CN105505867B - 用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液，属于生物技术领域。本发明的用于分离单个细胞的组合物，由以下原料按重量份组成：右旋糖酐1～4份，海藻糖4～6份，超低粘度海藻酸钠0.3～1.5份，泛影葡胺4～7份，L‑甲硫氨酸0.003‑0.006份,L‑缬氨酸0.008‑0.011份和L‑亮氨酸0.01‑0.012份。本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高，并且分离后的淋巴细胞具有较好的杀肿瘤活性。

Description

用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液。
背景技术
密度梯度离心法(Density Gradient Centrifugation)作为一种传统的分离技术，用于细胞分离已经存在了半个世纪。基于密度梯度离心法的细胞分离介质产品即细胞治疗辅料，将待分离的血液样品平铺于分离介质上，接着对其在恒定温度下进行低速离心。样品中各细胞群将由于密度差异分布在离心管的不同部位，例如，如果分离介质具有与目标细胞群相同的密度，目标细胞将富集在分离介质层与样本层的交界面，用吸管将该层细胞吸出就达到了对目标细胞群的分离。
淋巴细胞作为一种效应细胞，广泛存在于人外周血液、骨髓或人脐带血中。高纯度的淋巴细胞的获取对于疾病的细胞学诊断、成分输血、治疗用细胞产品的制备等具有非常重要的意义。淋巴细胞分离介质是具有恒定密度、渗透压及pH值的混合体系。
目前，商品化的淋巴细胞分离介质以Ficoll 400(聚蔗糖400)和泛影酸钠为主要成分，密度在1.073g/cm3和1.084g/cm3之间，渗透压在280mOsmol/kg和310mOsmol/kg之间，pH在6和9之间。为了提高产品的技术标准以适应细胞治疗特殊行业要求，目前很多研究者都在试图改进分离介质的组成以用于临床治疗用途。
除法规因素外，产品特性不明确是限制其临床使用的另一个重要因素。在淋巴细胞的工业化生产过程中，细胞分离介质是仅次于培养基外，与细胞接触时间最久的外源物质。在标准的分离过程中，细胞必须与分离液接触15-45分钟的时间，以达到最佳分离效果。在这段时间内，分离液中各组分可能通过被动扩散、细胞的主动运输、胞吞/胞饮作用、表面黏附等途径，在细胞内部蓄积，且此部分蓄积成分，很难通过常规的洗涤从分离得到的目标细胞(例如淋巴细胞)中完全去除。尽管常规理化指标及菌落、内毒素等生化指标外已达到较高标准，但原料组分的不确定性给细胞分离介质的临床应用带来了极大的障碍。例如，Ficoll 400并无临床应用，其毒理学、药物代谢动力学特性均没有相关数据支撑。Ficoll400在分离中不表现出对细胞的毒性，但化学品安全说明书(MSDS)中的数据显示，慢毒试验中Ficoll 400表现出一定毒性，包括恶心、呕吐、头痛甚至昏迷，皮肤严重红肿、水肿等。
曾有研究者使用右旋糖酐代替Ficoll 400，提高了一定的安全性，并使用羟乙基淀粉提高分离效率。虽然羟乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch)是复方制剂，但长期大剂量使用羟乙基淀粉，患者会出现皮肤瘙痒。严重肝脏疾病或严重凝血功能紊乱的病人应慎用。使羟乙基淀粉在临床中的应用受到限制。
因此，有必要提供一种既能保证安全性又能保证分离效率、纯度的淋巴细胞分离液。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种既能保证安全性又能保证分离效率、纯度的价格便宜的用于分离淋巴细胞的分离液及其分离方法。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，提供一种用于分离淋巴细胞的组合物，由以下原料按重量份组成：
所述右旋糖酐与海藻糖的比例范围为1:1～1:4，优选为1:2。
本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高，并且分离后的淋巴细胞具有较好的杀肿瘤活性；本发明的组合物可配成生理溶液状态的分离介质，对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助。
进一步地，所述组合物由以下原料按重量份组成：
进一步地，所述组合物由以下原料按重量份组成：
进一步地，所述组合物，由以下原料按重量份组成：
优选地，所述右旋糖酐为Dextran70。
Dextran70的斯托克斯半径为5.8nm，临床常用的制剂为6％中分子右旋糖酐含0.9％氯化钠制剂，平均分子量为70kD(60kD～100kD)，分子量最接近血浆蛋白的重量。其分子的大小范围较广，排出复杂，在血管内半衰期约6～8h。它能从组织中吸收水分，适用于补充血容量，6％右旋糖酐500ml可增加血浆容量450～500ml，其扩容作用可持续4h(5～7h)。临床上主要用于防治低血容量性休克，失血量在总血容量20％以内者可全部用右旋糖酐作补充，不需输血。
优选地，所述单个细胞为单核细胞或淋巴细胞。
另一方面，提供一种用于分离淋巴细胞的分离液，含有权利要求1-5任一所述的组合物和水，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
进一步地，所述分离液为无菌状态。
再一方面，提供一种分离样品细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1：将上述的分离液加入离心管，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2；
步骤2：将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心。
进一步地，所述步骤2的稀释比例为1:2-2:1。
优选地，所述步骤2的稀释比例为1:1-1.5:1。
综上所述，本发明的有益效果表现为：
本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高，并且分离后的淋巴细胞具有较好的杀肿瘤活性；本发明的组合物可配成生理溶液状态的分离介质，对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助。
具体实施方式
为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
实施例一
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐1g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸钠1.5g，泛影葡胺4g，L-甲硫氨酸0.006g，L-缬氨酸0.008g和L-亮氨酸0.01g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例二
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4g，海藻糖6g，超低粘度海藻酸钠0.3g，泛影葡胺7g，L-甲硫氨酸0.003g，L-缬氨酸0.011g和L-亮氨酸0.012g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例三
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐1.5g，海藻糖5.5g，超低粘度海藻酸钠1g，泛影葡胺6g，L-甲硫氨酸0.004g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.01g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例四
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.5g，海藻糖4.5g，超低粘度海藻酸钠0.3g，泛影葡胺4g，L-甲硫氨酸0.005g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.012g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例五
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2g，海藻糖5.2g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺5g，L-甲硫氨酸0.004g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.01g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例六
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3g，海藻糖4.8g，超低粘度海藻酸钠0.4g，泛影葡胺4g，L-甲硫氨酸0.005g，L-缬氨酸0.01g和L-亮氨酸0.012g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例七
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸钠0.6g，泛影葡胺4.5g，L-甲硫氨酸0.005g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.011g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例八
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.5g，海藻糖5g，超低粘度海藻酸钠0.6g，泛影葡胺4.5g，L-甲硫氨酸0.005g，L-缬氨酸0.01g和L-亮氨酸0.011g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例一
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，羟乙基淀粉1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例二
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，超低粘度海藻酸钠1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例三
在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的葡聚糖T50020g，羟乙基淀粉2g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g和聚乙烯吡咯烷酮2.5g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例四
常规Ficoll 400分离液。
在上述实施例中，混合水溶液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。对比例一至四的混合水溶液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.065～1.090g/cm3，渗透压为275～320smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。可以将本发明配制的分离液贮藏于密闭的无菌玻璃或塑料容器内避光保存备用。
为了验证本发明实施例一至八制备的分离液对淋巴细胞的分离效果，按照如下步骤对血液样品进行分离：
步骤1：将本发明制备的分离液加入离心管，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2；
步骤2：将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心。
同时按照上述分离方法对对比例一至四的分离液对血液淋巴细胞的分离效果进行验证。结果表明实施例一至八的淋巴细胞分离率均在95％以上，纯度在93％以上，细胞存活率达到98％以上，而对比例一至四的淋巴细胞分离率均在89％以下，纯度低于90％，细胞存活率低于90％，而对比例2比对比例1的淋巴细胞分离率低40％。
将分离收获的淋巴细胞接种于6孔板(美国CELLSTAR公司)上，通过典型的CIK细胞培养流程进行培养，培养持续14至28天。期间，对培养过程中的细胞增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标进行测试，结果表明，本发明实施例一至八分离而得的淋巴细胞，在经过典型的CIK细胞培养后，在增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标中明显优于对比例一至四，尤其是杀瘤活性测试中，本发明分离、培养获得的免疫细胞的杀瘤活性与对比例获得的免疫细胞相比至少提高了15％，实施例八的效果尤其显著，提高了20％。
上述超低粘度海藻酸钠属低分子化合物，粘度较低，1％的水溶液的粘度与水接近，在医药领域具有降压、降脂的功效。
本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高，并且分离后的淋巴细胞具有较好的杀肿瘤活性；本发明的组合物可配成生理溶液状态的分离介质，对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于分离淋巴细胞的组合物，其特征在于，由以下原料按重量份组成：
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，由以下原料按重量份组成：
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，由以下原料按重量份组成：
4.根据权利要求1至3任一所述的组合物，其特征在于，所述右旋糖酐为Dextran70。
5.一种用于分离淋巴细胞的分离液，其特征在于，含有权利要求1-4任一所述的组合物和水，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
6.根据权利要求5所述的用于分离淋巴细胞的分离液，其特征在于，所述分离液为无菌状态。
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