CN114350605B - 一种外周血淋巴细胞分离液及其应用 - Google Patents
一种外周血淋巴细胞分离液及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114350605B CN114350605B CN202111668019.XA CN202111668019A CN114350605B CN 114350605 B CN114350605 B CN 114350605B CN 202111668019 A CN202111668019 A CN 202111668019A CN 114350605 B CN114350605 B CN 114350605B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peripheral blood
- parts
- lymphocyte
- separation
- separation liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 86
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 46
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 30
- -1 polypropylene pyrrolidone Polymers 0.000 claims abstract description 17
- ZEYOIOAKZLALAP-UHFFFAOYSA-M sodium amidotrizoate Chemical compound [Na+].CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I ZEYOIOAKZLALAP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 15
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 26
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 abstract description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 abstract description 9
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 abstract description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 abstract description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种外周血淋巴细胞分离液及其应用。该外周血淋巴细胞分离液以质量计算，含有102.8～110份泛影酸钠、10～30份羟乙基淀粉、30～45份聚蔗糖和2.5～20份聚丙烯吡咯烷酮。采用泛影酸钠代替昂贵的泛影葡胺的同时，引入其他糖类或非糖类高分子，改善小鼠外周血淋溶菌酶巴分离过程中分离效果不佳或者不稳定的现象。可以在长时间内维持分离液和血液间的稳定性，可防止加样时间过长或力度过大，出现的血液和分离液互混的问题，减少血液和分离液互溶现象。且回收效率高、纯度高和活率高，血小板污染少。
Description
技术领域
本发明涉及淋巴细胞分离技术领域，具体地，涉及一种外周血淋巴细胞分离液及其应用。
背景技术
外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte)简称PBL，是白细胞的一种，由淋巴器官产生，参与特异性免疫反应，在免疫应答机制中起重要作用。检测具有免疫应答的外周血淋巴细胞及其组成的数量或比例、功能和强度，是判断人体细胞免疫水平的重要手段。
目前外周血淋巴细胞分离主要是利用血液中各类细胞本身密度差异，利用一定密度的分离液，经过离心，使各类细胞分离开来。传统的分离液以聚蔗糖和泛影葡胺组合的混合物进行外周血淋巴细胞分离。但是泛影葡胺价格昂贵。此外，小鼠是生物学和医学研究领域常用的实验动物，但是小鼠外周血含量较少，且取血过程中极容易导致溶血现象的发生，导致外周血淋巴细胞分离的效果不佳且不稳定。同时也容易产生血小板污染现象。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有外周血淋巴细胞分离液技术的不足，提供了一种外周血淋巴细胞分离液。该外周血淋巴细胞分离液以质量计算，含有102.8～110份泛影酸钠、10～30份羟乙基淀粉、30～45份聚蔗糖和2.5～20份聚丙烯吡咯烷酮。采用泛影酸钠代替昂贵的泛影葡胺的同时，引入其他糖类或非糖类高分子，改善小鼠外周血淋溶菌酶巴分离过程中分离效果不佳或者不稳定的现象。
本发明的第一个目的是提供一种组合物。
本发明的第二个目的是提供所述组合物在制备外周血淋巴细胞分离液中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种外周血淋巴细胞分离液。
本发明的第四个目的是提供所述外周血淋巴细胞分离液在制备分离外周血淋巴细胞产品中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种分离外周血淋巴细胞的试剂盒。
本发明的第六个目的是提供一种分离外周血淋巴细胞的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种组合物，以质量计算，所述组合物中含有102.8～110份泛影酸钠、10～30份羟乙基淀粉、30～45份聚蔗糖和2.5～20份聚丙烯吡咯烷酮。
优选地，以质量计算，所述组合物中含有106.8～110份泛影酸钠、10～30份羟乙基淀粉、30～45份聚蔗糖和5～10份聚丙烯吡咯烷酮。
更优选地，以质量计算，所述组合物中含有108.5～110份泛影酸钠、10～30份羟乙基淀粉、30～45份聚蔗糖和5～10份聚丙烯吡咯烷酮。
最优选地，以质量计算，所述组合物中含有108.5份泛影酸钠、30份羟乙基淀粉、30份聚蔗糖和5份聚丙烯吡咯烷酮，所述组合物密度为1.082～1.084g/mL，pH为7.2～7.6。
所述的组合物在制备外周血淋巴细胞分离液中的应用。
一种外周血淋巴细胞分离液，所述外周血淋巴细胞分离液含有泛影酸钠、羟乙基淀粉、聚蔗糖和聚丙烯吡咯烷酮。
优选地，所述外周血淋巴细胞分离液含有任一所述的组合物。
所述的外周血淋巴细胞分离液在制备分离外周血淋巴细胞产品中的应用。
一种分离外周血淋巴细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的外周血淋巴细胞分离液。
所述的试剂盒在分离小鼠外周血淋巴细胞中的应用。
一种分离外周血淋巴细胞的方法，包括以下步骤：
S1：稀释抗凝血液；
S2：将步骤S1稀释后的抗凝血液，覆盖到权利要求5或6所述的外周血淋巴细胞分离液上层；
S3：分离得到淋巴细胞层；
S4：洗涤淋巴细胞层。
优选地，所述分离外周血淋巴细胞的方法，包括以下步骤：
S1：用PBS缓冲液和/或无钙镁Hanks缓冲液以1～2倍体积稀释抗凝血液；
S2：将步骤S1稀释后的抗凝血液，覆盖到所述的外周血淋巴细胞分离液上层；
S3：离心，离心力为500～1000g，离心时间为20～30min，得到淋巴细胞层；
S4：洗涤淋巴细胞层，100～200g离心10～15min，弃上清，重复一次洗涤和离心。
更优选地，所述的分离外周血淋巴细胞的方法，包括以下步骤：
S1：用无钙镁Hanks缓冲液以1倍体积稀释抗凝血液；
S2：将步骤S1稀释后的抗凝血液，覆盖到所述的外周血淋巴细胞分离液上层；
S3：离心，离心力为800g，离心时间为25min，得到淋巴细胞层；
S4：洗涤淋巴细胞层，100g离心10min，弃上清，重复一次洗涤和离心。
洗涤淋巴细胞层后再离心，可以去除血小板等杂质，提高淋巴细胞的纯度。
离心力大，离心时间长，能够保证淋巴细胞回收率，但是也能回收一些其他细胞，分离纯度降低；而降低离心力，会降低淋巴细胞回收率，但是能增大分离的纯度。
所述的外周血淋巴细胞分离液的制备方法，所述制备方法步骤如下：
S11.准确称量各组分，溶解于水中；
S12.调整pH至7.2～7.6，定容；
S13.调整温度至19～21℃，分离液密度为1.082～1.084g/mL；
S14.将其过滤除菌后，2～8℃保存。
优选地，所述外周血淋巴细胞分离液的制备方法步骤如下：
S11.准确称量各组分，溶解于超纯水中，搅拌溶解；
S12.调整pH至7.2～7.6，定容；
S13.调整温度至20℃，进行密度检测，分离小鼠外周血淋巴细胞的分离液密度为1.082～1.084g/mL；
S14.将其过滤除菌后，4℃保存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的外周血淋巴细胞分离方案，可以在长时间内维持分离液和血液间的稳定性，可防止加样时间过长或力度过大，出现的血液和分离液互混的问题，减少血液和分离液互溶现象。且回收效率高、纯度高和活率高，血小板污染少。
附图说明
图1为分离前后的小鼠外周血示意图。
图2为组3、组7和组10小鼠外周血淋巴细胞分离液稳定性情况，从左至右依次为组10、组3和组7。
图3为组3和组7、A和B商业公司小鼠外周血淋巴细胞分离液分离情况，从左至右为：组3、A公司产品、组7和B公司产品
图4为其他配方小鼠外周血淋巴细胞分离液的效果，从左至右为：A公司产品、B公司产品、组11和组12。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1聚丙烯吡咯烷酮浓度对外周血淋巴细胞分离的影响
一、配置小鼠外周血淋巴细胞分离液
小鼠外周血淋巴细胞分离液各组分体积比如表1所示，配置步骤如下：
准确称量各组分，溶解于超纯水中，搅拌溶解；调整pH至7.2～7.6，定容；调整温度至20℃，进行密度检测，泛影酸钠用于密度调整，密度为1.083±0.001g/mL；过滤除菌后，4℃保存。
