CN113502264A - 一种淋巴细胞分离液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淋巴细胞分离液及其制备方法，其特征在于，包括以下组分：甘油、乙醇、蔗糖、葡甲胺、泛影酸和环氧氯丙烷，通过将蔗糖与泛影酸加入乙醇溶液中，合成水溶性聚蔗糖乙醇溶液，作为分子筛分离液；再将葡甲胺与环氧氯丙烷加入甘油中，在室温下，配制成澄清的生物溶液，并将生物溶液放置于透析纸袋中，将其放入去离子水中离子置换培养一段时间后，检测其不含多余的杂质离子；然后，使用氢氧化钠和盐酸调节上述两种溶液制备得到的溶液的pH值为合适范围；最后将调节pH值稳定后的两种溶液混合，搅拌均匀，得到淋巴分离液，本发明分离淋巴细胞效率高，分离纯度高，提高淋巴细胞的质量，可获得高质量的淋巴细胞，适用于临床推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及淋巴细胞分离技术领域，特别涉及一种淋巴细胞分离液及其制备方法。
背景技术
纯淋巴细胞群的分离纯化，主要利用单细胞粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，将单个核细胞悬液中的单核细胞吸附除去，从而获得纯淋巴细胞群。
目前主要通过粘附贴壁法、吸附柱过滤法、梯度离心分离方法分离淋巴细胞，现有的分离方法存在操作步骤繁琐，技巧性较强，对操作者的经验要求比较高，分离效果将大受影响，甚至分离不出淋巴细胞层，此外，分离液大多具有一定的毒性，影响分离效果和分离后的细胞质量，导致分离效率较低。例如，市面上存在的淋巴细胞分离液产品：葡聚糖，羟乙基淀粉、泛影酸钠，它们都具有一定毒性。
因此，寻求一种安全性高的淋巴细胞分离液成为本领域技术人员亟待解决的问题。
针对现有技术的缺点，目前尚没有解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种淋巴细胞分离液及其制备方法，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案是这样实现的：
一种淋巴细胞分离液，包括以下组分：包括质量百分比为5-20%的甘油、质量百分比为2-15%的乙醇、质量百分比为7-20%的蔗糖、质量百分比为3-12%的葡甲胺、质量百分比为4-15%的泛影酸和10-20%环氧氯丙烷，所述分离液余量为去离子水，所述分离液的总量为100%。
进一步的：质量百分比分别为：甘油5-12%、乙醇2-8%、蔗糖7-15%、葡甲胺3-5%、泛影酸4-9%和环氧氯丙烷10-15%。
进一步的：甘油7-15%、乙醇4-10%、蔗糖9-18%、葡甲胺5-9%、泛影酸6-13%和环氧氯丙烷12-18%。
进一步的：甘油9-20%、乙醇6-15%、蔗糖12-20%、葡甲胺8-12%、泛影酸9-15%和环氧氯丙烷15-20%。
一种淋巴分离液的制备方法，包括以下步骤：
1）将蔗糖与泛影酸加入乙醇溶液中，合成水溶性聚蔗糖乙醇溶液，作为分子筛分离液；
2）将葡甲胺与环氧氯丙烷加入甘油中，在室温下，配制成澄清的生物溶液，并将生物溶液放置于透析纸袋中，将其放入去离子水中离子置换培养一段时间后，检测其不含多余的杂质离子；
3）使用氢氧化钠和盐酸调节步骤1与步骤2制备得到的溶液的pH值，调节pH在6.5-7.5的范围内；
4）将步骤3调节pH稳定后的两种溶液混合，搅拌均匀，得到淋巴分离储备液；
5）将步骤4中淋巴分离液储备液进行真空浓缩成密度为1.077-1.078g/cm3的淋巴分离液溶液，用于淋巴细胞的分离。
作为本发明的优选实施方式，所述蔗糖和泛影酸在乙醇溶液中，在40°C下，反应12小时，所述蔗糖和泛影酸优选质量比为7-15%：4-9%，所述乙醇质量比为2-8%。
作为本发明的优选实施方式，所述葡甲胺与环氧氯丙烷和甘油的质量比为3-5%：10-15%：5-12%。
作为本发明的优选实施方式，所述氢氧化钠和盐酸的为浓度均为0.5mol/L。
本发明有益效果：本发明公开了一种淋巴细胞分离液及其制备方法，本发明的淋巴分离液将有毒性的葡聚糖更换为蔗糖，通过蔗糖和泛影酸在乙溶液中聚合成水溶性的高分子聚合物的聚蔗糖，聚蔗糖分子结构中存在交联网状结构，它具有分子筛的特性，通过分子筛的分离效果，可将低分子量的化合物与高分子量的化合物分开，再将聚蔗糖乙醇溶液和葡甲胺与环氧氯丙烷加入甘油中制成的澄清的生物溶液调节酸度后，混合搅拌成分离液储备液，再将储备液浓缩成合适密度的淋巴分离液，用于淋巴细胞的分离；由于聚蔗糖分子结构中的交联网状结构的分子筛的作用，从而实现淋巴细胞的分离，本发明分离淋巴细胞效率高，分离纯度高，提高淋巴细胞的质量，可获得高质量的淋巴细胞，适用于临床推广和应用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的一种淋巴细胞分离液的配方，具体包括以下组成物质：甘油、乙醇、蔗糖、葡甲胺、泛影酸和环氧氯丙烷，各组成物质的质量为：甘油7%、乙醇4%、蔗糖9%、葡甲胺4%、泛影酸6%和环氧氯丙烷13%，去离子水为余量，总量为100%。
实施例2
本实施例的一种淋巴细胞分离液的配方，具体包括以下组成物质：甘油、乙醇、蔗糖、葡甲胺、泛影酸和环氧氯丙烷，各组成物质的质量为：甘油12%、乙醇10%、蔗糖15%、葡甲胺8%、泛影酸12%和环氧氯丙烷16%，去离子水为余量，总量为100%。
实施例3
本实施例的一种淋巴细胞分离液的配方，具体包括以下组成物质：甘油、乙醇、蔗糖、葡甲胺、泛影酸和环氧氯丙烷，各组成物质的质量为：甘油17%、乙醇14%、蔗糖118%、葡甲胺12%、泛影酸15%和环氧氯丙烷20%，去离子水为余量，总量为100%。
实施例4
本实施例提供一种淋巴分离液的制备方法，包括以下步骤：
1）将质量比为7%：4%的蔗糖与泛影酸加入乙醇溶液中，合成水溶性聚蔗糖3%乙醇溶液，在40°C下，反应12小时，作为分子筛分离液；
2）将葡甲胺与环氧氯丙烷加入甘油中，葡甲胺与环氧氯丙烷和甘油额质量比分别为3%：10%：5%，在室温下，搅拌均匀，配制成澄清的生物溶液，并将生物溶液放置于透析纸袋中，将其放入去离子水中离子置换培养72小时后，检测其不含多余的杂质离子；
3）使用氢氧化钠和盐酸调节步骤1与步骤2制备得到的溶液的pH值，其中氢氧化钠和盐酸的为浓度均为0.5mol/L，调节步骤1与步骤2制备得到的溶液的pH在6.5-7.5的范围内；
4）将步骤3调节pH稳定后的两种溶液混合，搅拌均匀，得到淋巴分离储备液；。
5）将步骤4中淋巴分离液储备液进行真空浓缩成密度为1.077g/cm3的淋巴分离液溶液，用于淋巴细胞的分离。
实施例5
本实施例提供一种淋巴分离液的制备方法，包括以下步骤：
1）将质量比为10%：6%的蔗糖与泛影酸加入乙醇溶液中，合成水溶性聚蔗糖5%乙醇溶液，在40°C下，反应12小时，作为分子筛分离液；
2）将葡甲胺与环氧氯丙烷加入甘油中，葡甲胺与环氧氯丙烷和甘油额质量比分别为4%：12%：10%，在室温下，搅拌均匀，配制成澄清的生物溶液，并将生物溶液放置于透析纸袋中，将其放入去离子水中离子置换培养72小时后，检测其不含多余的杂质离子；
3）使用氢氧化钠和盐酸调节步骤1与步骤2制备得到的溶液的pH值，其中氢氧化钠和盐酸的为浓度均为0.5mol/L，调节步骤1与步骤2制备得到的溶液的pH在6.5-7.5的范围内；
4）将步骤3调节pH稳定后的两种溶液混合，搅拌均匀，得到淋巴分离储备液；
5）将步骤4中淋巴分离液储备液进行真空浓缩成密度为1.0775g/cm3的淋巴分离液溶液，用于淋巴细胞的分离。
实施例6
本实施例提供一种淋巴分离液的制备方法，包括以下步骤：
1）将质量比为15%：9%的蔗糖与泛影酸加入乙醇溶液中，合成水溶性聚蔗糖8%乙醇溶液，在40°C下，反应12小时，作为分子筛分离液；
2）将葡甲胺与环氧氯丙烷加入甘油中，葡甲胺与环氧氯丙烷和甘油额质量比分别为3-5%：15%：12%，在室温下，搅拌均匀，配制成澄清的生物溶液，并将生物溶液放置于透析纸袋中，将其放入去离子水中离子置换培养72小时后，检测其不含多余的杂质离子；
3）使用氢氧化钠和盐酸调节步骤1与步骤2制备得到的溶液的pH值，其中氢氧化钠和盐酸的为浓度均为0.5mol/L，调节步骤1与步骤2制备得到的溶液的pH在6.5-7.5的范围内；
4）将步骤3调节pH稳定后的两种溶液混合，搅拌均匀，得到淋巴分离储备液；
5）将步骤4中淋巴分离液储备液进行真空浓缩成密度为1.078g/cm3的淋巴分离液溶液，用于淋巴细胞的分离。
对比例1
Focill淋巴细胞分离液。
分离液效果验证
将实施例1-6和对比例1用于将淋巴分离液分离骨髓淋巴干细胞，
全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
步骤1：将本发明实施例1-6和对比例1制备的分离液加入离心管，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2；
步骤2：将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10-30min条件下离心。
结果表明实施例1-6的淋巴细胞分离率均在97％以上，纯度在90％以上，细胞存活率达到95％以上，而对比例一的淋巴细胞分离率为89％以下，纯度为83％，细胞存活率为84％，因此，本实施例1-6的分离液可以明显的提高分离的淋巴细胞的效率和质量，分离的淋巴细胞纯度高于97％以上，本发明的淋巴分离液将有毒性的葡聚糖更换为蔗糖，通过蔗糖和泛影酸在乙溶液中聚合成水溶性的高分子聚合物的聚蔗糖，聚蔗糖分子结构中存在交联网状结构，它具有分子筛的特性，通过分子筛的分离效果，可将低分子量的化合物与高分子量的化合物分开，再将聚蔗糖乙醇溶液和葡甲胺与环氧氯丙烷加入甘油中制成的澄清的生物溶液调节酸度后，混合成分离液储备液，再将储备液浓缩成合适密度的淋巴分离液，用于淋巴细胞的分离，由于聚蔗糖分子结构中的交联网状结构的分子筛的作用，可获得高质量的淋巴细胞。
最后应说明的是：以上所述仅为发明实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种淋巴细胞分离液，其特征在于，所述分离液包括以下组分：包括质量百分比为5-20%的甘油、质量百分比为2-15%的乙醇、质量百分比为7-20%的蔗糖、质量百分比为3-12%的葡甲胺、质量百分比为4-15%的泛影酸和10-20%环氧氯丙烷，所述分离液余量为去离子水，所述分离液的总量为100%。
2.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：包括以下质量百分比组分：甘油5-12%、乙醇2-8%、蔗糖7-15%、葡甲胺3-5%、泛影酸4-9%和环氧氯丙烷10-15%。
3.根据权利要求2所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：包括以下质量百分比组分：甘油7-15%、乙醇4-10%、蔗糖9-18%、葡甲胺5-9%、泛影酸6-13%和环氧氯丙烷12-18%。
4.根据权利要求2所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：包括以下质量百分比组分：甘油9-20%、乙醇6-15%、蔗糖12-20%、葡甲胺8-12%、泛影酸9-15%和环氧氯丙烷15-20%。
5.一种淋巴细胞分离液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将蔗糖与泛影酸加入乙醇溶液中，合成水溶性聚蔗糖乙醇溶液，作为分子筛分离液；
2）将葡甲胺与环氧氯丙烷加入甘油中，在室温下，配制成澄清的生物溶液，并将生物溶液放置于透析纸袋中，将其放入去离子水中离子置换培养一段时间后，检测其不含多余的杂质离子；
3）使用氢氧化钠和盐酸调节步骤1与步骤2制备得到的溶液的pH值，调节pH在6.5-7.5的范围内；
4）将步骤3）调节pH稳定后的两种溶液混合，搅拌均匀，得到淋巴分离储备液。
6.5）将步骤4）中淋巴分离液储备液进行真空浓缩成密度为1.077-1.078g/cm3的淋巴分离液溶液，用于淋巴细胞的分离。
7.根据权利要求5所述的一种淋巴细胞分离液的制备方法，其特征在于，所述蔗糖和泛影酸在乙醇溶液中，在40°C下，反应12小时，所述蔗糖和泛影酸的质量比为7-15%：4-9%，所述乙醇的质量比为2-8%。
8.根据权利要求5所述的一种淋巴细胞分离液的制备方法，其特征在于，所述葡甲胺与环氧氯丙烷和甘油质量比为3-5%：10-15%：5-12%。
9.根据权利要求5所述的一种淋巴细胞分离液的制备方法，其特征在于，所述氢氧化钠和盐酸的浓度均为0.5mol/L。
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