CN105543168B - 免疫细胞的储存及运输方法 - Google Patents

免疫细胞的储存及运输方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105543168B
CN105543168B CN201511031752.5A CN201511031752A CN105543168B CN 105543168 B CN105543168 B CN 105543168B CN 201511031752 A CN201511031752 A CN 201511031752A CN 105543168 B CN105543168 B CN 105543168B
Authority
CN
China
Prior art keywords
weight
parts
cell
liquid
lymphocyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201511031752.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105543168A (zh
Inventor
宫喜魁
李若鲲
马艳
马艳玲
郝丽敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Hongrun Tianyuan Gene Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Hongrun Tianyuan Gene Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Hongrun Tianyuan Gene Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Hongrun Tianyuan Gene Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201511031752.5A priority Critical patent/CN105543168B/zh
Publication of CN105543168A publication Critical patent/CN105543168A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105543168B publication Critical patent/CN105543168B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种免疫细胞的储存及运输方法，属于生物技术领域。本发明包括如下步骤：采集外周血或脐带血，稀释，获得细胞悬液；将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；将所述淋巴细胞与冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；冻存；复苏后将液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，离心；在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中；移入无菌管或转运袋中转运。本发明从分离到冻存再到保存运输均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高。

Description

免疫细胞的储存及运输方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种免疫细胞的储存及运输方法。
背景技术
免疫细胞不仅在治疗癌症方面有较好的前景，而且从健康养生的角度来看，也可以在患者本人健康时提取从其外周血中提取免疫细胞，并在以后患者本人出现免疫低下或其他症状时，可以将存储的免疫细胞回输给患者本人，提高患者的免疫力。免疫细胞的研究和临床应用是一个多学科、多单位、多部门共同协调完成的一项重大复杂工作，需要有独立的细胞制备单位提供细胞，独立的细胞移植单位进行细胞移植，并且细胞制备单位和细胞移植单位之间有一定的空间距离，要使细胞制备单位和细胞移植单位在工作中充分衔接，使细胞移植达到最佳的效能，就要有能达到标准的规范的细胞储存运输流程，需要储存运输的原始免疫细胞在储存、转运、细胞等方面都有着非常严格的要求，目前在免疫细胞的储存运输方面还没有形成统一的规范流程。从而使免疫细胞在分离、冻存、复苏、运输过程中，会对单个细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险；而分离细胞的分离率、纯度等对免疫细胞的应用也有极大的影响。
现有技术中，常规的Ficoll 400分离液对细胞具有一定的毒性，不利于临床应用，而细胞冻存复苏后的存活率通常在70％-90％之间。细胞冻存复苏后的存活率可能会受到细胞采集、分离、冻存等过程的影响。因此，为提供足够量的淋巴细胞，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。
因此，有必要提供一种能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、减少运输过程中的损伤和提高回输到患者的细胞的安全性的储存及运输方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、减少运输过程中的损伤和提高回输到患者的细胞的免疫细胞的安全性的免疫细胞的储存及运输方法。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，提供一种免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将所述淋巴细胞与含有12％DMSO+18％所述上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将所述冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
本发明从分离到冻存再到保存运输均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高；本发明的分离液采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助；本发明的分离液对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明使用自体血浆作为冻存液的一部分，右旋糖酐作为替代血浆，减少免疫反应，使用DMSO、海藻糖降低低温对细胞的伤害，而且分离液的组分与冻存液组分部分接近，进一步减少外源物质对细胞的伤害，提高安全性；本发明在保存液中加入2％的海藻糖进一步保护细胞，使细胞在运输过程中保持活性。
进一步地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1～4重量份，海藻糖4～6重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～1.5重量份，泛影葡胺4～7重量份，L-甲硫氨酸0.003-0.006重量份，L-缬氨酸0.008-0.011重量份和L-亮氨酸0.01-0.012重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
本发明的分离液采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
进一步地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1.5～3.5重量份，海藻糖4.5～5.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～1重量份，泛影葡胺4～6重量份，L-甲硫氨酸0.004-0.005重量份，L-缬氨酸0.009-0.01重量份和L-亮氨酸0.01-0.012重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
优选地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2.5重量份，海藻糖5重量份，超低粘度海藻酸钠0.6重量份，泛影葡胺4.5重量份，L-甲硫氨酸0.005重量份，L-缬氨酸0.01重量份和L-亮氨酸0.011份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
进一步地，所述右旋糖酐为Dextran70。
进一步地，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
综上所述，本发明的有益效果表现为：
本发明从分离到冻存再到保存运输均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高；本发明的分离液采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果；本发明的分离液对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明使用自体血浆作为冻存液的一部分，右旋糖酐作为替代血浆，减少免疫反应，使用DMSO、海藻糖降低低温对细胞的伤害，而且分离液的组分与冻存液组分部分接近，进一步减少外源物质对细胞的伤害，提高安全性；本发明在保存液中加入2％的海藻糖进一步保护细胞，使细胞在运输过程中保持活性。
具体实施方式
为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
实施例一
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐1g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸钠1.5g，泛影葡胺4g，L-甲硫氨酸0.006g，L-缬氨酸0.008g和L-亮氨酸0.01g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例二
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4g，海藻糖6g，超低粘度海藻酸钠0.3g，泛影葡胺7g，L-甲硫氨酸0.003g，L-缬氨酸0.011g和L-亮氨酸0.012g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例三
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐1.5g，海藻糖5.5g，超低粘度海藻酸钠1g，泛影葡胺6g，L-甲硫氨酸0.004g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.01g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例四
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.5g，海藻糖4.5g，超低粘度海藻酸钠0.3g，泛影葡胺4g，L-甲硫氨酸0.005g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.012g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例五
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2g，海藻糖5.2g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺5g，L-甲硫氨酸0.004g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.01g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例六
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3g，海藻糖4.8g，超低粘度海藻酸钠0.4g，泛影葡胺4g，L-甲硫氨酸0.005g，L-缬氨酸0.01g和L-亮氨酸0.012g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例七
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸钠0.6g，泛影葡胺4.5g，L-甲硫氨酸0.005g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.011g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例八
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.5g，海藻糖5g，超低粘度海藻酸钠0.6g，泛影葡胺4.5g，L-甲硫氨酸0.005g，L-缬氨酸0.01g和L-亮氨酸0.011g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例一
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％甘油+65％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，羟乙基淀粉1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例二
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％甘油+65％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，超低粘度海藻酸钠1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例三
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％甘油+65％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的葡聚糖T50020g，羟乙基淀粉2g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g和聚乙烯吡咯烷酮2.5g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例四
免疫细胞的储存及运输方法，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将常规Ficoll 400分离液加入到离心管中，所述细胞悬液细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将淋巴细胞与含有12％DMSO+18％上层血浆+5％甘油+65％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位。
在上述实施例中，分离液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。对比例一至四的分离液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.065～1.090g/cm3，渗透压为275～320smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。可以将本发明配制的分离液贮藏于密闭的无菌玻璃或塑料容器内避光保存备用。
为了验证本发明的复苏后运输18h的免疫细胞的存活率，取少量细胞检测免疫细胞的存活率，结果表明实施例一至八的免疫细胞存活率均在95％以上，纯度在93％以上，而对比例一至四的免疫细胞存活率均在82％以下，纯度低于90％。而分离过程中实施例一至八的免疫细胞分离率95％以上，对比例一至四的免疫细胞分离率均在87％以下，而对比例2比对比例1的淋巴细胞分离率低40％。
将复苏后运输18h的淋巴细胞接种于6孔板(美国CELLSTAR公司)上，通过典型的CIK细胞培养流程进行培养，培养持续14至28天。期间，对培养过程中的细胞增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标进行测试，结果表明，本发明实施例一至八复苏后运输18h的淋巴细胞，在经过典型的CIK细胞培养后，在增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标中明显优于对比例一至四，尤其是杀瘤活性测试中，本发明复苏后运输18h的免疫细胞的杀瘤活性与对比例获得的免疫细胞相比至少提高了15％，实施例八的效果尤其显著，提高了20％。
上述超低粘度海藻酸钠属低分子化合物，粘度较低，1％的水溶液的粘度与水接近，在医药领域具有降压、降脂的功效；上述保存液为市售保存液。
本发明从分离到冻存再到保存运输均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高；本发明的分离液采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-缬氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果；本发明的分离液对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明使用自体血浆作为冻存液的一部分，右旋糖酐作为替代血浆，减少免疫反应，使用DMSO、海藻糖降低低温对细胞的伤害，而且分离液的组分与冻存液组分部分接近，进一步减少外源物质对细胞的伤害，提高安全性；本发明在保存液中加入2％的海藻糖进一步保护细胞，使细胞在运输过程中保持活性。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种免疫细胞的储存及运输方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)采集外周血或脐带血，加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释，获得细胞悬液；
2)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和氨基酸的分离液加入到离心管中，所述细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)将所述淋巴细胞与含有12％DMSO+18％所述上层血浆+5％海藻糖+5％甘油+60％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将所述冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
4)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有4～8℃生理盐水的离心管中，混匀，细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml，4-8℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集淋巴细胞；
5)在淋巴细胞中加入含有2％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查淋巴细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于24小时内运输至使用单位；
其中，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1～4重量份，海藻糖4～6重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～1.5重量份，泛影葡胺4～7重量份，L-甲硫氨酸0.003-0.006重量份，L-缬氨酸0.008-0.011重量份和L-亮氨酸0.01-0.012重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
2.根据权利要求1所述的储存及运输方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1.5～3.5重量份，海藻糖4.5～5.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～1重量份，泛影葡胺4～6重量份，L-甲硫氨酸0.004-0.005重量份，L-缬氨酸0.009-0.01重量份和L-亮氨酸0.01-0.012重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
3.根据权利要求2所述的储存及运输方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2.5重量份，海藻糖5重量份，超低粘度海藻酸钠0.6重量份，泛影葡胺4.5重量份，L-甲硫氨酸0.005重量份，L-缬氨酸0.01重量份和L-亮氨酸0.011份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
4.根据权利要求1至3任一所述的储存及运输方法，其特征在于，所述右旋糖酐为Dextran70。
5.根据权利要求4所述的储存及运输方法，其特征在于，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
CN201511031752.5A 2015-12-31 2015-12-31 免疫细胞的储存及运输方法 Expired - Fee Related CN105543168B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511031752.5A CN105543168B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 免疫细胞的储存及运输方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511031752.5A CN105543168B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 免疫细胞的储存及运输方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105543168A CN105543168A (zh) 2016-05-04
CN105543168B true CN105543168B (zh) 2019-01-22

Family

ID=55822726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511031752.5A Expired - Fee Related CN105543168B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 免疫细胞的储存及运输方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105543168B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105900973B (zh) * 2016-05-20 2018-11-30 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种巨噬细胞冻存液及冻存方法
CN106818710A (zh) * 2017-02-10 2017-06-13 深圳市合康生物科技股份有限公司 一种细胞冻存液及其制备方法和应用
CN108477143A (zh) * 2018-03-27 2018-09-04 福建三造血技术有限公司 一种细胞运输用保持液及运输方法
CN111449053A (zh) * 2020-05-19 2020-07-28 河南茵特赛尔生物技术有限公司 一种免疫细胞储存液及其制备与应用方法
CN114158549B (zh) * 2020-09-10 2023-10-03 上海原天生物科技有限公司 一种免疫细胞的置核冻存方法
CN112167243B (zh) * 2020-10-14 2023-03-10 中国科学技术大学 红细胞冻存液及快速冻存方法
CN113100227B (zh) * 2021-03-31 2022-07-15 北京益华生物科技有限公司 一种可直接输入人体的nk细胞运输液及其制备方法和应用
CN115053891A (zh) * 2022-07-11 2022-09-16 广州星望医疗科技有限公司 一种细胞冻存液及实施方法
CN115644168B (zh) * 2022-11-09 2024-03-01 湖南开启时代生物科技有限责任公司 一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH057489A (ja) * 1991-07-02 1993-01-19 Nichirei Corp 動物細胞の凍結保存用血清不含培地及び保存方法
WO2001045503A2 (en) * 1999-12-10 2001-06-28 Regents Of The University Of Minnesota Cryopreservation compositions and methods for peripheral blood lymphocytes
CN102533650A (zh) * 2011-12-30 2012-07-04 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种细胞分离介质及细胞分离方法
CN102660504A (zh) * 2012-04-18 2012-09-12 高旭 一种淋巴细胞分离液的制备方法
CN102758259A (zh) * 2012-07-30 2012-10-31 济南赛尔生物科技有限公司 一种人外周血免疫细胞库的构建方法
CN103966162A (zh) * 2014-05-29 2014-08-06 成都清科生物科技有限公司 一种新型经血来源间充质干细胞分离方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH057489A (ja) * 1991-07-02 1993-01-19 Nichirei Corp 動物細胞の凍結保存用血清不含培地及び保存方法
WO2001045503A2 (en) * 1999-12-10 2001-06-28 Regents Of The University Of Minnesota Cryopreservation compositions and methods for peripheral blood lymphocytes
CN102533650A (zh) * 2011-12-30 2012-07-04 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种细胞分离介质及细胞分离方法
CN102660504A (zh) * 2012-04-18 2012-09-12 高旭 一种淋巴细胞分离液的制备方法
CN102758259A (zh) * 2012-07-30 2012-10-31 济南赛尔生物科技有限公司 一种人外周血免疫细胞库的构建方法
CN103966162A (zh) * 2014-05-29 2014-08-06 成都清科生物科技有限公司 一种新型经血来源间充质干细胞分离方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Definition of optimal conditions for collection and cryopreservation of umbilical cord hematopoietic cells;Campos L 等;《Cryobiology》;19951231;第32卷(第6期);第511-515页
二甲基亚砜和右旋糖酐对脐血造血细胞的低温保护作用;许遵鹏 等;《临床血液学杂志》;20001115;第13卷(第6期);第246-248页
海藻糖用于血细胞冻干保存中的研究进展;陈燕 等;《中国实验血液学杂志》;20060430;第14卷(第2期);第416-418页

Also Published As

Publication number Publication date
CN105543168A (zh) 2016-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105543168B (zh) 免疫细胞的储存及运输方法
CN110050782B (zh) 一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法
EP0237863B1 (en) Synthetic, plasma-free, transfusible platelet storage medium.
CN106591233B (zh) 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法
CN106701681B (zh) 一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法
CN105532644B (zh) 淋巴细胞的冻存方法
CN105462920B (zh) 从外周血提取免疫细胞的方法
CN112998009A (zh) Nk细胞冻存液及其制备方法和应用
CN108142412A (zh) 一种免疫细胞冻存液及冻存方法
CN107012119A (zh) 一种从骨髓中提取免疫细胞的方法
CN102550543B (zh) 用于保存脐带组织的液体
CN113854280B (zh) 一种低温保存液及其制备方法和应用
CN105543167B (zh) 骨髓干细胞的保存及运输方法
CN104271735B (zh) 含有海藻糖的用于预防肺栓塞形成的哺乳动物细胞悬浮液
CN107711823A (zh) 一种常温保存的细胞冻存液及其应用
CN105900973B (zh) 一种巨噬细胞冻存液及冻存方法
CN114190367B (zh) 冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用
CN105505867B (zh) 用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液
CN105567632B (zh) 分离淋巴细胞的分离方法
CN104115995B (zh) 一种提高动物精液活力的复合糖制剂及其应用
CN105505868B (zh) 分离外周血免疫细胞的分离方法
CN105838661A (zh) Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用
CN105175567A (zh) 鳄鱼血多糖的提取方法及其在肺癌治疗中的应用
CN111418577B (zh) 一种临床级脂肪组织专用冷冻保存液及其制备、使用方法和应用
CN102603891A (zh) 一种双重病毒灭活制备破伤风人免疫球蛋白的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 100085 B222 2 floor, room 5, development road, Haidian District, Beijing.

Applicant after: Beijing Hongrun Tianyuan gene Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 100085 Jintai fortune 9, No. 9 Anning West Road, Haidian District, Beijing

Applicant before: CELLONIS BIOTECHNOLOGIES CO., LTD.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190122

Termination date: 20191231

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee