CN104396940B - 一种组织样本保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织样本保存液，用来保存采集后到分离前的脂肪、脐带、胎盘等组织样本，主要成分为高糖DMEM干粉培养基、碳酸氢钠、DMSO、地塞米松、胰岛素、青霉素、链霉素、两性霉素，肝素钠注射液，其中高糖DMEM和碳酸氢钠是维持组织内外细胞的渗透平衡、维持PH值，保持组织湿润状态和提供营养成分；DMSO是冻存保护剂，可防止组织样本冻伤；地塞米松抑制免疫，保护组织样本中干细胞活性；胰岛素促进组织样本对糖的吸收和利用；青霉素、链霉素、两性霉素可防止细菌、霉菌等污染，并可消除已发生的污染；肝素钠注射液防止标本中血液凝固，提高干细胞得率。本发明组织样本保存液配比简单，成本低廉、使用方便，可以保持脂肪、脐带、胎盘等组织样本内干细胞的活性，大大减少了组织样本从采集到制备的时间限制。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种保存采集后的组织样本如脂肪、脐带、胎盘等的保存液。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层，之后几乎分布于机体的所有器官与组织中。MSCs具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞，基质细胞，成纤维细胞，肌腱细胞等。在机体正常的损伤修复过程中，MSCs可以在趋化因子的诱导下，招募至损伤部位，在局部增殖、分化，并通过旁分泌作用参与损伤修复与组织再生。MSCs来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，因此，MSCs是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。
MSCs来源主要有脂肪、脐带、胎盘等组织样本，间充质干细胞制备过程包括组织样本的采集、运输、交接、检测、分离、冻存、复苏、原代培养和传代培养等诸多步骤，在组织样本采集后到分离前需要运输、交接和检测三个步骤，实际操作中需要存放较长的时间。组织样本一旦采集，脱离了原有的体内环境，其中的间充质干细胞的活性会受很多的因素的影响，诸如时间、温度、渗透压等。目前组织样本很多情况需要异地采集，运输、交接和检测三个步骤所用的时间就更长，组织样本需存放的时间较长，影响因素就更加的复杂。
国内的组织样本保存多采用直接装瓶或者补加基础培养基的方法。直接装瓶组织样本的保存时间一般少于24小时，给组织样本的运输、交接和检测带来了不小的时间压力，迫切需要改进组织样本的保存方法。
发明内容
为了克服现有技术领域存在的上述问题，本发明的目的在于，提供一种组织样本保存液及其制备方法，该组织样本保存液配比简单，成本低廉，使用方便。利用本发明组织样本保存液可以保存脂肪、脐带、胎盘等组织样本内干细胞的活性，在0～8℃的情况下有效保存至少96小时，分离出的干细胞活性受时间的影响很小，大大减少了组织样本从采集到制备的时间限制，并能有效降低污染概率。
组织样本保存液，在1L组织样本保存液中含有：高糖DMEM干粉培养基13.4g、碳酸氢钠2.438g、DMSO5～20mg、地塞米松39.25～117.75ug、胰岛素2～10mg、青霉素100～200mg、链霉素100～200mg、两性霉素2.5～5mg、肝素钠注射液0.5～1.5g，余量为注射用水。
所述的一种组织样本保存液的制备方法，包括以下步骤：
(a)将高糖DMEM干粉培养基13.4g倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，轻微搅拌溶解；
(b)加入2.438g碳酸氢钠；
(c)轻微搅拌溶解，加注射用水至1L；
(d)用1mol/L氢氧化钠溶液或者1mol/L盐酸溶液调节PH值至中性；
(e)依次分别加入DMSO5～20mg、地塞米松39.25～117.75ug、胰岛素2～10mg、青霉素100～200mg、链霉素100～200mg、两性霉素2.5～5mg、肝素钠注射液0.5～1.5g，充分混匀；
(f)0.22um滤膜过滤除菌，分装，0～8℃保存，即为组织样本保存液。
所述组织保存液，其中高糖DMEM和碳酸氢钠是维持组织内外细胞的渗透平衡、维持PH值，保持组织湿润状态和提供营养成分；DMSO是冻存保护剂，可防止组织样本冻伤；地塞米松抑制免疫，保护组织样本中干细胞活性；胰岛素促进组织样本对糖的吸收和利用；青霉素、链霉素、两性霉素可防止细菌、霉菌等污染，并可消除已发生的污染；肝素钠注射液防止标本中血液凝固，提高干细胞得率。
本发明的一种组织样本保存液及其制备方法，其有益效果在于配比简单，成本低廉、使用方便，使采集后的组织样本在运输、交接、分离前检测等过程中，能够在较长时间内有效保持其中干细胞的活性，并能防止和去除污染，提高效率。
附图说明
图1示经本发明组织样本保存液保存96小时的脂肪组织分离培养出的间充质干细胞，P2代，100X；
图2示经本发明组织样本保存液保存96小时的脐带组织分离培养出的间充质干细胞，P1代，40X。
具体实施方式
下面参照附图，结合实施例，对本发明提供的一种组织样本保存液及其制备方法，进行详细的说明。
实施例
参照图1-图2，本实施例的一种组织样本保存液及其制备方法，在1L组织样本保存液中含有：高糖DMEM干粉培养基13.4g、碳酸氢钠2.438g、DMSO10mg、地塞米松100ug、胰岛素8mg、青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、肝素钠注射液1g，余量为注射用水。
该组织样本保存液的制备方法如下：
(a)将高糖DMEM干粉培养基(品牌：GIBCO，货号12100-046)13.4g倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，轻微搅拌溶解；
(b)加入2.438g碳酸氢钠；
(c)轻微搅拌溶解，加注射用水至1L；
(d)用1mol/L氢氧化钠溶液或者1mol/L盐酸溶液调节PH值至中性；
(e)依次分别加入DMSO10mg(品牌sigma，货号D2650)、地塞米松100ug(品牌Sigma，货号D4902-25MG)、胰岛素8mg(品牌Sigma，货号I0908)、青霉素200mg(品牌Amresco，货号0242)、链霉素200mg(品牌Amresco，货号0382)、两性霉素5mg(品牌Amresco，货号E437)、肝素钠注射液1g(厂家：成都市海通药业有限公司，规格2ml：5000单位)，充分混匀；
(f)0.22um滤膜过滤除菌，分装，0～8℃保存，即为组织样本保存液。
实施例二
一种组织样本保存液，在1L组织样本保存液中含有：高糖DMEM干粉培养基13.4g、碳酸氢钠2.438g、DMSO5mg、地塞米松40ug、胰岛素2mg、青霉素100mg、链霉素100mg、两性霉素2.5mg、肝素钠注射液0.5g，余量为注射用水。
该组织样本保存液的制备方法如下：
(a)将高糖DMEM干粉培养基13.4g倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，轻微搅拌溶解；
(b)加入2.438g碳酸氢钠；
(c)轻微搅拌溶解，加注射用水至1L；
(d)用1mol/L氢氧化钠溶液或者1mol/L盐酸溶液调节PH值至中性；
(e)依次分别加入DMSO5mg、地塞米松40ug、胰岛素2mg、青霉素100mg、链霉素100mg、两性霉素2.5mg、肝素钠注射液0.5g，充分混匀；
(f)0.22um滤膜过滤除菌，分装，0～8℃保存，即为组织样本保存液。
实施例三
一种组织样本保存液，在1L组织样本保存液中含有：高糖DMEM干粉培养基13.4g、碳酸氢钠2.438g、DMSO20mg、地塞米松40ug、胰岛素8mg、青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素2.5mg、肝素钠注射液1.5g，余量为注射用水。
该组织样本保存液的制备方法如下：
(a)将高糖DMEM干粉培养基13.4g倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，轻微搅拌溶解；
(b)加入2.438g碳酸氢钠；
(c)轻微搅拌溶解，加注射用水至1L；
(d)用1mol/L氢氧化钠溶液或者1mol/L盐酸溶液调节PH值至中性；
(e)依次分别加入DMSO20mg、地塞米松40ug、胰岛素8mg、青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素2.5mg、肝素钠注射液1.5g，充分混匀；
(f)0.22um滤膜过滤除菌，分装，0～8℃保存，即为组织样本保存液。
实施例四
脂肪组织的采集及保存：用本发明的组织样本保存液保存吸脂后到分离前的人脂肪组织，即无菌采集脂肪后，吸弃膨胀液，将采集的脂肪组织放入装有本发明的组织样本保存液的脂肪采集瓶中，拧紧瓶盖并密封，放入恒温箱中0～8℃恒温保存至分离。
保存液的保存效果对比：将采集的脂肪组织均分为5份，分别保存在本发明的组织样本保存液、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水和高糖DMEM培养基(液体)中，最后一份直接将脂肪组织单独放置，在0～8℃恒温保存24小时、48小时、72小时、96小时后胶原酶消化分离，取相同克数脂肪组织块分离获得的有核细胞常规培养9天后，消化计数。同时留一份新鲜脂肪组织不保存作为对照，直接胶原酶消化分离后取相同克数脂肪组织块获得的有核细胞常规培养9天，消化后计数为6.20×107。
保存结果显示如下：
对过去一年脂肪采集运输进行污染率统计，不加任何溶液保存的脂肪组织52份中有2份污染，污染率为3.8％；经本发明组织样本保存液保存的147份脂肪组织中没有一份污染，污染率为0。
实施例五
脐带组织的采集及保存：用本发明的组织样本保存液保存从脐带采集后到脐带分离前的人来源的脐带组织，即：胎儿娩出后10秒钟内，按手术常规结扎脐带后剪断采集，将采集的脐带放入装有本发明所述的组织样本保存液的脐带采集瓶中，拧紧瓶盖并密封，放入恒温箱中0～8℃恒温保存至分离。
保存液的保存效果对比：胎儿娩出后10秒钟内，按手术常规结扎脐带后剪断采集，将采集的脐带均分为5段，分别保存在本发明的组织样本保存液、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水和高糖DMEM培养基(液体)中，最后一段直接将脐带单独放置，在0～8℃恒温保存24小时、48小时、72小时、96小时后分离，取相同克数组织块常规培养14天后，消化计数。同时留一段新鲜的脐带小段不保存作为对照，直接分离后取相同克数组织块常规培养14天，消化后计数为2.04×106。
保存结果显示如下：
对过去一年脐带采集进行回顾性污染率统计，不加任何溶液保存的脐带138份中有3份污染，污染率为2.2％；经本发明组织样本保存液保存的293份脐带中只有0份污染，污染率为0。
可以看出，本发明的组织样本保存液，可以使采集后的组织样本在运输、交接、分离前检测等过程中，能够在较长时间内有效保持其中干细胞的活性，提高干细胞得率，并能防止和去除污染，扩大了组织样本库干细胞存储的业务范围。
Claims (2)
1.一种组织样本保存液，其特征在于，在1L组织样本保存液中含有：高糖DMEM干粉培养基13.4g、碳酸氢钠2.438g、DMSO5～20mg、地塞米松39.25～117.75ug、胰岛素2～10mg、青霉素100～200mg、链霉素100～200mg、两性霉素2.5～5mg、肝素钠注射液0.5～1.5g，余量为注射用水。
2.如权利要求1所述的一种组织样本保存液的制备方法，包括以下步骤：
(a)将高糖DMEM干粉培养基13.4g倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器，加注射用水至950ml，轻微搅拌溶解；
(b)加入2.438g碳酸氢钠；
(c)轻微搅拌溶解，加注射用水至1L；
(d)用1mol/L氢氧化钠溶液或者1mol/L盐酸溶液调节PH值至中性；
(e)依次分别加入DMSO5～20mg、地塞米松39.25～117.75ug、胰岛素2～10mg、青霉素100～200mg、链霉素100～200mg、两性霉素2.5～5mg、肝素钠注射液0.5～1.5g，充分混匀；
(f)0.22um滤膜过滤除菌，分装，0～8℃保存，即为组织样本保存液。
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