CN105900973B - 一种巨噬细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种巨噬细胞冻存液及冻存方法。所述巨噬细胞冻存液含有下述组分：葡聚糖、牛血清白蛋白、山梨醇、低分子右旋糖酐、壳聚糖和RPMI 1640。所述巨噬细胞的冻存方法使用上述巨噬细胞冻存液冻存巨噬细胞。本发明巨噬细胞冻存液和冻存方法提高了巨噬细胞的冻存效果，复苏后的活率较高，细胞生长状态好，传代时间也较长；本发明巨噬细胞冻存液不使用FBS，大大提高了临床输注的安全性；减少了DMSO的含量，降低了对人体的毒害风险。

Description

一种巨噬细胞冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞冻存领域，具体是涉及一种巨噬细胞冻存液及冻存方法。

背景技术

巨噬细胞是一种位于组织内的白细胞，属于吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。因此巨噬细胞也具有一定的抗原提呈能力。

目前对巨噬细胞冻存的研究比较少。实际上，由于巨噬细胞所需消化时间较长、具有终末分化等特点，导致巨噬细胞对冻存条件极其敏感。现有冻存巨噬细胞的冻存液由90v/v％FBS和10v/v％DMSO的组成，冻存条件为4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后再转入液氮中。采用此种方法冻存巨噬细胞，需要时间较长，操作步骤繁琐，需要仪器设备较多；冻存液中使用大量牛血清和大量DMSO，具有较大风险性，不适合临床使用。而且冻存效果差，细胞复苏后往往需要比较长的时间才能恢复生长状态，并且表面标记也比较差，传代代数较少。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种巨噬细胞冻存液及冻存方法。

一种巨噬细胞冻存液，含有下述组分：葡聚糖、牛血清白蛋白、山梨醇、低分子右旋糖酐、壳聚糖和RPMI 1640。葡聚糖和山梨醇可以提高细胞外的渗透压，减少细胞内的自由水，壳聚糖可以进入细胞内，替代细胞内的自由水，减少因细胞冻存过程产生冰晶对细胞带来的损伤；低分子右旋糖酐是细胞外保护剂，保护细胞膜不在冻存过程中受到损伤；牛血清白蛋白可以稳定细胞膜上的蛋白，使其在冻存过程中不至于变性失去作用；RPMI 1640培养基可以为细胞提供营养，使其在复苏时更快的恢复生长。

优选地，所述巨噬细胞冻存液含有下述含量的下述组分：

进一步优选地，所述巨噬细胞冻存液含有下述含量的下述组分：

优选地，所述巨噬细胞冻存液含有下述含量的下述组分：

一种巨噬细胞的冻存方法，使用上述巨噬细胞冻存液冻存巨噬细胞。

优选地，使用上述巨噬细胞冻存液冻存巨噬细胞，直接-80℃过夜后转入液氮罐中保存。

优选地，冻存时巨噬细胞的密度为1×10⁶-2×10⁷cells/mL。

优选地，冻存时巨噬细胞的密度为1×10⁷cells/mL。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明巨噬细胞冻存液和冻存方法直接-80℃过夜后转入液氮罐中保存，简化了冻存步骤，缩短了操作时间，提高了巨噬细胞的冻存效果，复苏后的活率较高，细胞生长状态好，传代时间也较长；

2)本发明巨噬细胞冻存液不使用FBS，大大提高了临床输注的安全性；减少了DMSO的含量，降低了对人体的毒害风险。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

实施例1

本实施例中使用的巨噬细胞冻存液含有下述含量的下述组分：

葡聚糖2.5mg/mL，牛血清白蛋白10mg/mL，山梨醇5v/v％，DMSO 3v/v％，低分子右旋糖酐10mg/mL，RPMI 1640 92v/v％，壳聚糖3.5mg/mL。

使用上述巨噬细胞冻存液冻存巨噬细胞的方法为：

用本实施例巨噬细胞冻存液将P1代巨噬细胞配制成密度为1×10⁷cells/mL的细胞悬液，将细胞悬液加入冻存管中，-80℃过夜，第二天将细胞转入液氮罐中-196℃保存。

所述P1代巨噬细胞通过以下方法制备：用Ficoll法离心自外周血中分离PBMC，用含有30ng/mL GM-CSF、10v/v％FBS的RPMI 1640培养基按照1×10⁶cells/mL的密度重悬PBMC，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养，每3天按照总体积的二分之一补充含有30ng/mL GM-CSF、10v/v％FBS的RPMI 1640培养基；第7天去除培养上清，PBS清洗2遍后加入0.25％的胰酶消化液进行消化，消化5分钟后加入5倍于胰酶消化液体积的FBS终止消化，离心去除上清，PBS清洗一遍后收获细胞记为P1代巨噬细胞，对P1代巨噬细胞进行细胞计数、活力检测。

实施例2

本实施例中使用的巨噬细胞冻存液含有下述含量的下述组分：

葡聚糖0.5mg/mL，牛血清白蛋白5mg/mL，山梨醇2v/v％，DMSO1v/v％，低分子右旋糖酐5mg/mL，RPMI 1640 97v/v％，壳聚糖1mg/mL。

使用上述巨噬细胞冻存液冻存巨噬细胞的方法为：

用本实施例巨噬细胞冻存液将P1代巨噬细胞配制成密度为1×10⁷cells/mL的细胞悬液，将细胞悬液加入冻存管中，-80℃过夜，第二天将细胞转入液氮罐中-196℃保存。

实施例3

本实施例中使用的巨噬细胞冻存液含有下述含量的下述组分：

葡聚糖4mg/mL，牛血清白蛋白20mg/mL，山梨醇9v/v％，DMSO 4v/v％，低分子右旋糖酐10mg/mL，RPMI 1640 87v/v％，壳聚糖6mg/mL。

使用上述巨噬细胞冻存液冻存巨噬细胞的方法为：

用本实施例巨噬细胞冻存液将P1代巨噬细胞配制成密度为1×10⁷cells/mL的细胞悬液，将细胞悬液加入冻存管中，-80℃过夜，第二天将细胞转入液氮罐中-196℃保存。

对比例1

本对比例中的冻存液由90v/v％FBS和10v/v％DMSO组成。使用该冻存液冻存巨噬细胞的方法为：使用该冻存液将P1巨噬细胞配制成密度为1×10⁷cells/mL的细胞悬液，将细胞悬液加入冻存管中，4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后在第二天转入液氮中保存。

P1代巨噬细胞的制备方法与实施例1相同。

效果实施例1、生长曲线、细胞计数及细胞活率

对各实施例、对比例中冻存3个月后的巨噬细胞进行解冻复苏培养后采用细胞计数板进行细胞计数，结果如表1所示。

复苏方法如下：将冻存的巨噬细胞取出，37℃水浴解冻。将解冻后的细胞悬液加入5倍体积的RPMI 1640，离心去除上清，将细胞沉淀用含有30ng/mL GM-CSF、10v/v％FBS的RPMI 1640培养基重悬，调整密度至1×10⁶cells/mL，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养3天，该细胞记为P2代巨噬细胞。第3天去除培养上清，PBS清洗2遍后加入0.25％的胰酶消化液进行消化，消化5分钟后加入5倍于胰酶消化液体积的FBS终止消化，离心去除上清。用含有30ng/mL GM-CSF、10v/v％FBS的RPMI 1640培养基重悬，调整密度至1×10⁶cells/mL，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养3天，该细胞记为P3代巨噬细胞。重复上述消化培养步骤，直到P6代巨噬细胞。检测每一代巨噬细胞的数量。

表1、各实施例和对比例的细胞增殖结果表(细胞数/千万)

细胞代数	1	2	3	4	5	6
							实施例1	0.4	1.7	5.8	19.2	59.4	102.3
实施例2	0.4	1.5	4.8	16.1	46.9	93.4
							实施例3	0.4	1.3	5.1	15.8	47.2	89.7
对比例1	0.4	0.9	1.4	0.8	0.6	0.3

由表1可知，对比例1所冻存的巨噬细胞复苏后增殖效果差，P3代细胞含量最高为1.4千万个细胞，之后急速下降，至P6代时仅为0.3千万个细胞。实施例1-3所冻存的巨噬细胞复苏后增殖迅速，P2代细胞含量就可达1.3-1.7千万个，且传代时间长，至P6代还呈快速增殖趋势，细胞数量为89.7-102.3千万个，远高于对比例1的结果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种巨噬细胞冻存液，其特征在于，含有下述组分：葡聚糖、牛血清白蛋白、山梨醇、低分子右旋糖酐、壳聚糖和RPMI 1640，其中，所述巨噬细胞冻存液含有下述含量的下述组分：

2.根据权利要求1所述的巨噬细胞冻存液，其特征在于，所述巨噬细胞冻存液含有下述含量的下述组分：

3.根据权利要求2所述的巨噬细胞冻存液，其特征在于，所述巨噬细胞冻存液含有下述含量的下述组分：

4.一种巨噬细胞的冻存方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一项所述的巨噬细胞冻存液冻存巨噬细胞。

5.根据权利要求4所述的巨噬细胞的冻存方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一项所述的巨噬细胞冻存液冻存巨噬细胞，直接-80℃过夜后转入液氮罐中保存。

6.根据权利要求4所述的巨噬细胞的冻存方法，其特征在于，冻存时巨噬细胞的密度为1×10⁶-2×10⁷cells/mL。

7.根据权利要求6所述的巨噬细胞的冻存方法，其特征在于，冻存时巨噬细胞的密度为1×10⁷cells/mL。