CN105567632B - 分离淋巴细胞的分离方法 - Google Patents

分离淋巴细胞的分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105567632B
CN105567632B CN201511031167.5A CN201511031167A CN105567632B CN 105567632 B CN105567632 B CN 105567632B CN 201511031167 A CN201511031167 A CN 201511031167A CN 105567632 B CN105567632 B CN 105567632B
Authority
CN
China
Prior art keywords
weight
parts
separating liquid
separation method
separating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201511031167.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105567632A (zh
Inventor
宫喜魁
李若鲲
马艳
马艳玲
郝丽敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Hongrun Tianyuan Gene Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Hongrun Tianyuan Gene Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Hongrun Tianyuan Gene Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Hongrun Tianyuan Gene Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201511031167.5A priority Critical patent/CN105567632B/zh
Publication of CN105567632A publication Critical patent/CN105567632A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105567632B publication Critical patent/CN105567632B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种分离淋巴细胞的分离方法，属于生物技术领域。本发明包括如下步骤：将符合药用标准的右旋糖酐3～5重量份，海藻糖2～4重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～0.8重量份，泛影葡胺1～3重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1～0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过滤膜过滤除菌得到分离液；将所述分离液加入离心管中，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2；将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8‑25℃，200g‑800g，10～30min条件下离心；所述样品的来源为外周血、脐带血或骨髓。本发明分离得到的淋巴细胞具有较好的杀肿瘤活性。

Description

分离淋巴细胞的分离方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于分离淋巴细胞的分离方法。
背景技术
在标准的分离过程中，细胞必须与分离液接触15-45分钟的时间，以达到最佳分离效果。在这段时间内，分离液中各组分可能通过被动扩散、细胞的主动运输、胞吞/胞饮作用、表面黏附等途径，在细胞内部蓄积，且此部分蓄积成分，很难通过常规的洗涤从分离得到的目标细胞(例如淋巴细胞)中完全去除。
而且目前的梯度离心分离方法步骤繁琐，技巧性较强，对操作者的经验要求比较高：梯度离心分离需要三步，尤其是第二步，要在高密度的分离液上小心翼翼的铺上低密度的细胞悬液而不能弄混界面，这极大的考验操作者的经验和耐心，费时费力，容易疲劳，而一旦弄混液面，分离效果将大受影响，甚至分离不出淋巴细胞层。而且目前的分离液多有一定的毒性，影响分离效果和分离后的细胞质量，导致分离效率较低。
因此，有必要提供一种能够提高分离效率、保证分离细胞的纯度和活性的分离方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够提高分离效率、保证分离细胞的纯度和活性的分离淋巴细胞的分离方法。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，提供一种分离淋巴细胞的分离方法，包括如下步骤：
步骤1：将符合药用标准的右旋糖酐3～5重量份，海藻糖2～4重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～0.8重量份，泛影葡胺1～3重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1～0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过滤膜过滤除菌得到分离液；
步骤2：将所述分离液加入离心管中，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2；
步骤3：将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心。
所述样品的来源为外周血、脐带血或骨髓。
本发明使用右旋糖酐、海藻糖、超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵配制的分离液时，操作者可以直接将细胞悬浮液铺设在分离液上，铺设过程无须过多考虑液面的破坏，对操作者的操作经验要求较低；本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高并具有较好的杀肿瘤活性；本发明的组合物可配成生理溶液状态的分离介质，对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
进一步地，所述步骤1为：将符合药用标准的右旋糖酐3.5～4.5重量份，海藻糖2.5～3.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.4～0.8重量份，泛影葡胺1.5～2.5重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12～0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。
优选地，所述步骤1为：将符合药用标准的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸钠0.7重量份，泛影葡胺2重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。
进一步地，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
优选地，所述步骤1中的灭菌水为灭菌注射用水。
进一步地，其特征在于，所述右旋糖酐为Dextran70。
优选地，所述步骤1中的滤膜为灭菌的0.22μm滤膜。
进一步地，所述步骤2的稀释比例为1:2-2:1。
优选地，所述步骤2的稀释比例为1:1-1.5:1。
综上所述，本发明的有益效果表现为：
本发明使用右旋糖酐、海藻糖、超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵配制的分离液时，操作者可以直接将细胞悬浮液铺设在分离液上，铺设过程无须过多考虑液面的破坏，对操作者的操作经验要求较低；本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高并具有较好的杀肿瘤活性；本发明的组合物可配成生理溶液状态的分离介质，对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀。
具体实施方式
为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
实施例一
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺1g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.15g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例二
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐5g，海藻糖2g，超低粘度海藻酸钠0.3g，泛影葡胺3g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例三
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.5g，海藻糖3.5g，超低粘度海藻酸钠0.4g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.15g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例四
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4.5g，海藻糖2.5g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺1.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例五
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，海藻糖3.3g，超低粘度海藻酸钠0.5g，泛影葡胺2.2g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.14g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例六
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4.2g，海藻糖2.8g，超低粘度海藻酸钠0.7g，泛影葡胺1.8g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例七
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4.5g，海藻糖3.4g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺1.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例八
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4g，海藻糖3g，超低粘度海藻酸钠0.7g，泛影葡胺2g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例一
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，羟乙基淀粉1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例二
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，超低粘度海藻酸钠1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例三
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的葡聚糖T500 20g，羟乙基淀粉2g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g和聚乙烯吡咯烷酮2.5g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例四
常规Ficoll 400分离液。
在上述实施例中，混合水溶液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。对比例一至四的混合水溶液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.065～1.090g/cm3，渗透压为275～320smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。可以将本发明配制的分离液贮藏于密闭的无菌玻璃或塑料容器内避光保存备用。
为了验证本发明实施例一至八制备的分离液对淋巴细胞的分离效果，按照如下步骤对血液样品进行分离：
步骤1：将本发明制备的分离液加入离心管，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2；
步骤2：将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心。
上述样品的来源可以为外周血、脐带血或骨髓。
同时按照上述分离方法对对比例一至四的分离液对血液淋巴细胞的分离效果进行验证。结果表明实施例一至八的淋巴细胞分离率均在95％以上，纯度在93％以上，细胞存活率达到98％以上，而对比例一至四的淋巴细胞分离率均在89％以下，纯度低于90％，细胞存活率低于90％，而对比例2比对比例1的淋巴细胞分离率低40％。
将分离收获的淋巴细胞接种于6孔板(美国CELLSTAR公司)上，通过典型的CIK细胞培养流程进行培养，培养持续14至28天。期间，对培养过程中的细胞增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标进行测试，结果表明，本发明实施例一至八分离而得的淋巴细胞，在经过典型的CIK细胞培养后，在增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标中明显优于对比例一至四，尤其是杀瘤活性测试中，本发明分离、培养获得的免疫细胞的杀瘤活性与对比例获得的免疫细胞相比至少提高了15％，实施例八的效果尤其显著，提高了18％。说明本发明用于分离淋巴细胞的分离液在分离淋巴细胞方面产生了意料不到的效果，是一种安全、有效的产品。
上述超低粘度海藻酸钠属低分子化合物，粘度较低，1％的水溶液的粘度与水接近，在医药领域具有降压、降脂的功效。
本发明使用右旋糖酐、海藻糖、超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵配制的分离液时，操作者可以直接将细胞悬浮液铺设在分离液上，铺设过程无须过多考虑液面的破坏，对操作者的操作经验要求较低；本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高并具有较好的杀肿瘤活性；本发明的组合物可配成生理溶液状态的分离介质，对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种分离淋巴细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将符合药用标准的右旋糖酐3～5重量份，海藻糖2～4重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～0.8重量份，泛影葡胺1～3重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1～0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过滤膜过滤除菌得到分离液；
步骤2：将所述分离液加入离心管中，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2；
步骤3：将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心；
所述样品的来源为外周血、脐带血或骨髓。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1为：将符合药用标准的右旋糖酐3.5～4.5重量份，海藻糖2.5～3.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.4～0.8重量份，泛影葡胺1.5～2.5重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12～0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1为：将符合药用标准的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸钠0.7重量份，泛影葡胺2重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。
4.根据权利要求1至3任一所述的分离方法，其特征在于，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1中的灭菌水为灭菌注射用水。
6.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述右旋糖酐为Dextran70。
7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1中的滤膜为灭菌的0.22μm滤膜。
8.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3的稀释比例为1:2-2:1。
9.根据权利要求8所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3的稀释比例为1:1-1.5:1。
CN201511031167.5A 2015-12-31 2015-12-31 分离淋巴细胞的分离方法 Expired - Fee Related CN105567632B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511031167.5A CN105567632B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 分离淋巴细胞的分离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511031167.5A CN105567632B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 分离淋巴细胞的分离方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105567632A CN105567632A (zh) 2016-05-11
CN105567632B true CN105567632B (zh) 2019-01-22

Family

ID=55878265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511031167.5A Expired - Fee Related CN105567632B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 分离淋巴细胞的分离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105567632B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106635985A (zh) * 2016-11-23 2017-05-10 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 一种结肠上皮间淋巴细胞的分离方法
CA3177475A1 (en) * 2017-01-11 2018-07-19 Cypher Medical, Llc Method of estimating blood volume

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001045503A3 (en) * 1999-12-10 2002-06-06 Univ Minnesota Cryopreservation compositions and methods for peripheral blood lymphocytes
CN101012449A (zh) * 2006-11-09 2007-08-08 深圳市达科为生物技术有限公司 淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法
CN102533650A (zh) * 2011-12-30 2012-07-04 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种细胞分离介质及细胞分离方法
CN102660504A (zh) * 2012-04-18 2012-09-12 高旭 一种淋巴细胞分离液的制备方法
CN102758259A (zh) * 2012-07-30 2012-10-31 济南赛尔生物科技有限公司 一种人外周血免疫细胞库的构建方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001045503A3 (en) * 1999-12-10 2002-06-06 Univ Minnesota Cryopreservation compositions and methods for peripheral blood lymphocytes
CN101012449A (zh) * 2006-11-09 2007-08-08 深圳市达科为生物技术有限公司 淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法
CN102533650A (zh) * 2011-12-30 2012-07-04 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种细胞分离介质及细胞分离方法
CN102660504A (zh) * 2012-04-18 2012-09-12 高旭 一种淋巴细胞分离液的制备方法
CN102758259A (zh) * 2012-07-30 2012-10-31 济南赛尔生物科技有限公司 一种人外周血免疫细胞库的构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105567632A (zh) 2016-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hoagland et al. Chitosan/pectin laminated films
Rous et al. A method for obtaining suspensions of living cells from the fixed tissues, and for the plating out of individual cells
CN105543168B (zh) 免疫细胞的储存及运输方法
US6268119B1 (en) Method for separating cells
US10760058B2 (en) Acellular biologic composition and method of manufacture
CN105462920B (zh) 从外周血提取免疫细胞的方法
US11160904B2 (en) Biological composition in a protectant shroud and methods
CN105567632B (zh) 分离淋巴细胞的分离方法
CN105532644B (zh) 淋巴细胞的冻存方法
CN107619827B (zh) 一种组合物及其制备方法与在全血游离dna保存领域的应用
TWI235764B (en) Method of extensive culture of antigen-specific cytotoxic T cells
CN105707058A (zh) 一种无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液配方及其制备方法
CN107410288B (zh) 一种人脐带间充质干细胞的储存液
CN105753991A (zh) 一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体及其应用
US11077147B2 (en) Acellular biologic composition and method of manufacture
Li et al. Ulvan and Ulva oligosaccharides: a systematic review of structure, preparation, biological activities and applications
CN105165805A (zh) 无蛋白液氮细胞冻存液及其制备方法
CN107880143A (zh) 一种铁皮石斛多糖及其抗心肌缺血再灌注的药物制备方面的新用途
CN102133399B (zh) 一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺
CN103881960A (zh) 一种赤水金钗石斛原生质体分离、纯化方法及专用试剂
CN105505868B (zh) 分离外周血免疫细胞的分离方法
US4744907A (en) Blood cell separation
CN105543167B (zh) 骨髓干细胞的保存及运输方法
CN106520805A (zh) 急性淋巴细胞白血病小鼠模型及建模方法
CN105505867B (zh) 用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 100085 B222 2 floor, room 5, development road, Haidian District, Beijing.

Applicant after: Beijing Hongrun Tianyuan gene Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 100085 Jintai fortune 9, No. 9 Anning West Road, Haidian District, Beijing

Applicant before: CELLONIS BIOTECHNOLOGIES CO., LTD.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190122

Termination date: 20191231

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee