CN101012449A

CN101012449A - 淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法

Info

Publication number: CN101012449A
Application number: CNA2006100635556A
Authority: CN
Inventors: 朱义鑫
Original assignee: SHENZHEN DAKEWE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shenzhen Dakewe Biological Engineering Co., Ltd.
Priority date: 2006-11-09
Filing date: 2006-11-09
Publication date: 2007-08-08
Anticipated expiration: 2026-11-09
Also published as: CN101012449B

Abstract

本发明公开了一种淋巴细胞分离液，所述分离液中包含重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。本发明还公开了采用上述分离液分离脾脏淋巴细胞的方法，该方法包括：将脾脏直接在分离液中研磨，制备成单细胞悬液，并将悬有脾脏细胞的分离液进行离心操作。本发明的分离液及方法无毒、便于操作且易于分离得到的状态好、活力高的淋巴细胞。

Description

淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种细胞分离液及细胞分离方法，特别是涉及一种淋巴细胞分离液以及分离脾脏淋巴细胞的方法。

背景技术

小鼠、大鼠是生物学与医学研究中最常用的实验动物。脾脏是这类动物最主要的淋巴细胞来源，如果研究涉及免疫学领域，通常需要分离小鼠或者大鼠的脾脏淋巴细胞。脾脏淋巴细胞通常采用密度梯度离心的方法。一直以来，传统的脾脏淋巴细胞分离采取三步法，即：研磨、铺细胞悬液和离心。先将小鼠脾脏在细胞培养基或者其它生理缓冲液中研磨(后面为了叙述方便，统一称为培养基)，使之分散成单细胞悬液；在离心管中加入普通的小鼠脾脏淋巴细胞分离液，然后小心翼翼的将脾细胞悬液铺在分离液界面之上，不能弄混界面；经过离心，脾脏淋巴细胞层出现在分离液与培养基的界面之间。和该方法配套的是普通的小鼠淋巴细胞分离液，比如天津市灏洋生物制品科技有限责任公司的LTS1092小鼠淋巴细胞分离液和挪威Axis-Shield公司的Mouse 1.077A分离液。

上述这种传统的方法有以下几点不足之处：

第一、传统的分离液对细胞有毒性，分得细胞的状态不好。

传统的淋巴细胞分离技术采用的是葡聚糖和泛影葡胺钠的混合物(Ficoll-Hypaque)。由于葡聚糖会影响淋巴细胞的表面蛋白活性，且分离液中含不通透的离子diatrizoate(泛影葡胺)，会影响离子通透膜的Gibbs-Donnan平衡。所以，传统的淋巴细胞分离液对细胞有毒性，分得细胞状态不好。

第二、步骤繁琐，技巧性较强，对实验者的经验要求高。

分离需要三步，尤其是第二步，要在高密度的分离液上小心翼翼的铺上低密度的细胞悬液而不能弄混界面。这是很困难的，需要实验者有足够的经验与耐心，费时费力，容易疲劳。一旦弄混界面，分离效果就会受影响，甚至分离不出淋巴细胞层。

第三、不能有效除去死细胞和细胞碎片，分得细胞活力差。

脾脏是通过机械研磨的方式分散成单个细胞的，不可避免地会有较多细胞受到机械损伤而死亡，甚至成为细胞碎片。由于研磨是在低密度的培养基中进行的，死细胞和细胞碎片内部渗入的也是低密度的培养基和缓冲液。它们的整体密度比培养基高，但是比高密度的分离液低。经过离心，死细胞和细胞碎片也会和活的淋巴细胞一样，聚集到分离液与培养基的界面之间。这样，离心结束之后，取淋巴细胞层的时候，就会将活细胞和死细胞以及细胞碎片一起取走。使得最终分得细胞活力差，夹杂有死细胞和细胞碎片。

第四、在死细胞和细胞碎片大量存在时，根本分不到淋巴细胞层。

分离的第一步，即研磨脾脏而获得脾细胞悬液，也是技巧性较强的一个步骤。有的实验者研磨手法温柔，产生的死细胞和细胞碎片较少；有的实验者研磨手法粗暴，会产生大量的死细胞和细胞碎片。对于前者，传统的分离方法不能有效除去死细胞和细胞碎片，但毕竟还能分离到淋巴细胞层；对于后者，传统的分离方法就根本不能分到淋巴细胞层。这是因为如果死细胞和细胞碎片大量存在，并且因扩散程度不同而密度也不均一，当它们集中到培养基与分离液界面时，会把原本清晰的界面弄混。一旦界面变得含混，密度相对均一的淋巴细胞也无法聚集成淋巴细胞层。最后导致的结果是，整支离心管没有清晰的液体分界面，也没有清晰的淋巴细胞层。

发明内容

本发明的目的就是为了针对现有技术的上述问题，提供一种无毒、便于操作且易于分离得到的状态好活力高的淋巴细胞的淋巴细胞分离液以及采用该种分离液分离脾脏淋巴细胞的方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种淋巴细胞分离液，所述分离液中包含重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。

所述淋巴细胞分离液的渗透压为230～310mOsm，内毒素含量小于1EU/mL，pH值为7.0～7.2。

优选的，所述淋巴细胞分离液还包含体积百分浓度为70.8～76.7％的RPMI1640培养基以及体积百分浓度为9.3～11.7％的超纯水。

进一步优选的，所述淋巴细胞分离液的密度为1.077～1.095g/mL。所述淋巴细胞分离液用于分离小鼠或大鼠的脾脏淋巴细胞。

本发明还公开了一种分离脾脏淋巴细胞的方法，所述方法包括步骤：将脾脏直接在上述淋巴细胞分离液中研磨，制备成单细胞悬液，并将悬有脾脏细胞的分离液进行离心操作。

所述方法优选用于分离小鼠或大鼠的脾脏淋巴细胞。

所述离心操作时，离心力为600～1000g，优选为800g，离心时间为15～60分钟，优选为30分钟。

优选的，将悬有脾脏细胞的分离液进行离心操作前，在细胞悬液上覆盖适量RPMI1640培养基、缓冲液或生理盐水。

由于采用了以上的方案，使本发明具备的有益效果在于：

由于本发明的分离液采用完全无生物毒性的碘化物碘克沙醇(Iodixanol)，不含有具生物毒性的葡聚糖及泛影葡胺钠，因此彻底解决了分离液的毒性问题；同时由于不带毒性，从而采用本发明的分离液进行脾脏细胞分离时，可以将脾脏在分离液中直接进行研磨，且研磨成的单细胞悬液可以直接转移到离心管内离心，这样避免了传统方法中必须在高密度分离液的界面上小心翼翼铺低密度细胞悬液这一技巧性极强、对实验者经验要求高的步骤，大大简化了淋巴细胞的分离过程，极大地提高了分离的成功率；并且采用本发明的分离液及分离方法进行淋巴细胞分离时，能够有效除去死细胞和细胞碎片，使得分离的淋巴细胞状态好，活力高；即使研磨过程中产生了大量的死细胞和细胞碎片，也对淋巴细胞聚层没有影响，聚层内不含死细胞和细胞碎片，彻底解决了传统方法中的两大技术难题。

具体实施方式

本发明的淋巴细胞分离液，包含有重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。碘克沙醇是本发明的分离液的关键成分，是一种安全无生物毒性的碘化物，分子式为C₃₅H₄₄I₆N₆O₁₅，分子量1550.18，学名为5，5′-((2-羟基-1，3-丙二基)-双(乙酰基氨基))-双(N，N′-双(2，3-二羟基丙基)-2，4，6-三碘-1，3-苯二甲酰胺)，结构式如下：

