ｃｃに近い赤血球の集団で管底のゲルが遠心力により
置換される。−団の充填血球に成長した時、約１．０６
５〜１，０７７ｇ／ｃｃの密度を有すゲルは浮遊力で管
を上昇する。血球懸濁液がゲルの密度に近似する位置で
そのゲルは静止する。この位置は、赤血球、白血球およ
び血漿の混合物の密度がゲルの密度に等しいか、実質的
に同じであるところである。この平衡位置において、伸
長したゲ塊は赤血球集団の浮遊力により固定される。ゲ
ル塊上方の血球懸濁液はゲル塊の密度より小さい。

従って、遠心分離により自重でゲルは圧縮されることに
なる。この圧縮力でゲルは管の中心方向へ押され、その
塊りは水時計配列のようになると考えられる。ゲル塊は
収縮したり密閉したりする速度やその程度は血球勾配速
度に支配される。

ゲル密閉が起る時、血球流はしばしばゲル塊に捕捉され
ている希薄な血球流で希釈され、その結果、本質的に大
理石状となる。ゲル下方に血球が密充填される際、ゲル
下方に捕捉されている血漿は泡を形成し、その泡が充分
大きければゲルを通って上部へ移動し、ゲル表面上で、
いわゆる「熱溶岩模様」を形成する。ついでゲルは血漿
が残した空間を埋めて沈着する。

ゲル密閉が起る条件は数学的に推定可能である。

例え１ヨ゛、血球勾配の浮遊力がゲルを圧縮する浮遊力
以下になる条件である。平衡状態ではこれらの浮遊力は
等しい。もし、このシステムが勾配以上で作用すること
も無視すると、この概念を簡略化できる。従って、生産
物密度の総計と相の客間パーセントは相等しいとするこ
とができる。赤血球の公称密度は約１．１０ｇ／ＣＣＮ
白血球の密度は約１．０７５．血漿の密度は約１．０２
７およびゲルの密度は約１．０６５である。上記数値を
用いて二つの境界条件を規定することができる。一方の
境界条件は全て白血球の場合であり、他方の境界条件は
全て赤血球の場合である。故に、血漿と白血球だけの場
合： １．０７５（Ｘ　）　＋　１．０２７（１−ｘ　）　−
１，０６５（１）ここで×−白血球の％ ｘ　−（１，０６５−１，０２７＞　−４−（１，０７
５−１，０２７）　−〜０．７９−〜１９％ 血漿と赤血球だけの場合： １．１０　　（ｘ　）　＋　１，０２７（１−ｘ　）　
＝　１．０６５（１）ここでＸ−赤血球の％ ｘ　−（１，０６５−１，０２７）÷（１，１０−１，
０２７）　−〜０．５２−５２％ 従って、密度的１．０６５ｇ／ｃｃのゲルを使用すると
、懸濁液の血球混合状態により、血漿中に５０〜８０％
の血球が充填した血球懸濁液流上にゲルが密着すること
になる。ゲル密度が変化すると境界条件が変化すること
が明らかである。粘調液体中において重力で動く球状粒
子の末端速度もまた数学的に式で近似することができる
。しかしながら、単一粒子群の場合のみ、この式は有効
である。その速度は粒子と媒質の密度差、粒子径の二乗
に比例し、媒質粘度に反比例する。それにもかかわらず
、この式を各型の血球に適用すると、実際の相分離の結
果と幾分反対の結論が予測される。このように、実際の
分離方法では赤血球が最初のように思われる。血球懸濁
液が非常に密なため、塊つと等しい半径の塊りの中で動
く多くの赤血球と共に、血球塊の流れが発生することを
観察することでこの現象は説明される。赤血球が最初か
つ最債のように思われる。即ら、集団化や塊り効果のた
めに最初になり、分離中に血球懸濁液が希薄になると最
小血球が最後になるように、上記式に従って個々の血球
は移動するので最後となるのである。従って、血球懸濁
液勾配の先端はその末端より異なる影響下で移動する。

結果的には、実質的に赤血球汚染が避けられない。

懸濁血球が充填面球塊に近づくと、小血球より本来的に
急激に動く大血球の動きは、血球懸濁液の密度が増加す
るので遅くなる。赤血球濃度的６０％で懸濁液密度はリ
ンパ球密度に近くなる。その流れは充分帯でゲルを開放
状態に保つ。従って、ゲル上方に位置したままかつゲル
密閉前に、その密度によって、白血球の動きが遅くなる
か、または逆方向になることが判る。分離のこの段階に
おいて下方に移動している多数の赤血球は白血球上部に
沈積することが考えられ、この作用に反する傾向になる
。白血球が順次赤血球を保持するので、少なくとも部分
的にはこの動きで赤血球汚染を説明することもできる。

個々の相の密度によって血球が層を形成し始めるのが、
このことである。従って、濃縮血球懸濁液はそれ自身が
密度分離勾配として作用するのである。ゲルが密閉する
のは平衡に到達する前であるが、実質的に密度分離が起
る前ではない。ゲル密度が増加すると、管下方にそれは
位置し、増加圧縮力のためにすぐゲル密閉が起る。ゲル
密度増加により血球収率が高くなることから、この作用
は証明される。例示すると、ゲル密度がｔ、０５５　ｇ
／　ｃｃでは収率は１５〜２０％と低いが、１．０８ｆ
ｆ／ｃｃでは１０〜８０％となる。分離したリンパ球は
逆の作用をするので、高純度の相分離を必要とする場合
、この利点が失われる。故に二つの因子間で最適値を選
択する必要がある。上記議論から、殆どの試料で９０％
以上の純度を得ようとしてゲルの物理的性質だけを変え
ても満足すべきものが得られないことは明白である。ゲ
ルが一端密閉されると、個々の血球密度は充分ではなく
、ゲルを置換することができない。従って、血球が血漿
（密度〜１．０２７ｇ／　ｃｃ　）から出てゲル（密度
〜１．０６５）に入るとき、相対的な血球密度は無視で
きる。血漿粘度の１０万倍であるゲルの粘度は更に血球
速度を遅くする。故に、２〜３分間で血漿中を２インチ
移動する血球はゲル中で血球半径の深さだけ沈むのに数
日を要する。！！Ａ言すればゲルはドアの役割を果し、
採取のためにゲル上に血球を乗せていることになる。か
かる血球はリンパ球に富んだ赤血球と白゛血球の混合物
である。

通常の液体合皮分離媒質と異なり、ゲル媒質は浮遊力密
度分離において個々の血球上で作用しない。しかし、代
わりにゲル媒質は懸濁液中で変化する血球勾配の平均浮
遊力密度に基づき管の中で一位置を占め、本質的に沈降
勾配上で閉じるドアとして作用する。血球径の相対速廓
および血球自身の浮遊力密度効果のため、ゲル上に沈積
する血球はリンパ球に富んでいる。赤血球汚染は溶解（
１ｙｓｉｎｌＪ）により除去できる。ゲル分離活性を補
うため精製には化学試薬の添加が必要である。

個々の血球は浮遊力密度平衡に到達しないので、上述の
速度式では速度の二乗が変数でありゲル媒質分離に血球
径は著しく影響する。。しかし、血球塊および濃縮血球
懸濁液は動くので、速度効果が浮遊力密度効果で置換さ
れる時を判断するのは困難である。更に、下陣中の赤血
球流に対抗して白血球が上昇するのを防止する赤血球捕
捉効果の評価も易しくない。加令により血球、特に顆粒
球の直径が大ぎくなること、および血球の大きさを強制
的に小さくすると加令血液試料の分離が著しぐ改良され
ることが知られている。従って、血球が大きくなると密
度は小さくなるが、加令効果で密度変化の５倍以上直径
が変化する。例ば、直径が２．２％変化すると血球沈降
速度は５％変化する。

典型的な血球の直径を見てみると、顆粒球の範囲はリン
パ球の範囲に入り、単球は顆粒球の最も広い範囲と重な
る。赤血球の直径は最小のリンパ球の直径にほぼ等しい
。従って、各血球の直径範囲はかなり重なりが生じるこ
とになる。結果的には、応分に実質的分離が起るという
事実でもって、血球の直径は殆ど同じであるので、重な
りができるだけ少ないところでは血球密度がゲル分離に
おいて非常に重要な働きをしていることが示される。

故に、分離の後半においては速度が沈降状態を調節し、
かつ分離の主要機構の因子である。血球濃度勾配が高く
、かつゲル密閉位置の上方にある場合、密度の方が分離
機構の支配因子である。血球懸濁液が主として赤血球で
形成されている場合には、それ自身が分離勾配媒質にな
る。血球径および密度を変えるため化学試薬を使いて血
漿の浸透圧を変化させることは可能である。従って、−
血球径の血球はその血球径の集団中心に向って移動し、
それにより密度範囲は減少する。その動きは血球集団の
重なりの程度を少なくする効果がある。

例ば、リンパ球沈降伏態を先導する大きいリンパ球はそ
の集団中心に向って引戻される。過度の浸透圧化学処理
剤は小密度血球には効果が少ないので、小さな末端顆粒
球はそれほど影響されない。

しかしながら、同時に、大きな顆粒球は修飾され顆粒球
集団の中心に向って移動する。その他に、浮遊力密度効
果は大きな顆粒球を赤面球塊から出て上方向へ移動させ
ようとする場合に、この後者の作用は分離方法の結果に
重要である。＠度／大きさ調節剤の使用により分離過程
でリンパ球は、保持され、顆粒球は管の下方に動くよう
助長されることが、全体の結論である。血球膜にはより
大きな分離距離が付与されるので、ゲルはリンパ球集団
中に顆粒球をより少なく捕捉して密閉することができ、
純度改良につながる。上記化学処理は困難な試料の分離
を改良と同様に、試料加令による不利益を無くすことが
できる。同様に、軽度の浸透圧処理も血球拡大に使用す
ることができる。しかしながら、この方法は、血球の容
積調節能によりその効果が短かい。更に、この処理によ
り血球破壊も起す。

発明の目的 本発明の第一目的は（１）ゲル修飾および（２）分離に
先立ち血液試料を処理する薬品使用によりゲル分離方法
の性能をを最適化することにある。

薬品処理は液体分離技術で使用できるので、米国特許第
４，１９０，５３５号にその好ましい態様が記載されて
いる。

発明の総括 米国特許第４，１９０，５３５号記載のゲル密度が１．
０６５〜１．０７７の範囲であることは驚くべきことで
ない。各種の血球密度と共に新鮮な採取血液およびＥＤ
ＴＡ抗凝血剤を用いると、かなり良い結果が得られる。

基本的に競合する液体方法で密度１，０７７を使い（こ
の密度は顆粒球とリンパ球集団の間の密度［窓（Ｗｉｎ
ｄｏｗ　）　Ｊに近似する）、かつゲル使用で浮遊力密
度に基づく個々のリンパ球分離可能性を予測できるとす
ると、この密度範囲は当然前Ｉｉ！されるべきものであ
る。事実、血漿中の赤血球および白血球からなるより低
い血球密度に基づきゲルは早目に密閉する傾向がある。

二つの型のゲルを用いて実験で最適性能のゲル密度は１
．０６０〜１．０６５の範囲である。リンパ球の最適分
離のためのこの密度範囲は当業考にとって予期できない
ものである。事実、分Ｉ１１を機構の本質は未だ明白で
ない。ゲル密度が１．０５５と低いところで許容可能な
純度のものが得られる。１　、０６０〜１．０６５範囲
の密度を選択することで、密閉領域を顆粒球が通過した
後ゲル密閉が起こることになる。この密度範囲以上のゲ
ルは単核球収率を向上させる傾向にあるが、純度が低く
なる。典型的に、１　、０６０〜１．０６５ｔ！囲のゲ
ルは液体密度勾配Ｉｓ質より好収率を与え、僅かに低い
密度では収率を多少犠牲にしても純度が改良されので、
これも許容できる。リンパ球収率５０％以下ではある準
集団の選択的分離に通じ、準集団中での変移は誤った診
断および／または研究結果の恐れがあることを、研究者
は心配している。従って、血球試料調製に対しゲル密度
の影響を無視できる最小１ｎがある。

本発明の第二の点は血球中の水を浸出ざ才ることにより
血球密度を増加させ、大きさを小さくするように、全血
球試料を薬品で処理することからなる。各血球密度集団
の軽量血球はかかる処理で最も影響を受けるのｃ１沈降
伏態の前方部では速度減少が起り、各血球膜の密度集団
の中心方向に移動する。また、分離過程の復段階で浮遊
力密度が赤血球ｌＩａｍに影響を与えると大きさが小さ
くなりかつｌ！Ｉｆが増加した大きな顆粒球はリンパ球
集団から離れ管下方向に移動するので、顆粒球とリンパ
球集団の重なりが減少する。この血球集団の希釈時にゲ
ルが密閉するので、リンパ球が多（、顆粒球の少ないも
のが捕集される。最後に、血液試料の分離、特にゲル分
離技術を増々困難にする血液加令がこの処理により防ぐ
ことができる。血球膜を通る分子移動を調節するのにい
くつかの機構があるので、密度／容積の調節には数種の
興なる薬品が使用できる。従って、最も簡易な方法では
、懸濁液に高張塩化ナトリウム水溶液のような多浸透薬
品を添加すると浸透圧が変わり、血球から水が浸出する
。かかる現象が起る移送現象はまだ充分解明されていな
い。ここでは、血球は活性化したり密度できる容積規制
能を有すと言うだけで、この目的には充分である。Ｎａ
　”　Ｋ＋水ポンプかかる機構の一つである。何如なる
場合にも、実際に浸透圧を変える化学物質および／また
は浸透圧が変化したと血液に考えさせるようなトリック
を用いることができる。更に、容積変化を阻止すめ化学
物質は、それ自身が血液加令効果を妨げるのに推薦でき
る。これらの薬品の組合せは補助的に作用することがで
きる。密度勾配媒質と比較して塩の費用は無視できる。

従って、ナイコデンツのような化学物質媒質との組合せ
でＮａ　ＣＲ，を使用すると全体の費用を低減できる。

ナイコデンツ密度勾配媒質に加えて、勾配密度物質とし
て有用な親油基を有す下記のヨウ素化有機化合物を見出
した。分子量６２８のメトリゾイック酸［３−アセトア
ミド−５−（Ｎ−メチルアセトアミド）−２，４，６−
トリーヨウ素安息香酸］で、要望特性を示す一群の化合
物の基本となるものである。特に有用な二種のメトリゾ
イック酸誘導体はそのナトリウム塩、すなわらメトリゾ
イック酸ナトリウムおよびメトリズアミド、すなわち２
−（３−アセトアミド−５−Ｎ−メチルアセトアミド−
２，４，６−１−リョウ素ベンズアミド）−２−デオキ
シ−Ｄ−グルコースである分子量約７８９の複合化合物
である。これら二種はアキュレイト　ケミカル　アンド
　サイエンティフィックコーポレーションが市販してい
る。上記有機分子の等偏性溶液は顆粒球密度回復に有効
である。

しかしながら、これら化合物の高張性液はもつと急激に
作用することが見出された。従って、本質的に速さのみ
が要求される時には、これら分子の高張性溶液を使用で
きるが、分離費用は高（なる。

本発明の方法は、顆粒球の浮遊密度の明白な変化を防ぎ
、ゲル分離媒質を使用して凝固防止ヒト血液試料からの
リンパ球と単球の純度または質を保持することも目的と
している。分離管に用いるゲルとしては、単球血球分離
に予測できる密度範囲より充分以下で、かつ米国特許第
４，１９０，５３５の密度範囲外の密度のゲルを選択す
るのが望ましい。

この予測できない条件はこれまで理解されてなかったゲ
ル位置および密閉の新規な方法によるものである。血球
純度および血球収率が均衡する好ましいゲル密度範囲は
１，０６０〜１．０６５９／ｃｃである。

この着想によるゲル管はかなりの性能を示すが、常に高
ＩＩＩ！度のものが得られるとは限らない。ＥＤＴＡは
他の抗凝血剤に比してｔｌｉ！！度を改良する効果があ
る。ヘパリンは多（の場合に好ましい抗凝血剤であるが
純度が許容値以下になることが多い。

第二の進歩性が試料の薬品処理のところで必要となる。

広く云えば、本発明の培養過程では血液試料と本質的に
血球と化学的に相溶である低分子量イオン性・物質を含
む高張性液と接触させること、６よび／又は本質的に血
球と化学的に相溶であって、顆粒球の浮遊密度をほぼ本
来の値に戻すに十分な時間、たとえば一般的には１分間
以上で典型的には少なくとも１０分間、その構造中に親
油基を有す高分子量有機分子を含む等偏性液体または高
張性液体と接触させることを企図している。これらの液
の少なくとも一つを加えることで、図１および２で示し
た浮遊密度の変化を防止できる。次に、顆粒球からリン
パ球と単球とを通常の方法で分離するには勾配分離媒質
、特に好ましくは前述の米国特許４，１９０，５３５に
記載されているような水不溶性、チクソトロピツクゲル
状物質を用いることでできる。

密閉調節は困難であるので、分離過程中に望ましい浮遊
密度にするため低分子量のイオン性物質を含む高張性液
体および／または高分子量有機分子の等張液体または高
張性液体を必要量分離媒質に添加することができる。

従って、好ましくは上記培養または予備処理段階を使用
し、分離方法は下記４要素からなる。

（イ）新鮮なまたは加令した凝固防止血液試料を低分子
量の有機および／または無機イオン性物質を含む高張性
液体および／または親油基を有す分子を持つ高分子量物
質を含む等偏性液体または高張性液体と混合し、血液と
液体の接触時間を１分間以上保持し、 （ロ）該血液試料および該液体の成分と化学的に不活性
な水不溶性、チクソトロピックゲル状物質を凝固防止血
液−液体混合物に加え、（ハ）リンパ球および単球とよ
り重い血球との間に膜を形成するのに充分ゲル状物質が
流れるように、ある力で十分な時間（典型的には少なく
とも約１０分間）血液−液体−ゲル混合物を遠心分離し
、ついで （ニ）リンパ球と単球を膜上方により採取する。

最も好ましくは、密度分離媒質として用いるチクソトロ
ピックゲル状物質は米国特許第３，８５２，１９４号お
よび第４．１９０，５３５号に示されたような組成と約
１，０５５〜１．０７ｇ／ａｎ３の間の比重を有し、遠
心分離は少なくとも１，２００Ｇの力で行う。また、米
国特許第４，１９０，５３５号で説明したように、血小
板を含む血液の血漿画分もまた股上方に沈積浮遊するの
も望ましい。血小板を含む血漿画分からのリンパ球と単
球の分離については米国特許第４，１９０．５３５号に
記載されており、同じ方法をここで用いることができる
。従って、先行技術に記載されているより重い血球から
リンパ球と卓球を分離する一般的方法と同様に、血小板
を含む血液の血漿画分からリンパ球と探求を分離するこ
とについては本発明の主題ではない。

参考文献 イクスペリメンタル　セル　リサーチ（Ｅ　ｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ａｒｃｈ）　３．　２
４５〜２５１　（１９７８）の「アイソペイク（Ｉ　５
ｏｐａｑｕｅ　）による血球密度の変化」の中でティ、
エイ、ダヴリュ、スプリンタ−（Ｔ、　Ａ、　Ｗ、　５
ｐｌｉｎｔｅｒ　）　、エム、ヘンデカ−（Ｍ　、　Ｂ
　ｅｎｄｅｋｅｒ　）およびエイ、ヴ１ンビーク（Ａ、
　ｙｅｎ　３ｅｅｋ　）は、分離相としてのフイコール
ーアイソベイク（１：　１ｃｏｌｌ　−１５ｏｐａｑｕ
ｅ　）法により予め血液試料からの分離した単核白血球
を培Ｉ！基中３７℃で培養したところ、この白血球の比
重が減少したことをＩＩ察している。培養を０℃で行う
か、培養基にフイコールーアイソベイクを添加すること
で血球密度の減少が妨げることを著酉は発見している。

培養基中３７℃での培養で減少した単核血球密度がフィ
コールーアイソペイクと接触させることで回復すること
も発見された。更に研究を行ない、アイソベイクは血球
密度を元の比重に戻す機能を有す薬品であることが判明
し、このことから著者は密度勾配の成分としてアイソペ
イクのような小さな分子量物質を使用すると単核白血球
の比重を元に変えることが出来る、という結論に到達し
た。

しかしながら、著者は未分離血液の一般的加令現象を開
示していないし、顆粒球についての効果も何ら記載して
いない。血液試料から予め分離したリンパ球の浮遊密度
変化についての彼らの観察では、顆粒白血球の作用に関
しては予測できるものではない。

上記文献のディ、リックウッド博士（Ｄｒ　、Ｄ。

Ｒｉｃｗｏｏｄ）は、各種ヨウ化物が密度を重くする効
果があること、およびその変化によりリンパ球からの単
球分離効果を促進すること、を指摘した。

好ましい実施例の説明 通常の静脈切開術を用いて、５人の供血者からの全ヒト
血液試料を、エイ・エイ・ルブラ−（Ａ。

Ａ、　１ｕｄｅｒｅｒ）　、エイ・アール・サイン（Ａ
、、Ｒ。

１ｉｎｅ）、ディ・エム・ヘス（Ｄ、　Ｍ、　Ｈｅ５ｓ
　）、セイ・エヌ・ヘンヤン（Ｊ、　Ｎ、　＋ｅｎｙａ
’ｎ　＞およびジー・オドストルケル（Ｇ、　０ｄｓｔ
ｒｃｈｅｌ）　、分子免疫学（Ｍｏｌｅａｉｌａｒ　Ｉ
ｎ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ　）　、１６．　６２１〜６２４
　（１９７９）の「密閉系における迅速かつ定量的ヒト
リンパ球分離と′Ｍ製」に記載された密閉系リンパ球分
離管に採取した。この著者が説明しているように、ジメ
チルポリシロキサンおよび沈降メチル化シリカ（メチル
化により疎水性付与）で血液成分に化学的不活性である
水不溶性、チクソトロビツクゲルを調製したく米国特許
第４，１９０，５３５号）。抗凝血剤として作用するり
チウムヘパリンを十分含有する殺菌したシリコンガラス
試験管の底にゲルを入れることで、分離管を無菌的に作
リ、ついでゲル塊の中心に殺菌ポリエステルエネルギザ
ー（米国特許第３，９２０，５４９）を入れた。他の公
知の抗凝血剤、例えばＥＤＴＡｌも同様に用いることが
できる。ついで、分離管を真空排気した。何故なら、プ
ラスチックエネルギザーの比重がゲルより大きく、遠心
力でエネルギザーがゲルを通過し、ゲルが試験管壁を上
昇するからである。

これは満足すべき管性能を保ちつつ、分離とゲル密閉形
成を助長する。

密閉系分離器を用いることにより、血液試料取扱時の問
題を少なくする。しかしながら、米国特許第４，１９０
，５３５記載の如き開放管も用いることができる。例把
ぼ一米国特許第４，１０１，４２２号および第４．３１
０，４３０号記載の如き血清分離管調製から修飾したゲ
ルも同じ操作性を示した。

直ちに血液試料を未冷却の′テーブルトップ遠心分離器
に装着し、ついで１４００Ｇで約１０分間遠心分離し平
衡に到達した。血小板に富む血漿、リンパ球および単球
はゲル膜塊上方に、他の重い血液成分は該膜の下方に分
画された。その後、血漿両分を深型に採取すると、リン
パ球および単球が支配的である血球がゲル股上に残存す
る。等張性塩緩衝液を静かに管に注入し、液をピペット
でかきまぜゲル股上に該血球の懸濁液とする。該血球懸
濁液を管から採取し、ついで４００Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシ
ンおよびエオシン）染色血球数を計算することにより、
股上に保持された単核血球の百分率を決定した。これら
の値を表１に示す。

他のヒト血液試料を抗凝血剤としてのリチウムヘパリン
を含む管に入れ、ついで表１に示した希釈剤で希釈した
。単なる便宜上のため、該希釈液は血液３容閤対希釈剤
１とした。表１に示した放置時間後、未加令血液試料に
ついて前記した方法で血液試料を分離し、処理した。各
ゲルの比重もまた表に示した。

表　　　　１ 試料番号　　　　希　釈　剤　　　　　放置時間１　　
　　　生理的食塩水０　　　　２４時間１　　　　　生
理的食塩水”　　　　　２４時間１　　　　　メトリツ
アミト　　　　２４時間１　　　　　メトリツアミト　
　　　２４時間２　　　　　生理的食塩水４２４時間 ２　　　　　生理的食塩本所４　　　２４時間２　　　
　　メトリツアミド？″２４時間３　　　　　生理的食
塩水に　　　　２４時間３　　　　　生理的食塩水１％
　　　　２４時間３　　　　　生理的食塩水″２４時間 ４　　　　　生理的食塩水”　　　　２４時間４　　　
　　生理的食塩水４２４時間 ４　　　　　メト９フフ４８２４時間 ４　　　　　メトリツアくト　　　　２４時間５　　　
　　　　　　Ｑ　　　　　　　　　　０５　　　　　生
理的食塩水４　　　１時間５　　　　　メトリツアミド
舛″　　　１時間５　　　　　生理的食塩水′　　　　
２時間＋−井 ５　　　　　メトリツアミト　　　　２時間６　　　　
　メトリツアミド６４　　２時間６　　　　　メトリツ
アミド４　　４時間１　　　　　　８３　　　　　　　
　１．０７５１　　　　　　　　　　　　Ｇ３　　　　
　　　　　　　　　　　１，０７５１　　　　　　　　
　　８３　　　　　　　　　　　　　　１．０７５１　
　　　　　　　　　　　Ｇ３　　　　　　　　　　　　
　　１．０７５１　　　　　　９４　　　　　　　　１
．０７５２　　　　　　　　　　８９　　　　　　　　
　　　　　　１．０７５２　　　　　　　　　　　Ｇ６
　　　　　　　　　　　　　　１．０７５２　　　　　
　　　　　８３　　　　　　　　　　　　　　１．０７
５２　　　　　　　！１１０　　　　　　　　１．０７
５３　　　　　　　　　　９２　　　　　　　　　　　
　　　１．０６０３　　　　　　７３　　　　　　　　
１．０６０３　　　　　　　　　　　ｇ６　　　　　　
　　　　　　　　１．０６０３　　　　　　　　　　　
９１　　　　　　　　　　　　　　　１．０６０４　　
　　　　　　　　９９　　　　　　　　　　　　　　１
．０６５４７１１．０６５ ４　　　　　　　　　７９　　　　　　　　　　　　１
．０６５４　　　　　　　　　　７１　　　　　　　　
　　　　　　１．０６５４　　　　　　　　　８６　　
　’　　　　　　　　　　　１．０６５５　　　　　　
　　　　ｇｌ　　　　　　　　　　　　　　１．０Ｇ３
５　　　　　　　　　５１　　　　　　　　　　　　　
１．０６３５　　　　　　　　　９３　　　　　　　　
　　　　　１　、０６３５　　　　　　　　　８４　　
　　　　　　　　　　　１　、０６３５　　　　　　　
　　　９８　　　　　　　　　　　　　１　、０６３６
　　　　　　　　　９３　　　　　　　　　　　　　１
．０６３６　　　　　　　　　　９３　　　　　　　　
　　　　　　１．０６３６　　　　　　　　　　９１　
　　　　　　　　　　　　１．０６３表１において、生
理的食塩水“　は単一等張性ＮａＣｔ水溶液である。生
理的食塩水峠は等仮性液体の２倍のＮａＣ９，を含む高
張性である単−ＮａＣＬ溶液を意味し、生理的食塩水”
縞は等仮性液体の３倍のＮａＣ９，を含む高張性液体で
ある。メトリズアー１〜　はその等偏性水溶液であり、
メトリズアミト　は等仮性液体の２倍の添加剤を含む高
張性液体である。表１を図１および２との関係で検ｉｔ
ｊ′Ｔｆると、次のような結論となる：第一に血液試料
が加令すると顆粒球の比重がリンパ球および単球に比例
して減少し、その減少速度は時間と温度の函数であり、 第二に、低分子量イオン性物質を含む等仮性液体に全血
液が入っても血球比重に本質的に影響がなく、かつ 第三に、低分子量イオン性物質を含む高張性液体に全面
が入ると、血球比重減少が防止されるが、または元に戻
り、その程度は高張性液体の侵透圧変によるものである
。

高張性生理的食塩水と比較して、高張性メトリツアミド
溶液の方の効果が幾分大きい理由は充分説明できていな
い。従って、三つの可能な！１１構が推論できる。第一
は二溶液の浸透圧の違いである。

第二は血球膜の浸透規制要素と二つの溶質との間に生じ
る相互作用の違いと仮定する。第三はメトリツアミド分
子と血球膜との相互作用の可能性で、これにより浸透圧
考慮と別に血球比重の増加を引起ザかも知れない。

更に、メトリズアミド、その誘導体および関連化合物中
のベンズアミド環は分子に極度の親油性を付与すること
が認められている。従って、該分子が血漿膜への実質的
溶解性を示し、血球膜との相互作用が一層容易になると
考えることができる。

（前記のナイコデンズ密度勾配媒質はベンズアミド環を
含まずかつその効果がその構造に親油基を有す有機分子
に見出されていないことに注視すべきである）血球内［
Ｎａ　”　］濃度はエネルギー従属、血漿膜環境Ｎａ　
”　Ｋ＋水ポンプ法より、血球で規制されていることは
確実である。従って、正常血球における血球内［Ｎａ“
］ｉｌｔ度は血球外［Ｎａ”］ｉＨ度よりも低く押えら
れている。故に、高張性生理的食塩水からの［Ｎａ”］
の侵入は血球により積極的に防止される。

本発明による血球分離法のもう一つの実施例では、血球
用培養基は顆粒球の浮′ｉｔＬ密度変化を防止する、お
よび／またはその浮遊密度損失を回復する薬品を構成す
る。

自然環境の血球は、それが正常に成長する恒常性系で生
育する。試験管中の血球は加令効果を示す傾向にあり、
その結果、かかる系の欠如により死滅する。試験管にお
ける血球成長を保持するための多種の倍増が開発されて
いる。典型的には、血球は分離され、血球の信地懸濁液
中で成長する。

全血液の血球分離特性は、血球培養基を加えることで保
持されることを児い出した。血球用血球培養基は肯定的
結果を与えるが、特にロスウェルパーク　メモリアル　
インスティテユート（Ｒｏｓｗｅｌｌ　　Ｐａｒｋ　ｌ
ｙｌｅｍｏｒｉａｌ　　ｌ　ｎｓｔ目ｕｔｅ）倍増およ
びマツコイ（ＭＣＣｏｙ）倍増は特に効果がある。

例ば、約２０〜５０容量％のこれらの倍増■で全血液試
料を希釈すると、分離純度は一般的に高張性」８溶液お
よびナイコデンズ塩溶液を用いた時よりも良いものが得
られる。このように、純度は約８３％から約９３％に変
化することが観察された。

ジャーナル　オブ　イミュノロジカル　メソッド（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ’　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　
Ｍｅｔｈｏｄｓ）、７３．２９〜４０　（１９８４）の
「新鮮血液および加令血液についてのＴおよびＢ細胞の
比較」で、ジェイ。

ケイ、エイ、ニコルソンらは（Ｊ、に、△、Ｎ１Ｃｈｏ
ｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ）　、細胞培養基による全血液試
料の希釈について記述し特にマツコイの５ａ培養基使用
に注目している。しかしながら、顆粒球からのリンパ球
分離における培養基添加の利点についての開示はない。

云わば、定常的血液希釈が単に示されているだけで、本
発明の如き態様での培養基使用可能性、即ら希釈剤とし
てだけでなく、全血液の保存剤としての可能性について
の認識は当然のこと、その示唆もない。本発明にＪ３け
るゲル状物質を用いる血液試料からのリンパ球および顆
粒球分離を改良する際に培１１基を使用することについ
ての記述は見られない。本発明は特に加令血液試料を目
的としているが、新鮮血液にも適用できることが評価で
きる。換言すれば採血から試験までの経過時間が長くて
も本発明ではリンパ球と単核球の定量的分離が保証され
る。このように、両立性からして、新鮮血液の倍増は次
のリンパ球と単核球の分離操作に悪影響がない。

【図面の簡単な説明】

第１図は定温下、時間に対する血液密度減少を例示した
ものである。 第２図は温度に対プる血球密度減少の程度を例示したも
のである。 ′の続き ジーン　ジュニア　　　　インク　ストリート　２５−
ク州　コーニング　パーシュ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）凝固防止血液試料中の顆粒球からリンパ球および
   単球を分離する方法において、顆粒球の浮遊密度の明白
   な変化を防止し、および／または顆粒球の浮遊密度の損
   失を回復し、次の各段階からなる方法； （イ）本質的に血球と化学的相容性の低分子量有機また
   は無機イオン性物質を含有する高張性液体、および／ま
   たは本質的に血球と化学的相容性の高分子量有機物質を
   含有する等張性または高張性液体、および／または血球
   用培養基と当該血液試料とを混合し、当該血液試料と当
   該液体の接触を少なくとも約１０分間保ち、 （ロ）血液成分および当該液体に化学的不活性である水
   容性、チクソトロピックゲル状物質を当該凝固防止血液
   −液体混合物に入れ、 （ハ）当該ゲル状物質が十分に流入しリンパ球および単
   球と顆粒球との間に膜を形成するための力と十分な時間
   、当該血球−液体−ゲル混合物を遠心分離し、ついで （ニ）当該膜上よりリンパ球と単核球とを採取する。
2. （２）低分子量イオン性物質を含有する当該高張性液体
   が生理的食塩水である特許請求の範囲第１項記載の方法
   。
3. （３）当該イオン性物質が約１５００より低い分子量で
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）当該高分子量有機物質がその構造中に親油基を有
   す分子である特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. （５）当該高分子量有機物質がメトリゾイック酸および
   ／またはその誘導体である特許請求の範囲第４項記載の
   方法。
6. （６）当該メトリゾイック酸誘導体がメトリゾイック酸
   ナトリウムおよびメトリズアミドの群から選択される特
   許請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）当該高分子量有機物質がＮ，Ｎ−ビス（２，３−
   ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒド
   ロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨ
   ウ素−イソフタルアミドである特許請求の範囲第１項記
   載の方法。
8. （８）当該血球用培養基がロスウェル　パークメモリア
   ル　インスティテュート倍地およびマッコイ倍地の群か
   ら選択される特許請求の範囲第１項記載の方法。
9. （９）当該ゲル状物質の比重が約１．０５５〜１．０７
   ５ｇ／ｃｍ＾３の間である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。
10. （１０）当該ゲル状物質の比重が約１．０６０〜１．０
    ６５ｇ／ｃｍ＾３の間である特許請求の範囲第９項記載
    の方法。
11. （１１）当該遠心分離を少なくとも１．２００Ｇの力で
    実施する特許請求の範囲第１項記載の方法。
12. （１２）血液試料中の顆粒球の浮遊密度の明白な変化を
    防止し、および／またはその浮遊密度の損失を回復する
    ことにより血液試料中の顆粒球からのリンパ球と単球の
    高品質分離を保証するもので、本質的に血球と化学的相
    容性の低分子量有機または無機イオン性物質を含有する
    高張性液体および／または本質的に血球と化学的相容性
    の高分子量有機物質を含有する等張性または高張性液体
    、および／または血球用培養基と血液試料を接触させる
    ことからなる方法。
13. （１３）当該血液試料と該液体との接触を少なくとも約
    １分以上保持する特許請求の範囲第１２項記載の方法。
14. （１４）低分子量イオン性物質を含有する当該高張性液
    体が生理的食塩水である特許請求の範囲第１２項記載の
    方法。
15. （１５）当該イオン性物質が約１５００より低い分子量
    である特許請求の範囲第１２項記載の方法。
16. （１６）当該高分子量有機物質がその構造中に親油基を
    有する分子である特許請求の範囲第１２項記載の方法。
17. （１７）当該高分子量有機物質がメトリゾイック酸およ
    び／またはその誘導体である特許請求の範囲第１６項記
    載の方法。
18. （１８）当該メトリゾイック酸の誘導体がメトリゾイッ
    ク酸ナトリウムおよびメトリズアミドの群が選択される
    特許請求の範囲第１７項記載の方法。
19. （１９）当該高分子量有機物質がＮ，Ｎ′−ビス（２，
    ３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−２，３−ジヒ
    ドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリ
    ヨウ素−イソフタルアミドである特許請求の範囲第１２
    項記載の方法。
20. （２０）当該血液用培養基がロスウェル　パークメモリ
    アル　インスティテュート倍地およびマッコイ倍地から
    の群から選択される特許請求の範囲第１２項記載の方法
    。