表1组1～6的小鼠外周血淋巴细胞分离液配方
二、实验方法
测试不同聚丙烯吡咯烷酮浓度下，小鼠外周血淋巴细胞分离效果。具体步骤如下：
1.取新鲜抗凝全血(肝素、EDTA或枸橼酸钠等抗凝剂皆可)，用等体积PBS或者无钙镁Hanks缓冲液等比稀释(也可以1～2倍稀释)；
2.将配置的组1～6的外周血淋巴细胞分离液3mL加入到15mL无菌离心管中；
3.将离心管倾斜45°，将2mL步骤1稀释后的血液缓慢沿壁加入到离心管中，使血清平铺到淋巴细胞分离液上层；
4.将离心管置于水平离心机，降低离心机加减速(3～5档为宜)，室温(25℃)条件下，800g离心25min；
5.离心后，轻拿离心管置于管架上，可观察到明显的分层现象：最上层是血浆层；中上白膜层是淋巴细胞层；中下层为淋巴细胞分离液层；最下层为红细胞和粒细胞层。吸除最上层血浆层，小心吸取白膜层(淋巴细胞层)到另外一个洁净的无菌离心管；
6.用8mL PBS或者其他缓冲液洗涤后，100g离心10min，弃上清；
7.重复一次洗涤，离心；
8.用对应的培养基重悬并收集分离后的淋巴细胞。
分离前后的小鼠外周血示意图见图1。
取小鼠淋巴层细胞，分别用台盼蓝染色计数后，检测细胞数量以及活率(效果见表2)，用流式细胞仪检测CD3、CD8占比(效果见表3)。
表2组1～6的外周血淋巴细胞分离液对小鼠淋巴细胞分离后活率以及密度的影响
| 分组 | 平均细胞密度 | 平均细胞活率 |
| 组1 | 0.623×106个/mL | 71.90％ |
| 组2 | 2.555×106个/mL | 72.45％ |
| 组3 | 2.400×106个/mL | 73.85％ |
| 组4 | 1.890×106个/mL | 76.63％ |
| 组5 | 1.346×106个/mL | 40.22％ |
| 组6 | 0.971×106个/mL | 36.38％ |
表3实验组1～6的外周血淋巴细胞分离液对小鼠淋巴细胞分离后流式CD3、CD8表抗占比
| 分组 | CD 3占比 | CD8占比 |
| 1 | 11.3％ | 3.2％ |
| 2 | 29.5％ | 8.2％ |
| 3 | 67.4％ | 14.8％ |
| 4 | 62.1％ | 13.5％ |
| 5 | 51.3％ | 9.4％ |
| 6 | 46.2％ | 6.7％ |
三、实验结果
结果表明，当聚蔗糖和羟乙基淀粉的量恒定为30mg/mL时，聚丙烯吡咯烷酮添加后相比添加前，小鼠淋巴细胞富集纯度和数量增加。且随着聚丙烯吡咯烷酮的浓度上升，富集的纯度和细胞数量也逐渐上升，但聚丙烯吡咯烷酮浓度超过一定值后，富集的纯度和细胞数量开始下降。组2的平均细胞密度和平均细胞活率虽然较高，但CD3、CD8占比相对较低；而组3和组4不仅平均细胞密度和平均细胞活率高，CD3、CD8占比也相对较高，故聚丙烯吡咯烷酮浓度以5～10mg/mL之间为佳。
实施例2泛影酸钠和聚蔗糖含量对小鼠外周血淋巴细胞分离效果的影响
一、配置小鼠外周血淋巴细胞分离液
小鼠外周血淋巴细胞分离液各组分体积比如表4所示，配置步骤见实施例1。
表4组3和组7～9的小鼠外周血淋巴细胞分离液配方
二、实验方法
根据实施例1的实验结果，发现聚丙烯吡咯烷酮浓度以5～10mg/mL之间为佳，控制聚丙烯吡咯烷酮浓度在5～10mg/mL之间，探究泛影酸钠和聚蔗糖含量对小鼠外周血淋巴细胞分离效果的影响。
由于小鼠的外周血普遍较少，另取一批相同品种和饲养环境的小鼠的新鲜抗凝全血，按照实施例1的方法分离并检测组3和组7～9的外周血淋巴细胞分离液对小鼠淋巴细胞分离后的细胞数量以及活率(效果见表5)和CD3、CD8占比(效果见表6)。
表5组3和组7～9的外周血淋巴细胞分离液对小鼠淋巴细胞分离后活率以及密度的影响
| 分组 | 平均细胞密度 | 平均细胞活率 |
| 组3 | 2.25×106个/mL | 85.2％ |
| 组7 | 2.12×106个/mL | 84.45％ |
| 组8 | 2.01×106个/mL | 83.35％ |
| 组9 | 1.62×106个/mL | 80.3％ |
表6组3和组7～9的外周血淋巴细胞分离液对小鼠淋巴细胞分离后流式CD3、CD8表抗占比
| 分组 | CD 3占比 | CD8占比 |
| 组3 | 70.0％ | 22.8％ |
| 组7 | 71.2％ | 21.3％ |
| 组8 | 67.3％ | 20.9％ |
| 组9 | 66.7％ | 23.3％ |
三、实验结果
结果表明：当外周血淋巴细胞分离液含有5～10mg/mL聚丙烯吡咯烷酮，聚蔗糖和羟乙基淀粉处于一定浓度范围内，都能够取得很好的分离效果。
实施例3外周血淋巴细胞分离液稳定性
一、配置小鼠外周血淋巴细胞分离液
配置小鼠外周血淋巴细胞分离液组10，各组分含量为：90mg/mL泛影酸钠+60mg/mL聚蔗糖，组3和组7各组分体积比见实施例2，配置步骤见实施例1。
二、实验方法
由于小鼠的外周血普遍较少，另取一批相同品种和饲养环境的小鼠的新鲜抗凝全血，测试组3、组7和组10小鼠外周血淋巴细胞分离液稳定性。按照实施例1的方法进行分离。分别于0、5、10、15、30和60min进行拍照观察分离液和血液的稳定性。
三、实验结果
如图2所示，结果表明本发明组3和组7的小鼠外周血淋巴细胞分离液在较长时间内能够保持其本身稳定性，不阻碍较大血细胞的重力沉降的同时，也没有和血液发生互溶现象。而组10的血液和分离液出现了互溶的现象，丧失分离的能力。因此不含聚丙烯吡咯烷酮的小鼠外周血淋巴细胞分离液在分离小鼠外周血淋巴细胞时，会出现互溶的现象，分离能力和稳定性较差。
实施例4本发明小鼠外周血淋巴细胞分离液对比市面相关产品效果
一、配置小鼠外周血淋巴细胞分离液
配置小鼠外周血淋巴细胞分离液组3和组7，各组分体积比见实施例2，配置步骤见实施例1。
准备A和B商业公司的小鼠外周血淋巴细胞分离液。
二、实验方法
由于小鼠的外周血普遍较少，另取一批相同品种和饲养环境的小鼠的新鲜抗凝全血，按照实施例1的方法进行分离。对分离后分层效果进行拍照观察。
按照实施例1的方法检测组3和组7的外周血淋巴细胞分离液对小鼠淋巴细胞分离后的细胞数量以及活率(效果见表7)和CD3、CD8占比(效果见表8)。
表7组3、组7及A和B商业公司的小鼠外周血淋巴细胞分离液对小鼠淋巴细胞分离后活率以及密度的影响
| 分组 | 平均细胞密度 | 平均细胞活率 |
| 组3 | 2.57×106个/mL | 79.55％ |
| 组7 | 2.355×106个/mL | 84.2％ |
| A公司产品 | 2.155×106个/mL | 61.8％ |
| B公司产品 | 2.025×106个/mL | 70.2％ |
表8组3、组7及A和B商业公司的小鼠外周血淋巴细胞分离液对小鼠淋巴细胞分离后分离后流式CD3、CD8表抗占比
| 分组 | CD 3占比 | CD 8占比 |
| 组3 | 65.8％ | 13.8％ |
| 组7 | 70.3％ | 14％ |
| A公司产品 | 61.2％ | 13.2％ |
| B公司产品 | 63％ | 13.5％ |
三、实验结果
图3表明说明的小鼠淋巴细胞分离液在较长时间内能够保持其本身稳定性，表7和表8表明：本发明的小鼠淋巴细胞分离液分离小鼠外周血淋巴细胞对比商业公司的产品，回收效率、淋巴细胞纯度和细胞活率优于或不弱于市面上的小鼠外周血淋巴细胞分离液。
对比例1不含聚丙烯吡咯烷酮的小鼠外周血淋巴细胞分离液对分离效果的影响
一、配置小鼠外周血淋巴细胞分离液
配置小鼠外周血淋巴细胞分离液组11和组12，各组分体积比如表9所示，配置步骤见实施例1。
准备A和B商业公司的小鼠外周血淋巴细胞分离液。
表9组11和组12的小鼠外周血淋巴细胞分离液配方
二、实验方法
由于小鼠的外周血普遍较少，另取一批相同品种和饲养环境的小鼠的新鲜抗凝全血，按照实施例1的方法进行分离，离心后直接观察分离效果。
三、实验结果
如图4所示，结果表明，在仅含有泛影酸钠、纯羟乙基淀粉、聚蔗糖体系情况下，小鼠外周淋巴细胞分离效果较差，易出现溶血，分离液和血液互混现象。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种组合物在制备外周血淋巴细胞分离液中的应用，其特征在于，以质量计算，所述组合物中由108 .5份泛影酸钠、30份羟乙基淀粉、30份聚蔗糖和5份聚丙烯吡咯烷酮组成，所述组合物密度为1 .082～1 .084g/mL，pH为7 .2～7 .6。
2.一种外周血淋巴细胞分离液，其特征在于，所述外周血淋巴细胞分离液由108 .5份泛影酸钠、30份羟乙基淀粉、30份聚蔗糖和5份聚丙烯吡咯烷酮组成，密度为1 .082～1.084g/mL，pH为7 .2～7 .6。
3.权利要求2所述的外周血淋巴细胞分离液在制备分离外周血淋巴细胞产品中的应用。
4.一种分离外周血淋巴细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求2所述的外周血淋巴细胞分离液。
5.一种分离外周血淋巴细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：稀释抗凝血液；
S2：将步骤S1稀释后的抗凝血液，覆盖到权利要求2所述的外周血淋巴细胞分离液上层；
S3：分离得到淋巴细胞层；
S4：洗涤淋巴细胞层。
6.根据权利要求5所示的分离外周血淋巴细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤
S1：用PBS缓冲液和/或无钙镁Hanks缓冲液以1～2倍体积稀释抗凝血液；
S2：将步骤S1稀释后的抗凝血液，覆盖到权利要求2所述的外周血淋巴细胞分离液上层；
S3：离心，离心力为500～1000g，离心时间为20～30min，得到淋巴细胞层；
S4：洗涤淋巴细胞层，100～200g离心10～15min，弃上清，重复一次洗涤和离心。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111668019.XA CN114350605B (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种外周血淋巴细胞分离液及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111668019.XA CN114350605B (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种外周血淋巴细胞分离液及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114350605A CN114350605A (zh) | 2022-04-15 |
| CN114350605B true CN114350605B (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=81105179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111668019.XA Active CN114350605B (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种外周血淋巴细胞分离液及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114350605B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4640785A (en) * | 1984-12-24 | 1987-02-03 | Becton Dickinson And Company | Separation of lymphocytes and monocytes from blood samples |
| CN102533650A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-04 | 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 | 一种细胞分离介质及细胞分离方法 |
| CN102660504A (zh) * | 2012-04-18 | 2012-09-12 | 高旭 | 一种淋巴细胞分离液的制备方法 |
| CN105524881A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-04-27 | 南京三生生物技术有限公司 | 动物淋巴细胞分离液及其制备方法 |
| CN110551686A (zh) * | 2019-09-05 | 2019-12-10 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 外周血单个核细胞的分离方法 |
| CN113502264A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-10-15 | 无锡华精生物科技有限公司 | 一种淋巴细胞分离液及其制备方法 |
-
2021
- 2021-12-30 CN CN202111668019.XA patent/CN114350605B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4640785A (en) * | 1984-12-24 | 1987-02-03 | Becton Dickinson And Company | Separation of lymphocytes and monocytes from blood samples |
| CN102533650A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-04 | 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 | 一种细胞分离介质及细胞分离方法 |
| CN102660504A (zh) * | 2012-04-18 | 2012-09-12 | 高旭 | 一种淋巴细胞分离液的制备方法 |
| CN105524881A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-04-27 | 南京三生生物技术有限公司 | 动物淋巴细胞分离液及其制备方法 |
| CN110551686A (zh) * | 2019-09-05 | 2019-12-10 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 外周血单个核细胞的分离方法 |
| CN113502264A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-10-15 | 无锡华精生物科技有限公司 | 一种淋巴细胞分离液及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AEP大鼠外周血淋巴细胞的分离及其影响因素的探讨;郑雪莲等;四川医学;第28卷(第11期);1195-1196 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114350605A (zh) | 2022-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Worton et al. | Physical separation of hemopoietic stem cells from cells forming colonies in culture | |