本发明的淋巴细胞分离液，碘克沙醇的重量体积百分浓度为14.0～17.5％，在该比例范围内，能够形成分离淋巴细胞所需的特定分离液密度。本发明的淋巴细胞分离液，渗透压为230～310mOsm，内毒素含量小于1EU/mL，pH值为7.0～7.2。

除了关键成分碘克沙醇外，分离液中通常还含有细胞培养基、生理缓冲溶液或生理盐水，以使渗透压等参数达到上述要求。细胞培养基优选用RPMI1640培养基。这种培养基是本领域技术人员所熟知的最常用于培养淋巴细胞的培养基，目前已有多种商业获得途径，例如：HyClone或者Invitrogen公司的提供的RPMI1640液体(500mL/瓶)或者粉剂(每包可以配制1000mL培养基)。本发明优选使用以下配方的RPMl1640培养基：

分类	成分名称	浓度mg/L
分类	成分名称	浓度mg/L	氨基酸	L-精氨酸HClL-天冬酰胺酸L-天门冬氨酸L-胱氨酸2HClL-谷氨酸L-谷氨酰胺甘氨酸L-组氨酸FB L-羟脯氨酸L-异亮氨酸L-亮氨酸L-赖氨酸HClL-甲硫氨酸L-苯基丙氨酸L-脯氨酸L-丝氨酸L-苏氨酸L-色氨酸L-酪氨酸2Na·2H₂OL-缬氨酸	200.000050.000020.000065.150020.0000300.000010.000015.000020.000050.000050.000040.000015.000015.O00020.000030.000020.00005.000028.830020.0000
无机盐	CafNO₃)₂·4H₂OKClMgSO₄(无水)NaClNa₂HPO₄(无水)	100.0000400.000048.84006000.0000800.0000	氨基酸
无机盐	CafNO₃)₂·4H₂OKClMgSO₄(无水)NaClNa₂HPO₄(无水)	100.0000400.000048.84006000.0000800.0000	维生素	d-BiotinD-Ca Pantothenate氯化胆碱叶酸肌醇烟酰胺维生素B6 HCl维生素B2维生素B1 HCl维生素B12	0.20000.25003.00001.000035.00001.00001.00000.20001.00000.0050
其它	D-葡萄糖对氨基苯甲酸(PABA)谷胱甘肽(还原型)酚红(钠)HEPES	2000.00001.00001.00005.30000.0000	维生素
其它	D-葡萄糖对氨基苯甲酸(PABA)谷胱甘肽(还原型)酚红(钠)HEPES	2000.00001.00001.00005.30000.0000	附加盐	NaHCO₃	2000.0000

本发明的淋巴细胞分离液具体可以按照以下配方进行配制：

Iodixanol 14.0～17.5％(w/v)

RPMI1640培养基 70.8～76.7％(v/v)

超纯水 9.3～11.7％(v/v)

根据以上配方制得的分离液，能够满足渗透压、内毒素含量以及pH值的要求，并且，所得到的分离液密度为1.077～1.095g/mL(20℃)。在该密度范围内的分离液，适于分离大鼠或小鼠脾脏淋巴细胞，离心分离时红细胞及其它细胞和死细胞碎片会沉淀至管底，而淋巴细胞则由于密度较低，会聚集在分离液上层形成淋巴细胞层。由于大鼠和小鼠在免疫学领域应用的广泛性，并且脾脏是这类动物最主要的淋巴细胞来源，因此本发明的淋巴细胞分离液最常用于分离大鼠和小鼠的脾脏淋巴细胞。在实际应用中，本发明的分离液通过细微调整Iodixanol的含量从而使分离液密度介于被分离材料的淋巴细胞密度与杂细胞密度之间的话，也可用于分离其他物种的脾脏或其他器官及组织内的淋巴细胞，同时通过调整纯水的含量，使得分离液的渗透压与所分离种属淋巴细胞的渗透压相等。

另外，本发明的分离液也可用于分离血液中的淋巴细胞。当用于分离血液淋巴细胞时，可以像使用普通血液淋巴细胞分离液一样，在分离液界面上小心铺上经过稀释(如1倍稀释)或未经稀释的全血，并离心，之后云雾状的淋巴细胞层即出现在界面之间。

利用本发明的淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞时，由于不含生物毒性，可以将脾脏直接在分离液中研磨，研磨完后的细胞悬液直接转移到离心管内离心即可，取消了传统方法中铺细胞悬液到分离液界面之上的步骤，方法大大简化。

在本发明的方法中，死细胞和细胞碎片在研磨的过程中始终就被密度较高的分离液包围。分离液很快扩散到死细胞和细胞碎片内部，使得它们的整体密度大于分离液的密度(细胞碎片骨架蛋白的密度为1.1-1.2g/mL)。因此离心时，死细胞和细胞碎片下沉；有活力的淋巴细胞由于密度低于分离液的密度而上浮(小鼠、大鼠脾脏淋巴细胞的密度约为1.070g/mL)。因此，该方案能有效地除去死细胞和细胞碎片，分得细胞状态好，活力高。特别说明的是：活细胞上浮，死细胞和细胞碎片下沉，二者的运动方向相反，根本没有纠缠在一起的机会。即便死细胞和细胞碎片再多，也对淋巴细胞上浮和聚层没有影响。

在本发明的分离方法中，进行离心操作时，离心力为通常为600～1000g，优选为800g，离心时间为15～60分钟，优选为30分钟。

在本发明优选的实施方案中，将悬有脾脏细胞的分离液进行离心操作前，在细胞悬液上覆盖适量的RPMI1640培养基。进行该操作有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，也有利于下一步吸取淋巴细胞。所加入的培养基的量没有特定的要求，也不需太多，通常添加0.5-1.0ml左右即可。也可以用其它缓冲液或生理盐水代替。

离心后，淋巴细胞会在分离液与RPMI1640覆盖层之间的界面聚集成淋巴细胞层，这时可将淋巴细胞吸出，并加入适量1640培养基洗涤一次，然后在250g离心10分钟，之后倾倒上清液，再加入适量1640培养基重悬后用于后一步处理。

下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1

一种淋巴细胞分离液，其组成为：

Iodixanol 14％(w/v)

RPMI1640培养基 76.7％(v/v)

超纯水 9.3％(v/v)

该分离液：

密度 1.077g/mL(20℃)；

渗透压 230mOsm；

内毒素＜1EU/mL；

pH值 7.0-7.2(20℃)

利用该淋巴细胞分离液进行小鼠脾脏淋巴细胞的分离。

实验方法：

断颈处死小鼠，浸入75％的乙醇中浸泡1-2分钟。在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。

将小鼠脾脏直接在3-5mL的上述淋巴细胞分离液中研磨，制备成单细胞悬液。

把悬有脾脏细胞的分离液转移到离心管中。在细胞悬液上覆盖上大约1mL的1640培养基。

800g离心30分钟。淋巴细胞会漂浮上来聚集成层。

吸出淋巴细胞层，加入10mL 1640培养基洗涤一次，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL培养基重悬。

实施例2

一种淋巴细胞分离液，其组成为：

Iodixanol 15.5％(w/v)

RPMI1640培养基 74.2％(v/v)

超纯水 10.3％(v/v)

该分离液：

密度 1.084g/mL(20℃)；

渗透压 270mOsm；

内毒素＜1EU/mL；

pH值 7.0-7.2(20℃)

利用该淋巴细胞分离液采用与实施例1相同的实验方法进行小鼠脾脏淋巴细胞的分离。

实施例3

一种淋巴细胞分离液，其组成为：

Iodixanol 17.5％(w/v)

RPMI1640培养基 70.8％(v/v)

超纯水 11.7％(v/v)

该分离液：

密度 1.095g/mL(20℃)；

渗透压 310mOsm；

内毒素＜1EU/mL；

pH值 7.0-7.2(20℃)

实验例

淋巴细胞得率

将采用本发明的淋巴细胞分离液与分离方法分离小鼠脾脏淋巴细胞的获得率与传统分离方法的获得率作对比。实验使用同一品系、相同周龄的NIH小鼠，随机分成四组，每组6只。用实施例1～3的分离液及分离方法与传统分离液及分离方法分别分离每一只小鼠的脾脏淋巴细胞。

传统分离方法使用挪威Axis-Shield公司的小鼠淋巴细胞分离液Lympho-Prep 1.077A，该分离液在国内使用较多。具体的分离方法是：先将小鼠脾脏在细胞培养基(RPMI1640培养基)中研磨，使之分散成单细胞悬液；在离心管中加入Lympho-Prep 1.077A分离液，然后小心翼翼的将脾细胞悬液铺在分离液界面之上，不能弄混界面；800g离心30分钟，脾脏淋巴细胞层出现在分离液与培养基的界面之间。

具体的实验结果数据见表一(表一中每组实验重复六次，取平均值，即随机各取6只相同品系，相同大小的小鼠进行实验。)

表一：本发明方法与传统方法分离小鼠脾脏淋巴细胞得率比较

方法	实施例1	实施例2	实施例3	传统方法
方法	实施例1	实施例2	实施例3	传统方法	平均淋巴细胞得率	7.1×10⁷个/只小鼠	1.2×10⁸个/只小鼠	8.2×10⁷个/只小鼠	5.3×10⁷个/只小鼠

结果表明，使用本发明的分离液及分离方法分得的小鼠脾脏淋巴细胞与传统分离方法获得的淋巴细胞在数量上有显著差别，本发明的分离系统分得细胞更多。

细胞活力

分得细胞不仅要求得率高，而且要求活力强。

我们采用台盼蓝活细胞计数的方法比较了上述分得细胞的活力。实验重复六次，取平均值。细胞存活率见表二(结合表一的实验进行，重复六次，取平均值)。

表二：本发明方法与传统方法分离小鼠脾脏淋巴细胞存活率

方法	实施例1	实施例2	实施例3	传统方法
方法	实施例1	实施例2	实施例3	传统方法	平均存活率	97.4％	95.9％	96.6％	88.7％

结果表明，使用本发明的淋巴细胞分离系统分得的小鼠脾脏淋巴细胞与传统分离方法获得的淋巴细胞在存活率上有显著差别，本发明的淋巴细胞分离系统分得细胞状态更好，活力更高。

Claims

1、一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述分离液中包含重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。

2、根据权利要求1所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液的渗透压为230～310mOsm，内毒素含量小于1EU/mL，pH值为7.0～7.2。

3、根据权利要求2所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液还包含体积百分浓度为70.8～76.7％的RPMI1640培养基以及体积百分浓度为9.3～11.7％的超纯水。

4、根据权利要求2或3所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液的密度为1.077～1.095g/mL。

5、根据权利要求4所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液用于分离小鼠或大鼠的脾脏淋巴细胞。

6、一种分离脾脏淋巴细胞的方法，所述方法包括步骤：将脾脏直接在淋巴细胞分离液中研磨，制备成单细胞悬液，并将悬有脾脏细胞的分离液进行离心操作，所述淋巴细胞分离液为权利要求1～3中任意一项所述的淋巴细胞分离液。

7、根据权利要求6所述的一种分离脾脏淋巴细胞的方法，其特征在于：所述淋巴细胞分离液的密度为1.077～1.095g/mL，所述脾脏为小鼠或大鼠的脾脏。

8、根据权利要求6或7所述的一种分离脾脏淋巴细胞的方法，其特征在于：所述离心操作时，离心力为600～1000g，离心时间为15～60分钟。

9、根据权利要求8所述的一种分离脾脏淋巴细胞的方法，其特征在于：将悬有脾脏细胞的分离液进行离心操作前，在细胞悬液上覆盖适量RPMI1640培养基、缓冲液或生理盐水。