CN111004780B - 一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法 - Google Patents

一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法。本发明公开了一种细胞分离培养液，由中性粒细胞分离液、培养液A、培养液B和培养液C组成；培养液A为：IFN‑γ和基础培养基；培养液B为：IL‑2、IL‑1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；培养液C为：IL‑2和基础培养基。本发明细胞分离培养液的中性粒细胞分离液可以除去细胞中中性粒细胞，从而使得培养得到的有效细胞比例增加，进而增加细胞群的杀伤活性。

Description

一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法。
背景技术
目前，CIK细胞培养大多从外周血通过Ficoll提取，并在多种细胞因子组合刺激，获得一定数量及活性的CIK细胞。但传统的方法分离提取得到的CIK细胞有效细胞比例较少，体外杀瘤活性不理想。
发明内容
本发明提供了一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法，解决了现有的CIK细胞有效细胞比例较少，体外杀瘤活性不理想的问题。
其具体技术方案如下：
本发明提供了一种细胞分离培养液，由中性粒细胞分离液、培养液A、培养液B和培养液C组成；
所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；
所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；
所述培养液C为：IL-2和基础培养基。
中性粒细胞占白细胞的50～70％，是外周血循环和免疫系统中含量最丰富的白细胞。各类白细胞百分比为：嗜中性粒细胞50～70％，嗜酸性粒细胞0.5～5％，嗜碱性粒细胞0～1％，淋巴细胞20～40％，单核细胞3～8％。中性粒细胞活化的标志物为CD11b和CD66b，不表达CD3、CD56、CD8膜蛋白分子。
本发明中，通过向细胞中加入中性粒细胞分离液，从而减少细胞中中性粒细胞的含量，使得培养得到的有效细胞比例增加，进而增加细胞群的杀伤活性。本发明将培养液B中IL-2、IL-1α和CD3单克隆抗体进行复配，结合培养液A和培养液C共同作用，有利于刺激单核细胞向CIK细胞进行转化。本发明所述细胞优选为CIK细胞。
本发明中，所述培养液A中IFN-γ的终浓度为2500～5000IU/ml，更优选为5000IU/ml；
所述培养液B中的IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体的终浓度分别为500～1000IU/ml、2.5～5ng/ml、250～500ng/ml，更优选分别为1000IU/ml、5ng/ml、500ng/ml；
所述培养液C中的IL-2终浓度为500～1000IU/ml，更优选为1000IU/ml。
本发明中，细胞培养液还包括自体血浆。将自体血浆作为营养物质，避免了胎牛血清的使用，减少外源致热源，致敏污染，且降低了培养成本。
本发明基础培养基优选为淋巴细胞无血清培养基。
本发明还提供了一种CIK细胞分离培养试剂盒，包括上述细胞分离培养液。
本发明还提供了一种CIK细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
步骤1：向外周血中分离单个核细胞；
步骤2：第0天，将单个核细胞接种于培养液A中进行培养；
步骤3：培养至第1天，加入培养液B进行培养；
步骤4：培养至第4、8和11天，分别加入培养液C进行培养，继续培养至14天，得到CIK细胞；
所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；
所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；
所述培养液C为：IL-2和基础培养基。
本发明培养液A和培养液B均为CIK细胞刺激培养基，培养液C为CIK细胞扩增培养基。
本发明步骤2中，所述单个核细胞的接种量为1×106～2×107个/ml，优选为2×106～4×106个/ml。
本发明提供的分离培养方法中，对含有不同细胞因子的培养液在不同时间段加入，共同作用刺激CIK细胞的高效转化。
本发明步骤1具体为：取人体外周静脉血，加入中性粒细胞分离液进行第一离心，分层后吸取单个核细胞层，得到单个核细胞。
所述第一离心的速率为1500rpm-1800rpm，时间为20min-30min，优选为1700rpm离心30min。
所述吸取单个核细胞层之后，得到所述单个核细胞之前，还包括：向吸取的单个核细胞层加入生理盐水进行第二离心，重复两次；所述第二离心的速率为1000rpm-1500rpm，时间为5min-10min，优选为1000rpm离心10min。
本发明步骤2具体为：第0天，使用培养液A重悬所述单个核细胞，优选转移至T75m2培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
本发明步骤4具体为：培养至第4天，将培养瓶中的全部细胞转移至新的T75m2培养瓶中，再加入培养液C继续培养；培养至第8天，将所述T75m2培养瓶中的全部细胞转移至新的T125m2培养瓶中，再加入培养液C继续培养；培养至11天，补充培养液C继续培养至第14天，得到CIK细胞。
本发明加入所述培养液B或所述培养液C时，均需加入血浆，优选加入1ml的自体血浆。
本发明提供的分离培养方法中，培养液A、培养液B和培养液C中各细胞因子的浓度与上述细胞分离培养液中的各细胞因子的浓度相同，此处不再赘述。
本发明CIK细胞的分离培养中，优选还可以加入中性粒细胞分离液除去中性粒细胞，使得培养得到的有效细胞比例增加，进而增加细胞群的杀伤活性。本发明中性粒细胞分离液的加入方式有三种：
第一种：在步骤1外周血提取单个核细胞时加入，具体为：向所述外周血中加入中性粒细胞分离液，分层后，吸取单个核细胞层。
第二种：在步骤4培养至第8天时加入，具体为：将培养至第8天的样品加入中性粒细胞分离液，离心后，吸取单个核细胞层加入所述培养液C进行培养。
第三种：在步骤4培养至第14天加入，具体为：将培养至第14天的样品加入中性粒细胞分离液，离心后，取单个核细胞层，即为CIK细胞。
本发明优选采用第一种或第三种方法加入中性粒细胞分离液。第一种和第三种方法较第二种方法加入中性粒细胞分离液分离培养得到的CIK细胞的有效细胞比例高，杀伤活力高。上述三种方法中，中性粒细胞分离液与待分离液的体积比为1：1；第二种和第三种中性粒细胞的加入方法中，取单个核细胞层后均优选采用生理盐水进行洗涤2～3次，优选洗涤2次。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种细胞分离培养液，由中性粒细胞分离液、培养液A、培养液B和培养液C组成；培养液A为：IFN-γ和基础培养基；培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；培养液C为：IL-2和基础培养基。
本发明细胞分离培养液采用特定的培养液：培养液A、培养液B和培养液C，三种培养液协同配合，共同作用，有利于刺激单个核细胞向CIK细胞进行转化。另外，本发明细胞分离培养液中的中性粒细胞分离液可以除去细胞中中性粒细胞，从而使得培养得到的有效细胞比例增加，进而增加细胞群的杀伤活性。由实验数据可知，本发明提供细胞分离培养液培养的CIK细胞在效靶比为20：1时，细胞的杀伤活力为70％以上，效靶比为10：1时，细胞的杀伤活力最高可达到约80％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例2提供的CIK细胞培养第0天的流式检测结果图；
图2为本发明实施例1提供的CIK细胞培养第14天的流式检测结果图；
图3为本发明实施例2提供的CIK细胞培养第14天的流式检测结果图；
图4为本发明实施例3提供的CIK细胞培养第14天的流式检测结果图；
图5本发明对比例1提供的CIK细胞培养第14天的流式检测结果图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，IFN-γ购自上海热创生物技术有限公司；IL-2购自山东泉港药业有限公司；IL-1α购自广州东锐科技有限公司；CD3单克隆抗体购自宝日医生物技术(北京)有限公司；淋巴细胞无血清培养基购自广州市海进生物科技有限公司；A549肿瘤细胞均为广州航华医药科技有限公司保存。
实施例1
本实施例为CIK细胞的分离培养
(1)分离外周血的单个核细胞：
采集5ml人体外周静脉血，并缓慢转移到装有5ml中性粒细胞分离液的15ml离心管中，1700rpm离心30min。离心后吸取单个核细胞层，转移到新的15ml离心管中，添加生理盐水到离心管刻度最大值处，1000rpm离心10min，洗涤2次。沉淀物即为外周血单个核细胞；
(2)CIK细胞刺激培养：
(2.1)Day0：
添加5000IU/ml IFN-γ到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液A，取5ml重悬步骤(1)得到的外周血单个核细胞，转移至T25m2培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；
(2.2)Day1：
添加1000IU/ml IL-2、5ng/ml IL-1α及500ng/ml CD3单克隆抗体(OKT3)到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液B，添加2.5ml到(2.1)步的培养瓶中。补充1ml自体血浆，置于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养。
(3)扩增培养：
添加1000IU/ml IL-2到淋巴细胞无血清培养基中配制成培养液C。
Day4：将T25m2瓶全部细胞转移至新的T75m2瓶中，并补充40ml培养液C和1ml自体血浆；
Day8：将T75m2瓶全部细胞转移至新的T175m2瓶中，并补充60ml培养液C和1ml自体血浆；
Day11：补充40mlCIK细胞扩增培养基和1ml自体血浆；
(4)Day14：收集CIK细胞。
实施例2
本实施例为CIK细胞的分离培养
(1)分离外周血的单个核细胞：
采集5ml人体外周静脉血，并缓慢转移到装有5ml Ficoll的15ml离心管中，2000rpm离心20min。离心后吸取白膜层，转移到新的15ml离心管中，添加生理盐水到离心管刻度最大值处，1600rpm离心10min，洗涤2次。沉淀物即为外周血单个核细胞；
(2)CIK细胞刺激培养：
(2.1)Day0：
添加5000IU/ml IFN-γ到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液A，取5ml重悬步骤(1)得到的外周血单个核细胞，转移至T25m2培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；
(2.2)Day1：
添加1000IU/ml IL-2、5ng/ml IL-1α及500ng/ml CD3单克隆抗体(OKT3)到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液B，添加2.5ml到(2.1)步的培养瓶中。补充1ml自体血浆，置于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养。
(3)扩增培养：
添加1000IU/ml IL-2到淋巴细胞无血清培养基配置成培养液C。
Day4：将T25m2瓶全部细胞转移至新的T75m2瓶中，并补充40ml培养液C，和1ml自体血浆；
Day8：将T75m2瓶全部细胞转移至50ml离心管，1500rpm离心5min。丢弃上清液，用5ml生理盐水重悬，缓慢转移到装有5ml中性粒细胞分离液的15ml离心管中，1700rpm离心30min。离心后吸取单个核细胞层，转移到新的15ml离心管中，添加生理盐水到离心管刻度最大值处，1000rpm离心10min，洗涤2次。用47.5ml CIK细胞扩增培养基重悬，转移细胞至T175m2瓶中，并补充60ml培养液C和1ml自体血浆；
Day11：补充40ml培养液C和1ml自体血浆；
(4)Day14：收集CIK细胞
实施例3
本实施例为CIK细胞的分离培养
(1)分离外周血的单个核细胞：
采集5ml人体外周静脉血，并缓慢转移到装有5ml Ficoll的15ml离心管中，2000rpm离心20min。离心后吸取白膜层，转移到新的15ml离心管中，添加生理盐水到离心管刻度最大值处，1600rpm离心10min，洗涤2次。沉淀物即为外周血单个核细胞；
(2)CIK细胞刺激培养：
(2.1)Day0：
添加5000IU/ml IFN-γ到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液A，取5ml重悬步骤(1)得到的外周血单个核细胞，转移至T25m2培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；
(2.2)Day1：
添加1000IU/ml IL-2、5ng/ml IL-1α及500ng/ml CD3单克隆抗体(OKT3)到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液B，添加2.5ml到(2.1)步的培养瓶中。补充1ml自体血浆，置于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养。
(3)扩增培养：
添加1000IU/ml IL-2到淋巴细胞无血清培养基配置成培养液C。
Day4：将T25m2瓶全部细胞转移至新的T75m2瓶中，并补充40ml培养液C和1ml自体血浆；
Day8：将T75m2瓶全部细胞转移至新的T175m2瓶中，并补充60ml培养液C和1ml自体血浆；
Day11：补充40ml培养液C和1ml自体血浆；
(4)Day14：收集CIK细胞
将T175m2瓶全部细胞转移至50ml离心管，1500rpm离心5min。丢弃上清液。将全部细胞收集到一管，用5ml生理盐水重悬，缓慢转移到装有5ml中性粒细胞分离液的15ml离心管中，1700rpm离心30min。离心后吸取单个核细胞层，转移到新的15ml离心管中，添加生理盐水到离心管刻度最大值处，1000rpm离心10min，洗涤2次。
对比例1
本对比例为CIK细胞的分离培养
(1)分离外周血的单个核细胞：
采集5ml人体外周静脉血，并缓慢转移到装有5ml Ficoll的15ml离心管中，2000rpm离心20min。离心后吸取白膜层，转移到新的15ml离心管中，添加生理盐水到离心管刻度最大值处，1600rpm离心10min，洗涤2次。沉淀物即为外周血单个核细胞；
(2)CIK细胞刺激培养：
(2.1)Day0：
添加5000IU/ml IFN-γ到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液A，取5ml重悬步骤(1)得到的外周血单个核细胞，转移至T25m2培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；
(2.2)Day1：
添加1000IU/ml IL-2、5ng/ml IL-1α及500ng/ml CD3单克隆抗体(OKT3)到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液B，添加2.5ml到(2.1)步的培养瓶中。补充1ml自体血浆，置于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养。
(3)扩增培养：
添加1000IU/ml IL-2到淋巴细胞无血清培养基配置成培养液C。
Day4：将T25瓶全部细胞转移至新的T75m2瓶中，并补充40ml培养液C和1ml自体血浆；
Day8：将T75瓶全部细胞转移至新的T175m2瓶中，并补充60ml培养液C和1ml自体血浆；
Day11：补充40ml培养液C和1ml自体血浆；
(4)Day14：收集CIK细胞
实施例4
将实施例1～3和对比例1第14天收集的CIK细胞悬液、实施例2第0天收集的细胞悬液进行流式检测及杀瘤活性测试。
流式检测：将实施例1～3和对比例1第14天收集的CIK细胞悬液、实施例2第0天收集的细胞悬液各取10μl，加入各2μl CD3、CD8、CD56流式抗体，孵育20min。洗涤2次后上机检测。
CIK细胞流式结果如图1～5和表1所示，实施例1～3和对比例1CD3+CD8+效应细胞的比例均达到50％以上。
杀瘤活性测试：杀瘤实验采用MTT法，靶细胞选取A549肺癌细胞，取实施例1～3和对比例1第14天收集的CIK细胞悬液作为效应细胞。设置两个效靶比，分别为20：1和10：1。
CIK细胞杀伤活性检测结果如表2所示，效靶比为20：1时的实施例1～3CIK细胞对肿瘤的杀伤率达到了70％，但对比例1的杀伤率仅为52.25％。其中，实施例3在效靶比为10：1时对肿瘤的杀伤率也达到了79.62％。
表1
CD3+CD8+ CD3-CD56+ CD3+CD56+
DAY-0 22.75％ 5.44％ 6.58％
实施例1 60.81％ 7.97％ 14.24％
实施例2 50.2％ 2.75％ 6.97％
实施例3 56.97％ 26.69％ 18.88％
对比例1 56.89％ 17.59％ 16.27％
表2
Figure BDA0002351115900000091
Figure BDA0002351115900000101
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种CIK细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：向外周血中分离单个核细胞；
步骤2：第0天，将所述单个核细胞接种于培养液A中进行培养；
步骤3：培养至第1天，加入培养液B进行培养；
步骤4：培养至第4、8和11天，分别加入培养液C进行培养，继续培养至14天，得到CIK细胞；步骤4所述培养至14天具体为：将培养至第14天的样品加入中性粒细胞分离液，离心后，取单个核细胞层，即为CIK细胞；所述中性粒细胞分离液与待分离液的体积比为1：1；
所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；
所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3 单克隆抗体和基础培养基；
所述培养液C为：IL-2和基础培养基；
所述培养液A中IFN-γ的浓度为2500~5000 IU/mL；
所述培养液B中的IL-2、IL-1α、CD3 单克隆抗体的浓度分别为500~1000 IU/mL、2.5~5ng/mL、250~500 ng/mL；
所述培养液C中的IL-2浓度为500~1000 IU/mL；
所述基础培养基为淋巴细胞无血清培养基。
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