CN104774805A - 一种分离骨髓单个核细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离骨髓单个核细胞的方法。所述方法利用明胶溶液可以破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉积，对其他主成分包括单个核细胞无影响这一点以及骨髓中单个核细胞与其他成分存在密度差异，利用淋巴细胞分离液作密度梯度离心时各种细胞成分按密度梯度重新分布聚集，从而获得单个核细胞这一原理进行骨髓中单个核细胞的分离。利用本发明的方法分离骨髓单个核细胞不会增加MNCs的损失，且能更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞，操作简单方便，可进行临床推广。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离骨髓单个核细胞的方法。
背景技术
骨髓中单个核细胞包括造血干细胞(HSC)、骨髓间充质干细(MSCs)、内皮细胞(EPC)、和基质细胞等多种细胞的混合体。就目前而言，骨髓单个核细胞中的造血干细胞已用于移植术并大量运用于临床治疗各种血液疾病且取得了很好的疗效。近年来大量实验研究证明骨髓中也含有一定数量的骨髓间充质干细胞(BMSCs)，所述骨髓间充质干细胞是指一群可向成骨细胞、成脂细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞，具有以下优点：(1)体外易获得、易分离培养，增殖快；(2)具有独特的免疫学特性：不表达MHC II类分子和共刺激分子B7-1、B7-2，故不能刺激机体产生免疫反应；将BMSCs输入体内之后不会被排斥，可以在宿主体内长期存活；(3)具有诱导免疫耐受的潜力；(4)易于基因操作，组织相容性好；(5)不受伦理学限制。因此，BMSCs成为近年来细胞治疗和细胞工程中的首选种子细胞，有着广阔的应用前景。其阳性表面标志为SH-2、CD44+、CD71+、CD90、和CD106，目前认为典型标记为CD44+、CD71+。目前用于分离骨髓间充质干细胞的方法有：贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。由于流式细胞仪法对细胞损伤较大，免疫磁珠法价格相对较高，因此现实中多采用密度梯度离心法和贴壁筛选法结合使用，以提高所得BMSCS的纯度。
但目前对骨髓单个核细胞的分离方法报道还不多，国内外常用的方法为Ficoll一步法。由于应用此方法离心后部分红细胞仍悬浮于Ficoll溶液中致使收集的MNCs可能混杂红细胞，不利于MNCs收集。因而寻找一种更为简便高效的MNCs分离培养方法具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，设计研发一种新型分离骨髓单个核细胞的方法。所述方法利用明胶溶液可以破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉积，对其他主成分包括单个核细胞无影响这一点以及骨髓中单个核细胞与其他成分存在密度差异，利用淋巴细胞分离液作密度梯度离心时各种细胞成分按密度梯度重新分布聚集，从而获得单个核细胞这一原理进行骨髓中单个核细胞的分离。利用本方法分离骨髓单个核细胞不会增加MNCs的损失，且能更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞，操作简单方便，可进行临床推广。
本发明提供一种分离骨髓单个核细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1；取骨髓液与明胶混匀，自然沉降一段时间。
步骤2：取步骤1中得到的明胶悬液层进行离心分离操作，弃去上清液，加入PRMI1640培养液重悬细胞。
步骤3：取步骤2中得到的重悬细胞液与低糖DMEM培养液混匀，缓慢加入到Ficoll溶液表面，室温下进行离心分离操作。
步骤4：离心完毕后，小心吸取步骤3中得到的混悬液中层云雾状细胞层，用PBS洗涤后进行离心分离操作，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液配成一定浓度的悬液，即得。
进一步地说，所述步骤1中的明胶的质量百分比为3％，骨髓液与明胶的体积比为1∶1，沉降时间为1h。
进一步地说，所述步骤2中的离心分离操作参数为取350g明胶悬液层离心分离8min。
进一步地说，所述步骤3中的重悬细胞液与低糖DMEM培养液及Ficoll溶液的体积比为1∶1∶2，离心分离操作参数为取800g上述混悬液离心分离20min。
进一步地说，所述步骤4中的用PBS洗涤次数为2～3次，离心分离操作参数为取上述用PBS洗涤后的混悬液中层云雾状细胞层600g离心分离5min，配制悬液浓度为1×106个/ml。
本发明的有益效果在于：利用本发明的方法分离骨髓单个核细胞不会增加MNCs的损失，且能更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞，操作简单方便，可进行临床推广。
具体实施方式
本发明提供一种分离骨髓单个核细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1：取骨髓液与明胶混匀，自然沉降一段时间。
步骤2：取步骤1中得到的明胶悬液层进行离心分离操作，弃去上清液，加入PRMI1640培养液重悬细胞。
步骤3：取步骤2中得到的重悬细胞液与低糖DMEM培养液混匀，缓慢加入到Ficoll溶液表面，室温下进行离心分离操作。
步骤4：离心完毕后，小心吸取步骤3中得到的混悬液中层云雾状细胞层，用PBS洗涤后进行离心分离操作，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液配成一定浓度的悬液，即得。
进一步地说，所述步骤1中的明胶的质量百分比为3％，骨髓液与明胶的体积比为1∶1，沉降时间为1h。
进一步地说，所述步骤2中的离心分离操作参数为取350g明胶悬液层离心分离8min。
进一步地说，所述步骤3中的重悬细胞液与低糖DMEM培养液及Ficoll溶液的体积比为1∶1∶2，离心分离操作参数为取800g上述混悬液离心分离20min。
进一步地说，所述步骤4中的用PBS洗涤次数为2～3次，离心分离操作参数为取上述用PBS洗涤后的混悬液中层云雾状细胞层600g离心分离5min，配制悬液浓度为1×106个/ml。
下文将结合具体实施例对本发明进行详细描述。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
标本来源：选择健康志愿者30人，男15人，女15人。年龄25～45岁。无菌条件下行髂后上嵴抽取骨髓液40mL，肝素抗凝。标本采集后立即分离MNCs。
实施例1
Ficoll一步法分离MNCs
取骨髓液20mL与等量的低糖DMEM培养液(购买于美国invitrogen公司)混合。混合均匀后，缓慢加入到等量的Ficoll溶液液面上。室温下进行离心分离(离心分离操作参数为800g，20min)。离心分离完毕后，小心吸取中层云雾状细胞层，用PBS洗两次后再次进行离心分离(离心分离操作参数为600g，5min)。以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液配成浓度为1×106mmol/L的悬液备用，然后作MNCs计数及采用台盼蓝拒染法检测其活力。
实施例2
明胶-Ficoll两步法分离MNCs
取20mL骨髓液与等量3％明胶(购买于美国SIGMA公司)混匀后自然沉降1h，取明胶悬液层进行离心分离(离心分离操作参数为350g，8min)，弃去上清液，加入PRMI1640培养液(购买于美国Hyclone公司)重悬细胞，然后参照Ficoll一步法分离MNCs。
实施例3
流式细胞术检测MNCs表面CD34+和CD44+/CD71+
取MNCs悬液2mL离心洗涤2次，用PBS调整浓度至5×106个/ml，取上述细胞悬液100uL，分别加入相应抗体后，避光4℃孵育30min。
所述抗体加入量如下表：
表1 加入的抗体名称及其含量
孵育完毕后，用PBS洗涤细胞2遍后进行离心分离(离心分离操作参数为600g，5min)。重悬细胞于400μL PBS中，400目筛网过滤，进行流式细胞检测，使用CELLQUEST软件采集数据。
实施例4
统计学处理
采用SPASS11.5统计软件做配对t检验。
实施例5
Ficoll一步法分离MNCs和明胶-Ficoll两步法分离MNCs结果如下表所示：
表2 MNCs分离效率及细胞活力(x±s)
表3 两种方法获得MNCs的表面标记(％)
如表2和表3所示，Ficoll一步法分离MNCs和明胶-Ficoll两步法分离MNCs的分离效率、细胞活力无统计学差异，但是二者分离所得的MNCs表达CD34+的细胞数和CD44+/CD71+的细胞数有统计学差异，结果表示，明胶-Ficoll两步法分离所得的MNCs表达CD34+的细胞数和CD44+/CD71+的细胞数高于Ficoll一步法。
本发明所述方法利用明胶溶液可以破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉积，对其他主成分包括单个核细胞无影响这一点以及骨髓中单个核细胞与其他成分存在密度差异，利用淋巴细胞分离液作密度梯度离心时各种细胞成分按密度梯度重新分布聚集，从而获得单个核细胞这一原理进行骨髓中单个核细胞的分离。利用本发明的方法分离骨髓单个核细胞不会增加MNCs的损失，且能更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞，操作简单方便，可进行临床推广。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
Claims (5)
1.一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取骨髓液与明胶混匀，自然沉降一段时间；
步骤2：取步骤1中得到的明胶悬液层进行离心分离操作，弃去上清液，加入PRMI1640培养液重悬细胞；
步骤3：取步骤2中得到的重悬细胞液与低糖DMEM培养液混匀，缓慢加入到Ficoll溶液表面，室温下进行离心分离操作；
步骤4：离心完毕后，小心吸取步骤3中得到的混悬液中层云雾状细胞层，用PBS洗涤后进行离心分离操作，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液配成一定浓度的悬液，即得。
2.如权利要求1所述的一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，所述步骤1中的明胶的质量百分比为3％，骨髓液与明胶的体积比为1∶1，沉降时间为1h。
3.如权利要求1所述的一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，所述步骤2中的离心分离操作参数为取350g明胶悬液层离心分离8min。
4.如权利要求1所述的一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，所述步骤3中的重悬细胞液与低糖DMEM培养液及Ficoll溶液的体积比为1∶1∶2，离心分离操作参数为取800g上述混悬液离心分离20min。
5.如权利要求1所述的一种分离骨髓单个核细胞的方法，其特征在于，所述步骤4中的用PBS洗涤次数为2～3次，离心分离操作参数为取上述用PBS洗涤后的混悬液中层云雾状细胞层600g离心分离5min，配制悬液浓度为1×106个/ml。
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2015
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