CN113430168A - 一种无血清培养冻存脐血nk细胞的方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种无血清培养冻存脐血NK细胞的方法，具体包括冻存脐血单个核的高质量提取和NK细胞的体外无血清扩增。还涉及一种冻存脐血单个核分离试剂盒，包括含有人血白蛋白、肝素钠和生理盐水的脐血洗涤液，含有羟乙基淀粉和生理盐水的脐血重悬液，含有聚蔗糖的淋巴细胞分离液。本发明可以解决冻存年限较久脐血在提取单个核过程中会产生絮状沉淀、红细胞大量残留、细胞分层不明显等问题以及冻存脐血NK培养中需要引入动物源血清的问题。

Description

一种无血清培养冻存脐血NK细胞的方法及其试剂盒
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种无血清培养冻存脐血NK细胞的方法及其试剂盒。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)，是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调解有关，甚至参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞大多数具有细胞毒性。它们可产生大量分子(穿孔素、颗粒酶、人体颗粒溶素)的溶解颗粒，这些分子可诱导应激细胞的细胞死亡。NK细胞亦表达多种肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，如FASL和TRAIL，分别与相应的受体FAS或TRAILR结合诱导靶细胞凋亡。此外，NK细胞产生一系列细胞因子(IFN-γ、TNFα、IL-10)、生长因子(GM-CSF)和趋化因子(CCL3、CCL4、CCL5、XCL1)。NK细胞可以通过与树突状细胞、巨噬细胞和T细胞相互作用来形成免疫反应。因此，NK细胞在免疫疗法中发挥着重要作用。
NK细胞无HLA限制性，有研究表明，HLA半相合细胞具有更强的杀瘤作用。所以，异体NK细胞的培养具有极高的临床价值。相比较于外周血，脐带血取材方便，伤害性小，污染概率低，是最佳的NK细胞制备材料。但脐带血应用范围较广，储存初期应用方向不太确定，所以会先进行冻存处理；根据目前情况来看，冻存脐血复苏后提取单个核细胞存在诸多问题，特别是冻存年限较久后，单个核提取尤为困难；并且因冻存脐血缺少自体血浆，冻存脐血NK细胞的培养往往使用胎牛血清或小牛血清，这就为NK细胞的临床应用埋下隐患。
发明内容
本发明的目的就在于解决冻存脐血提取单个核过程中出现的问题以及优选出合适的血清替代物替代冻存脐血NK培养中引入的动物源血清。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种无血清培养冻存脐血NK细胞的方法，包括以下操作步骤：
(1)采用冻存脐血单个核分离试剂盒从冻存脐带血中提取单个核细胞；
(2)将单个核细胞用NK细胞扩增培养基调整细胞浓度为2×106-4×106/mL后接种于T175细胞培养瓶内，得到细胞悬液；
(3)将上述细胞悬液体积调整至15-30mL，并加入体积分数为10-15％的血清替代物、白细胞介素-2及滋养层细胞，所述血清替代物包括生长因子、粘附因子、荷尔蒙、结合蛋白、维生素、微量矿物元素；
(4)第三天进行换液；
(5)第四天至第七天天进行补液，调整细胞浓度为0.8-1.3×106/mL，并加入体积分数为10-15％的血清替代物、白细胞介素-2；
(6)第八天进行补液，调整细胞浓度为0.8-1.3×106/mL，并加入体积分数为5-10％的血清替代物、白细胞介素-2及滋养层细胞；
(7)第九天至第十三天进行补液，调整细胞浓度为1-1.5×106/mL，并加入体积分数为1-5％的血清替代物、白细胞介素-2；
(8)第十四天至第十八天收取细胞，进行计数，检测。
具体地，采用冻存脐血单个核分离试剂盒从冻存脐带血中提取单个核细胞的具体操作步骤为：
(1)将脐血从液氮中取出后置于37度水浴，解冻脐血；
(2)将脐血放入超净工作台，用50ml注射器将血袋中脐血均分至含脐血洗涤液的两个50ml离心管中，脐血洗涤液补充体积至50ml，离心，吸弃上清，重复上述洗涤步骤一次；
(3)将离心管中细胞沉淀震荡松散，加入脐血重悬液，10ml移液管吹打均匀后转移到新的50ml离心管中；
(4)用脐血重悬液将体积补充至50ml后采用淋巴细胞分离液进行离心处理，吸取白膜层后，再次离心处理，离心结束后，吸弃上清；
(5)用40ml脐血洗涤液重悬细胞，过筛网，取样，计数。
具体地，采用冻存脐血单个核分离试剂盒从冻存脐带血中提取单个核细胞的操作步骤(2)中，离心的转速时间为1200rpm/10min，操作步骤(4)中，第一次离心的转速时间2000rpm/20min，第二次离心的转速时间1800rpm/10min。
一种冻存脐血单个核分离试剂盒，包括含有人血白蛋白、肝素钠和生理盐水的脐血洗涤液，含有羟乙基淀粉和生理盐水的脐血重悬液，含有聚蔗糖的淋巴细胞分离液。
具体地，所述人血白蛋白在脐血洗涤液中添加的体积分数为3％-7％，优选为5％；肝素钠脐血洗涤液中添加的浓度为5单位/ml-20单位/ml，优选为6.25单位/ml。
具体地，羟乙基淀粉在脐血重悬液中添加的质量分数为1％-6％，优选为3％。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种无血清培养冻存脐血NK细胞的方法及试剂盒，通过配制主要成分为人血白蛋白、肝素钠和生理盐水的脐血洗涤液，主要成分为羟乙基淀粉和生理盐水的脐血重悬液，并且采用逐步补液和调整细胞浓度，解决了冻存年限较久脐血在提取单个核过程中会产生絮状沉淀、红细胞大量残留、细胞分层不明显等问题以及冻存脐血NK培养中需要引入动物源血清(FBS)的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种无血清培养冻存脐血NK细胞的方法，包括以下操作步骤：
(1)采用冻存脐血单个核分离试剂盒从冻存脐带血中提取单个核细胞；
(2)将单个核细胞用NK细胞扩增培养基调整细胞浓度为2×106-4×106/mL后接种于T175细胞培养瓶内，得到细胞悬液；
(3)将上述细胞悬液体积调整至15-30mL，并加入体积分数为10-15％的血清替代物、白细胞介素-2及滋养层细胞，所述血清替代物包括生长因子、粘附因子、荷尔蒙、结合蛋白、维生素、微量矿物元素；
(4)第三天进行换液；
(5)第四天至第七天天进行补液，调整细胞浓度为0.8-1.3×106/mL，并加入体积分数为10-15％的血清替代物、白细胞介素-2；
(6)第八天进行补液，调整细胞浓度为0.8-1.3×106/mL，并加入体积分数为5-10％的血清替代物、白细胞介素-2及滋养层细胞；
(7)第九天至第十三天进行补液，调整细胞浓度为1-1.5×106/mL，并加入体积分数为1-5％的血清替代物、白细胞介素-2；
(8)第十四天至第十八天收取细胞，进行计数，检测。
实施例2
采用冻存脐血单个核分离试剂盒从冻存脐带血中提取单个核细胞的具体操作步骤为：
(1)将脐血从液氮中取出后置于37度水浴，解冻脐血；
(2)将脐血放入超净工作台，用50ml注射器将血袋中脐血均分至含脐血洗涤液的两个50ml离心管中，脐血洗涤液补充体积至50ml，离心，吸弃上清，重复上述洗涤步骤一次；
(3)将离心管中细胞沉淀震荡松散，加入脐血重悬液，10ml移液管吹打均匀后转移到新的50ml离心管中；
(4)用脐血重悬液将体积补充至50ml后采用淋巴细胞分离液进行离心处理，吸取白膜层后，再次离心处理，离心结束后，吸弃上清；
(5)用40ml脐血洗涤液重悬细胞，过筛网，取样，计数。
其中步骤(2)中，离心的转速时间为1200rpm/10min，步骤(4)中，第一次离心的转速时间2000rpm/20min，第二次离心的转速时间1800rpm/10min。
其中，冻存脐血单个核分离试剂盒，包括含有人血白蛋白、肝素钠和生理盐水的脐血洗涤液，含有羟乙基淀粉和生理盐水的脐血重悬液，含有聚蔗糖的淋巴细胞分离液。
在本实施例中，人血白蛋白在脐血洗涤液中添加的体积分数为5％，；肝素钠脐血洗涤液中添加的浓度为6.25单位/ml。
在本实施例中，羟乙基淀粉在脐血重悬液中添加的质量分数为3％。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (6)

1.一种无血清培养冻存脐血NK细胞的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)采用冻存脐血单个核分离试剂盒从冻存脐带血中提取单个核细胞；
(2)将单个核细胞用NK细胞扩增培养基调整细胞浓度为2×106-4×106/mL后接种于T175细胞培养瓶内，得到细胞悬液；
(3)将上述细胞悬液体积调整至15-30mL，并加入体积分数为10-15％的血清替代物、白细胞介素-2及滋养层细胞，所述血清替代物包括生长因子、粘附因子、荷尔蒙、结合蛋白、维生素、微量矿物元素；
(4)第三天进行换液；
(5)第四天至第七天天进行补液，调整细胞浓度为0.8-1.3×106/mL，并加入体积分数为10-15％的血清替代物、白细胞介素-2；
(6)第八天进行补液，调整细胞浓度为0.8-1.3×106/mL，并加入体积分数为5-10％的血清替代物、白细胞介素-2及滋养层细胞；
(7)第九天至第十三天进行补液，调整细胞浓度为1-1.5×106/mL，并加入体积分数为1-5％的血清替代物、白细胞介素-2；
(8)第十四天至第十八天收取细胞，进行计数，检测。
2.根据权利要求1所述的一种无血清培养冻存脐血NK细胞的方法，其特征在于，采用冻存脐血单个核分离试剂盒从冻存脐带血中提取单个核细胞的具体操作步骤为：
(1)将脐血从液氮中取出后置于37度水浴，解冻脐血；
(2)将脐血放入超净工作台，用50ml注射器将血袋中脐血均分至含脐血洗涤液的两个50ml离心管中，脐血洗涤液补充体积至50ml，离心，吸弃上清，重复上述洗涤步骤一次；
(3)将离心管中细胞沉淀震荡松散，加入脐血重悬液，10ml移液管吹打均匀后转移到新的50ml离心管中；
(4)用脐血重悬液将体积补充至50ml后采用淋巴细胞分离液进行离心处理，吸取白膜层后，再次离心处理，离心结束后，吸弃上清；
(5)用40ml脐血洗涤液重悬细胞，过筛网，取样，计数。
3.根据权利要求2所述一种无血清培养冻存脐血NK细胞的方法，其特征在于，采用冻存脐血单个核分离试剂盒从冻存脐带血中提取单个核细胞的操作步骤(2)中，离心的转速时间为1200rpm/10min，操作步骤(4)中，第一次离心的转速时间2000rpm/20min，第二次离心的转速时间1800rpm/10min。
4.一种冻存脐血单个核分离试剂盒，其特征在于，包括含有人血白蛋白、肝素钠和生理盐水的脐血洗涤液，含有羟乙基淀粉和生理盐水的脐血重悬液，含有聚蔗糖的淋巴细胞分离液。
5.根据权利要求4所述的一种冻存脐血单个核分离试剂盒，其特征在于，所述人血白蛋白在脐血洗涤液中添加的体积分数为3％-7％，优选为5％；肝素钠脐血洗涤液中添加的浓度为5单位/ml-20单位/ml，优选为6.25单位/ml。
6.根据权利要求4所述的一种冻存脐血单个核分离试剂盒，其特征在于，羟乙基淀粉在脐血重悬液中添加的质量分数为1％-6％，优选为3％。
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