CN105112373A - 一种溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其包括：1)取外周血加入离心管中，离心去除富血小板血浆液层；2)加入浓度为3％的明胶生理盐水溶液，对沉淀细胞进行重悬；自然沉淀，收集明胶悬液层，并离心弃上液；3)往离心管中加入无血清培养基再次重悬细胞；4)将重悬细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，离心并将白雾状细胞层转移；5)对白雾状细胞层进行离心，除上清，再加入PBS溶液洗涤三次，加入无血清AIM-V培养基配置成悬液。本发明先采用低的离心力对外周血进行离心，保证去除的上层清液中含有尽可能多的血小板。同时，又通过加入明胶生理盐水溶液，对破碎的红细胞加速沉淀，大大降低红细胞残留。
Description
技术领域本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法。
背景技术溶血性贫血(hemolyticanemia，HA)，指红细胞破坏加速，而骨髓造血功能代偿不足时发生的一类贫血。溶血(hemolysis)是红细胞遭到破坏，寿命缩短的过程。骨髓具有正常造血6～8倍的代偿能力，当溶血超过骨髓的代偿能力，引起的贫血即为溶血性贫血；当溶血发生而骨髓能够代偿时，可无贫血，称为溶血状态(hemolyticstate)。溶血性贫血的根本原因是红细胞寿命缩短，而造成红细胞破坏加速的原因可概括为两个方面：红细胞本身的内在缺陷和红细胞外部因素异常。前者多为遗传性溶血，后者引起获得性溶血。其中，红细胞内在缺陷主要包括红细胞膜缺陷、红细胞酶缺陷、珠蛋白异常等。红细胞外部因素异常主要包括免疫性因素、非免疫性因素。溶血性贫血的临床表现主要与溶血过程持续的时间和溶血的严重程度有关。
目前单核细胞分离技术，多采用Ficoll-Hypaque(d＝1.077)分层法：即聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分层法；主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖(商品名为Ficoll)，分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺(urografin)以增加密度。国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适的分层液。分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076～1.090之间。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或磷酸盐缓冲液PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％。
但是现有的淋巴细胞分离技术主要针对正常人的静脉血，分离效果较好。但是对溶血性贫血患者，分离效果较差，常混有大量破碎红细胞和血小板，导致后期淋巴细胞质量不高，后期扩大培养很难。
发明内容为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种分离效果好，破碎的红细胞和血小板基本不残留的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法。
本发明的技术方案为：一种溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，所述分离方法包括以下步骤：
1)取溶血性贫血患者外周血加入离心管中，低速离心，共分为三层，将顶层的富血小板血浆液面层除去；
2)往离心管中加入浓度为3％明胶生理盐水溶液，对沉淀细胞进行重悬；
3)将重悬的细胞溶液自然沉淀60-70min，收集离心管中的明胶悬液层，并离心弃去上层清液；
4)往离心管中加入无血清培养基再次重悬细胞；
5)将重悬的细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，离心并将离心管中层白雾状细胞层转移到新的离心管中；
6)对白雾状细胞层进行离心，除上清，再加入PBS溶液，重悬洗涤，重复两次，加入无血清AIM-V培养基配置成悬液备用。
本发明中，先对溶血性贫血患者外周血进行低速离心，去除上层的血小板，然后往底部沉淀的红细胞和淋巴细胞液中加入3％明胶生理盐水溶液自然沉淀，从而进一步去除红细胞。将经前面步骤预处理过的细胞悬液，再通过步骤4和步骤5的再次分离，除去明胶、淋巴细胞分离液等溶液，从而达到提高分离效果，避免血小板和红细胞残留的目的。
进一步，所述步骤1)具体为：取溶血性贫血患者外周血加入离心管中，20℃，200×g离心10-20min，溶液共分为三层，将顶层的富血小板血浆液面层除去。本发明中，通过较低离心力200×g进行离心，使得红细胞和淋巴细胞沉淀的同时，保证上层清液中含有尽可能多的血小板，达到高效去除血小板的目的。
所述步骤2)中，加入的明胶生理盐水溶液和中间液面层的总体积与离心管底部沉淀层的体积比例为2-2.5:1。通过加入明胶生理盐水溶液，可破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉淀，对破碎的红细胞具有同样的加速沉淀效果，同时对淋巴细胞无影响。所以，本发明中加入3％明胶生理盐水溶液可大大降低红细胞残留。
进一步，所述步骤3)中，先在20℃下，将重悬的细胞溶液自然沉淀60-70min，收集离心管中的明胶悬液层，然后将明胶悬液层在200×g的离心力下离心10min，弃去上层清液。
进一步，所述步骤5)具体为：另一离心管中预先装入淋巴分离液，再将重悬的细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，重悬的细胞悬液和淋巴细胞分离液体积比为1-2：1，然后400×g离心30～40min，用吸管吸取离心管中的中层白雾状细胞层转移到新的离心管中。由于淋巴细胞分离液Ficoll密度为1.077±0.001，单核细胞密度为1.076～1.090，两者密度最为接近，单核细胞密集在血浆层和淋巴细胞分离液层的界面中，呈白雾状。
所述步骤6)具体为：所述白雾状细胞层450×g离心10min后去除上层清液，再加入PBS溶液，重悬洗涤，重复两次，加入无血清AIM-V培养基配置成悬液。
本发明的有益效果为：本发明先采用低的离心力对外周血进行离心，使得红细胞和淋巴细胞沉淀的同时，保证上层清液中含有尽可能多的血小板，达到高效去除血小板的目的。同时，又通过加入明胶生理盐水溶液，可破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉淀，对破碎的红细胞具有同样的加速沉淀效果，同时对淋巴细胞无影响，从而大大降低红细胞残留。最后，通过无血清培养基和淋巴细胞分离液再进行一次分离，保证分离的单核细胞基本无红细胞和血小板残留，便于后期单核细胞的扩大培养。
具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
本发明提供一种溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，所述分离方法包括以下步骤：
1)取溶血性贫血患者外周血加入离心管中，低速离心，共分为三层，将顶层的富血小板血浆液面层除去；
2)往离心管中加入浓度为3％明胶生理盐水溶液，对沉淀细胞进行重悬；
3)将重悬的细胞溶液自然沉淀60-70min，收集离心管中的明胶悬液层，并离心弃去上层清液；
4)往离心管中加入无血清培养基再次重悬细胞；
5)将重悬的细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，离心并将离心管中层白雾状细胞层转移到新的离心管中；
6)对白雾状细胞层进行离心，除上清，再加入PBS溶液，重悬洗涤，重复两次，加入无血清AIM-V培养基配置成悬液备用。
本发明中，先对溶血性贫血患者外周血进行离心，去除上层的血小板，然后往底部沉淀的红细胞和淋巴细胞液中加入3％明胶生理盐水溶液自然沉淀，从而进一步去除红细胞。将经前面步骤预处理过的细胞悬液，再通过步骤4和步骤5的再次分离，去除明胶、淋巴细胞分离液等溶液，从而达到提高分离效果，避免血小板和红细胞残留的目的。
下面，对本发明的分离方法进行更为详细的说明。
步骤1)：取溶血性贫血患者外周血加入离心管中，20℃，200×g离心10-20min，共分为三层，将顶层的富血小板血浆液面层除去。本发明中，通过较低离心力200×g进行离心，使得红细胞和淋巴细胞沉淀的同时，保证上层清液中含有尽可能多的血小板，达到高效去除血小板的目的。
步骤2)：往离心管中加入浓度为3％明胶生理盐水溶液，对沉淀细胞进行重悬；加入的明胶生理盐水溶液和中间液面层的总体积与离心管底部沉淀层的体积比例为2-2.5:1。通过加入明胶生理盐水溶液，可破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉淀，对破碎的红细胞具有同样的加速沉淀效果，同时对淋巴细胞无影响。所以，本发明中加入3％明胶生理盐水溶液可大大降低红细胞残留。进一步，因明胶生理盐水溶液让红细胞沉淀，淋巴细胞不会产生沉淀，通过对沉淀细胞进行重悬，可保留尽可能多的淋巴细胞。
步骤3)：先在20℃下，将重悬的细胞溶液自然沉淀60-70min，收集离心管中的明胶悬液层，然后将明胶悬液层在200×g的离心力下离心10min，弃去上层清液。
步骤4)：往离心管中加入无血清AIM-V培养基重悬细胞；
步骤5)：另一离心管中预先装入淋巴分离液，再将重悬的细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，重悬的细胞悬液和淋巴细胞分离液体积比为1-2：1，然后400×g离心30～40min，用吸管吸取离心管中的中层白雾状细胞层转移到新的离心管中。由于淋巴细胞分离液Ficoll密度为1.077±0.001，单核细胞密度为1.076～1.090，两者密度最为接近，所以单核细胞密集在血浆层和淋巴细胞分离液层的界面中，呈白雾状。
通过步骤4)和步骤5)的再次重悬分离，可去除明胶、淋巴细胞分离液等溶液。
步骤6)：所述白雾状细胞层采用450×g离心10min，去除上层清液；再加入PBS溶液，重悬洗涤，重复洗涤两次，然后加入无血清AIM-V培养基配置成悬液备用。
实施例1
步骤1)：取溶血性贫血患者外周血80mL，各20mL平均分装到4个50mL离心管中，20℃，200×g离心10min，溶液共分为三层，将顶层的富血小板血浆液面层除去。
步骤2)：往离心管中加入浓度为3％明胶生理盐水溶液，对沉淀细胞进行重悬；加入的明胶生理盐水溶液和中间液面层的总体积与离心管底部沉淀层的体积比例为2:1。
步骤3)：先在20℃下，将重悬的细胞溶液自然沉淀60min，收集离心管中的明胶悬液层，每两根50mL离心管中的明胶悬液层转移到新的离心管中，然后将明胶悬液层在200×g的离心力下离心10min，弃去上层清液。
步骤4)：往离心管中加入无血清AIM-V培养基重悬细胞；
步骤5)：另一离心管中预先装入淋巴分离液，再将重悬的细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，重悬的细胞悬液和淋巴细胞分离液体积比为1：1，然后400×g离心30min，用吸管吸取离心管中的中层白雾状细胞层转移到新的离心管中。
步骤6)：所述白雾状细胞层采用450×g离心10min，去除上层清液；再加入PBS溶液，重悬，再离心；重复PBS溶液洗涤两次，然后加入无血清AIM-V培养基配置成悬液以备后续单核细胞的扩大培养使用。
实施例2
作为对照实验，采用传统方法分离溶血性贫血患者外周血单核细胞，包括以下步骤：取溶血性贫血患者新鲜的外周血80mL，与等量无血清AIM-V培养基混合，混合后缓慢加入到等体积的淋巴分离液Ficoll液面上，室温进行离心分离，800×g离心20min。离心完毕后，吸取中层白雾状细胞层，磷酸盐缓冲液PBS洗涤两次，600×g离心5min去除上层清液，加入无血清AIM-V培养基，将离心管中的单核细胞配置悬液，体积和实施例1一致。
实施例1和实施例2配置的单核细胞悬液相关性能指标检测对比
1、用于MNCs计数，具体数据见表1。
2、采用台盼蓝拒染法测单核细胞活力，检测数据见表1。
表1实施例1和实施例2采用MNCs计数及台盼蓝拒染法测单核细胞活力数据对比
| 分离方法 | MNCS(106个/mL) | 细胞活力(％) |
| 实施例1 | 90.5±14.3 | 91±1.3 |
| 实施例2 | 93.2±20.6 | 85±2.5 |
表1中的数据表明，实施例1和实施例2两种方法分离得到的单个核细胞的数量相差不大，实施例1虽然少于实施例2，但是不具有显著性；在细胞活力方面，实施例1高于实施例2，说明采用实施例1的分离方法得到的单个核细胞存在的破碎红细胞数量少。
Claims (6)
1.一种溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述分离方法包括以下步骤：
1)取溶血性贫血患者外周血加入离心管中，低速离心，溶液分为三层，将顶层的富血小板血浆液面层除去；
2)往离心管中加入浓度为3％的明胶生理盐水溶液，对沉淀细胞进行重悬；
3)将重悬的细胞溶液自然沉淀60-70min，收集离心管中的明胶悬液层，并离心弃去上层清液；
4)往离心管中加入无血清培养基再次重悬细胞；
5)将重悬的细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，离心并将离心管中层白雾状细胞层转移到新的离心管中；
6)对白雾状细胞层进行离心，除上清，再加入PBS溶液，重悬洗涤，重复两次，加入无血清AIM-V培养基配置成悬液。
2.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：取溶血性贫血患者外周血加入离心管中，20℃，200×g离心10-20min，溶液分为三层，将顶层的富血小板血浆液面层除去。
3.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤2)中，加入的明胶生理盐水溶液和中间液面层的总体积与离心管底部沉淀层的体积比例为2-2.5:1。
4.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤3)中，先在20℃下，将重悬的细胞溶液自然沉淀60-70min，收集离心管中的明胶悬液层，然后将明胶悬液层在200×g的离心力下离心10min，弃去上层清液。
5.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤5)具体为：另一离心管中预先装入淋巴分离液，再将重悬的细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，重悬的细胞悬液和淋巴细胞分离液体积比为1-2：1，然后400×g离心30～40min，用吸管吸取离心管中的中层白雾状细胞层转移到新的离心管中。
6.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤6)具体为：所述白雾状细胞层450×g离心10min后去除上层清液，再加入PBS溶液，重悬洗涤，重复两次，加入无血清AIM-V培养基配置成悬液。
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