| Loos et al. | Ficoll-isopaque gradients for the determination of density distributions of human blood lymphocytes and other reticulo-endothelial cells | |
| Roos et al. | [8] Purification and cryopreservation of phagocytes from human blood | |
| US4255256A (en) | Medium for the separation of human blood leucocytes | |
| CN108508196B (zh) | 一种检测人调节性t细胞亚型的试剂盒及检测方法 | |
| Card et al. | Deformability of stored red blood cells. Relationship to degree of packing | |
| Wilson et al. | Invasion and growth of Plasmodium falciparum in different types of human erythrocyte | |
| WO2003050532A1 (fr) | Systeme de separation de cellules sanguines | |
| Brun et al. | A new method for isolation of reticulocytes: positive selection of human reticulocytes by immunomagnetic separation | |
| Delaney et al. | Hematologic observations on the aquatic and estivating African lungfish, Protopterus aethiopicus | |
| CN107034189A (zh) | 一种造血干细胞培养方法 | |
| Waterstrat et al. | Use of a discontinuous Percoll gradient technique for the separation of channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque), peripheral blood leucocytes | |
| CN114350605B (zh) | 一种外周血淋巴细胞分离液及其应用 | |
| WO2013091537A1 (zh) | 一种应用膜分离的检测方法及膜透明液 | |
| EP0276931B1 (en) | Blood cell separation | |
| CN107058221A (zh) | 一种鲟鱼外周血淋巴细胞的分离方法 | |
| Smith et al. | Variable deformability of irreversibly sickled erythrocytes | |
| CA1127537A (en) | Medium for the separation of human blood leucocytes | |
| Harms et al. | Use of a two-step Percoll® gradient for separation of loggerhead sea turtle peripheral blood mononuclear cells | |
| CN113322232B (zh) | 富含血小板血浆的制备方法 | |
| CN112986065B (zh) | 一种用于血细胞分析仪的全血质控品及其制备方法 | |
| Kwan et al. | Studies on human monocytes with a multiparameter cell sorter. | |
| US7727764B2 (en) | Non-isopycnic cell purification using percoll | |
| CN108949686B (zh) | 一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法 | |
| CN108624552B (zh) | 一种获得高纯度鸡精子的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |