CN108142412B - 一种免疫细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫细胞冻存液及冻存方法，该冻存液包括基础培养基和添加成分，其中，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖1‑5g/mL、丙二醇3‑6v/v％、乙酰胺3‑5v/v％、右旋糖酐5‑10v/v％、羟乙基淀粉1‑3g/mL、葡萄糖0.5‑1.5g/mL、肝素钠50‑150U/mL、珍珠草提取液5‑15mg/mL和卡介菌复合多糖0.5‑1.5mg/mL。本发明冻存液配方简单，各组分相互配合，协同作用，在提供的冻存方法下可明显提高内皮祖细胞的冻存效果，同时还可保证复苏后细胞增殖活力不受影响，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种免疫细胞冻存液及冻存方法。
背景技术
免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。
随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者放疗、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。
但免疫细胞的体外培养效果很大程度上取决于病人体内的免疫细胞的多少以及质量，但肿瘤病人体内的免疫细胞本来就比正常人少，再加上放疗、化疗后免疫细胞的数量就更为稀少了，因此，采集肿瘤病人体内的免疫细胞往往需要在化疗之前进行，于是就产生了病人放化疗的时间和免疫细胞回输时间的冲突。
如果能够提前将免疫细胞培养好并冻存起来，待到需要时立刻复苏并回输，则可解决时间冲突的问题，并且随时抗原使用，对于医生选择治疗方法相当有利。
细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险，因此寻找一种优异的细胞冻存液及冻存过程显得尤为重要。现有的细胞冻存液多采用DMSO联合动物血清，大部分为10％的DMSO与90％的胎牛血清，但由于DMSO含量仍较高，具有相当的毒性，对病人身体不利，而且胎牛血清中含有大量的异种蛋白，既有传染病的危险，又很容易引起过敏反应或者免疫排斥，因此不能直接用于临床回输。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种免疫细胞冻存液及冻存方法，可有效解决现有技术中细胞冻存液具有一定毒性以及容易引起过敏反应，不能直接用于临床回输的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种免疫细胞冻存液，包括基础培养基和添加成分，其中，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖1-5g/mL、丙二醇3-6v/v％、乙酰胺3-5v/v％、右旋糖酐5-10v/v％、羟乙基淀粉1-3g/mL、葡萄糖0.5-1.5g/mL、肝素钠50-150U/mL、珍珠草提取液5-15mg/mL和卡介菌复合多糖0.5-1.5mg/mL。
进一步地，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖3g/mL、丙二醇3-6v/v％、乙酰胺4v/v％、右旋糖酐8v/v％、羟乙基淀粉2g/mL、葡萄糖1.0g/mL、肝素钠100U/mL、珍珠草提取液10mg/mL和卡介菌复合多糖0.8mg/mL。
进一步地，珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-3:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入6-8倍重量的蒸馏水，在90-95℃加热6-8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
进一步地，卡介菌复合多糖通过以下方法制备得到：将卡介菌接种于苏通液体培养基培养至生长成暗橙色菌膜，然后煮沸2-3h，离心并收集提取液，向沉淀中加入2-3倍无菌水，再煮沸30-50min，离心，合并两次提取液，最后干燥，粉碎，得卡介菌复合多糖。
进一步地，基础培养基为DMEM/F12培养基。
进一步地，免疫细胞为T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞或CAR-T细胞。
采用上述冻存液冻存免疫细胞的方法，包括：将免疫细胞加入冻存液中，然后将温度降至-20～-25℃冻存1-2h，然后以3℃/h的速率降温至-40～-45℃冻存1-3h，再以5℃/h的速率降温至-75～-80℃冻存2-4h，最后转移至液氮中保存。
进一步地，免疫细胞的冻存密度为1-5×106个/mL。
进一步地，免疫细胞的冻存密度为3×106个/mL。
本发明提供的一种免疫细胞的冻存液及冻存方法，具有以下有益效果：
(1)本发明冻存液中不含有动物源血清，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。
(2)本发明冻存液中不含有二甲基亚砜，不会对细胞产生毒性，同时还有利于细胞的复苏。
(3)本发明冻存液配方简单，各组分相互配合，协同作用，可明显提高内皮祖细胞的冻存效果，同时还可保证复苏后细胞增殖活力不受影响，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶。
具体实施方式
实施例1
一种免疫细胞冻存液，包括基础培养基和添加成分，其中，基础培养基为DMEM/F12培养基，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖1g/mL、丙二醇3v/v％、乙酰胺3v/v％、右旋糖酐5v/v％、羟乙基淀粉1g/mL、葡萄糖0.5g/mL、肝素钠50U/mL、珍珠草提取液5mg/mL和卡介菌复合多糖0.5mg/mL。
其中，珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入6倍重量的蒸馏水，在90℃加热8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
进一步地，卡介菌复合多糖通过以下方法制备得到：将卡介菌接种于苏通液体培养基培养至生长成暗橙色菌膜，然后煮沸2h，离心并收集提取液，向沉淀中加入2倍无菌水，再煮沸50min，离心，合并两次提取液，最后干燥，粉碎，得卡介菌复合多糖。
实施例2
一种免疫细胞冻存液，包括基础培养基和添加成分，其中，基础培养基为DMEM/F12培养基，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖5g/mL、丙二醇6v/v％、乙酰胺5v/v％、右旋糖酐10v/v％、羟乙基淀粉3g/mL、葡萄糖1.5g/mL、肝素钠150U/mL、珍珠草提取液15mg/mL和卡介菌复合多糖1.5mg/mL。
其中，珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至100目，将粉末与无水乙醇以重量比为3:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入8倍重量的蒸馏水，在95℃加热8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
进一步地，卡介菌复合多糖通过以下方法制备得到：将卡介菌接种于苏通液体培养基培养至生长成暗橙色菌膜，然后煮沸3h，离心并收集提取液，向沉淀中加入3倍无菌水，再煮沸50min，离心，合并两次提取液，最后干燥，粉碎，得卡介菌复合多糖。
实施例3
一种免疫细胞冻存液，包括基础培养基和添加成分，其中，基础培养基为DMEM/F12培养基，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖3g/mL、丙二醇3-6v/v％、乙酰胺4v/v％、右旋糖酐8v/v％、羟乙基淀粉2g/mL、葡萄糖1.0g/mL、肝素钠100U/mL、珍珠草提取液10mg/mL和卡介菌复合多糖0.8mg/mL。
其中，珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至100目，将粉末与无水乙醇以重量比为2:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入8倍重量的蒸馏水，在90℃加热8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
进一步地，卡介菌复合多糖通过以下方法制备得到：将卡介菌接种于苏通液体培养基培养至生长成暗橙色菌膜，然后煮沸3h，离心并收集提取液，向沉淀中加入3倍无菌水，再煮沸50min，离心，合并两次提取液，最后干燥，粉碎，得卡介菌复合多糖。
对比例1
对比例1与实施例3不同之处在于，冻存液中缺少珍珠草提取液，其余与实施例3相同。
对比例2
对比例2与实施例3不同之处在于，冻存液中缺少卡介菌复合多糖，其余与实施例3相同。
对比例3
对比例3与实施例3不同之处在于，冻存液中缺少珍珠草提取液和卡介菌复合多糖，其余与实施例3相同。
对比例4
该冻存液由10％的DMSO与90％的胎牛血清组成。
试验例
1、单个核细胞的分离，依次包括以下步骤：
(1)、抽取外周血20mL，加到50mL离心管中，700g离心10min；
(2)、吸取下层血液，然后加入2倍体积的生理盐水稀释；
(3)、取新的50mL离心管，加入15mL淋巴细胞分离液，缓慢加入稀释后的血液，保证分层清晰，然后700g离心20-30min；
(4)、提取中间白膜层细胞，即得单个核细胞，加生理盐水清洗两遍，计数，细胞数量为2-3×107个/mL。
2、分别用实施例1-3、对比例1-4所提供的冻存液进行冻存
实施例1-3：将单个核细胞分别加入实施例1-3提供的冻存液中混匀，使其细胞密度为3×106个/mL，然后将温度降至-20～-25℃冻存1-2h，然后以3℃/h的速率降温至-40～-45℃冻存1-3h，再以5℃/h的速率降温至-75～-80℃冻存2-4h，最后转移至液氮中保存。
对比例1-4：将单个核细胞分别加入实施例1-3提供的冻存液中混匀，使其细胞密度为3×106个/mL，然后直接用程序降温仪降温至-80℃，最后转入液氮罐冻存。
3、复苏
将细胞冻存管置于37℃，在2min内解冻细胞，离心沉淀细胞后，直接加DMEM/F12培养基重悬细胞，添加1000U/mL的IL-2、1000U/mL的OKT3、1000U/mL的IL-15和1000U/mL的IL-21进行培养。
统计各组复苏后的细胞数量及活率，其结果见表1。
表1各组复苏后细胞数量和活率
| 复苏后数量 | 活率 | |
| 实施例1 | 5.12×10<sup>6</sup> | 98.5％ |
| 实施例2 | 5.53×10<sup>6</sup> | 98.9％ |
| 实施例3 | 5.78×10<sup>6</sup> | 99.3％ |
| 对比例1 | 4.89×10<sup>6</sup> | 94.2％ |
| 对比例2 | 4.64×10<sup>6</sup> | 93.1％ |
| 对比例3 | 4.51×10<sup>6</sup> | 88.9％ |
| 对比例4 | 3.24×10<sup>6</sup> | 80.6％ |
由表1可知，实施例1-3复苏后数量明显高于对比例1-4，其活率也明显高于对比例，尤其是实施例3效果最佳，说明本发明各组分直接协同作用，才能明显提供其细胞冻存效果。
在复苏过程中，我们还对细胞的增殖情况进行了跟踪，由细胞增殖情况可知，对比例1-4增殖情况很差，而实施例1-3中细胞增殖速度很快，尤其是实施例3，增殖速度最快，实施例1-3增殖速度明显快于对比例1-4，对比例1、2、3、4增殖速度依次减弱。
4、标志物检测
以初始分离的PBMC细胞作为对照，对实施例3培养的细胞的细胞表面标志物进行检测，由检测结果可知，采用本发明所述的免疫细胞的冻存液冻存免疫细胞，经复苏后可以获得更高纯度的NKT效应细胞。
同时对实施例3培养的细胞的杀伤能力进行检测，可知，经本发明的免疫细胞的冻存液冻存后复苏培养，保持了细胞的杀伤力。
Claims (9)
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，包括基础培养基和添加成分，其中，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖1-5g/mL、丙二醇3-6v/v％、乙酰胺3-5v/v％、右旋糖酐5-10v/v％、羟乙基淀粉1-3g/mL、葡萄糖0.5-1.5g/mL、肝素钠50-150U/mL、珍珠草提取液5-15mg/mL和卡介菌复合多糖0.5-1.5mg/mL。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖3g/mL、丙二醇3-6v/v％、乙酰胺4v/v％、右旋糖酐8v/v％、羟乙基淀粉2g/mL、葡萄糖1.0g/mL、肝素钠100U/mL、珍珠草提取液10mg/mL和卡介菌复合多糖0.8mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-3:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入6-8倍重量的蒸馏水，在90-95℃加热6-8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
4.根据权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述卡介菌复合多糖通过以下方法制备得到：将卡介菌接种于苏通液体培养基培养至生长成暗橙色菌膜，然后煮沸2-3h，离心并收集提取液，向沉淀中加入2-3倍无菌水，再煮沸30-50min，离心，合并两次提取液，最后干燥，粉碎，得卡介菌复合多糖。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
6.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞或CAR-T细胞。
7.采用权利要求1-6任一项所述的冻存液冻存免疫细胞的方法，其特征在于，包括：将免疫细胞加入冻存液中，然后将温度降至-20～-25℃冻存1-2h，然后以3℃/h的速率降温至-40～-45℃冻存1-3h，再以5℃/h的速率降温至-75～-80℃冻存2-4h，最后转移至液氮中保存。
8.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，免疫细胞的冻存密度为1-5×106个/mL。
9.根据权利要求8所述的冻存方法，其特征在于，免疫细胞的冻存密度为3×106个/mL。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Xiong Huaqiang Inventor after: Qin Lianrong Inventor after: Xiong Rongjian Inventor before: Wang Jian Inventor before: Xiong Huaqiang Inventor before: Qin Lianrong Inventor before: Xiong Rongjian |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |