CN106085954A - 一种大量人外周血pbmc快速分离方法 - Google Patents

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钱鹏
赵依妮
许国贞
刘振云
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Abstract

本发明公开了一种大量人外周血PBMC快速分离方法，包括如下步骤：将人外周血转入离心管中离心；吸取灰黄层，向其中加入生理盐水稀释；将得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。本发明对于大量人外周血PBMC分离，不仅可减少操作步骤，且节约了操作时间、试剂耗材及试剂用量，有利于PBMC的分离和细胞的活率。

Description

一种大量人外周血PBMC快速分离方法
技术领域
本发明涉及外周血PBMC分离技术领域，尤其涉及一种大量人外周血PBMC快速分离方法。
背景技术
自体免疫T细胞技术，是指从患者的外周血中分离出T细胞，通过体外培养、扩增、制剂，回输患者体内，诱导人体自身产生免疫应答。目前T细胞的获得主要来源于人外周血PBMC，主要的分离方法是将人外周血直接与PBS等量混合，然后加入淋巴分离液进行梯度分离，最后获得PBMC。这种方法对血量少的样本来说尚可操作，但是对于大量的血量时(＞100ML)，分离方法繁琐，操作时间较长，不利于PBMC的分离和细胞的活率。
发明内容
本发明提出了一种大量人外周血PBMC快速分离方法，对于大量人外周血PBMC分离，不仅可减少操作步骤，且节约了操作时间、试剂耗材及试剂用量，有利于PBMC的分离和细胞的活率。
本发明提出的一种大量人外周血PBMC快速分离方法，包括如下步骤：
S1、将人外周血转入离心管中离心；
S2、吸取灰黄层，向其中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。
优选地，离心速度为1200-1800rpm，离心时间为10-20min。
优选地，在S1中，将30-200ml人外周血转入离心管中离心。
优选地，在S1中，将40ml人外周血转入50ml离心管中离心。
优选地，在S2中，除去上层血浆后，继续吸取灰黄层，向灰黄层中加入生理盐水稀释。
优选地，在S2中，吸取5-8ml灰黄层至50ml离心管中，加入生理盐水稀释至体积为25ml。
优选地，在S3中，吸取20-30ml S2得到的产物，加入到含有15-30ml淋巴细胞分离液的离心管中。
优选地，在S3中，吸取25ml S2得到的产物，加入到含有20ml淋巴细胞分离液的离心管中。
优选地，离心速度为1500-1800rpm，离心时间为10-30min。
本发明中，可快速获取大量血量PBMC中T细胞，操作简便；通过将大量人外周血离心后，只吸取血浆和红细胞之间的一层灰黄层细胞，然后用生理盐水稀释，最后进行密度梯度分离，不仅可减少操作步骤，且节约了操作时间、试剂耗材及试剂用量。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种大量人外周血PBMC快速分离方法，包括如下步骤：
S1、将人外周血送入离心管中离心；
S2、吸取灰黄层，向其中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。
实施例2
一种大量人外周血PBMC快速分离方法，包括如下步骤：
S1、将30ml人外周血送入离心管中离心，离心速度为1800rpm，离心时间为10min；
S2、除去上层血浆后，吸取灰黄层，向其中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。
实施例3
一种大量人外周血PBMC快速分离方法，包括如下步骤：
S1、将180ml人外周血送入离心管中离心，离心速度为1800rpm，离心时间为10min；
S2、除去上层血浆后，吸取灰黄层，向其中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。
实施例4
一种大量人外周血PBMC快速分离方法，包括如下步骤：
S1、将200ml人外周血转入离心管中离心，离心速度为1200rpm，离心时间为20min；
S2、除去上层血浆后，吸取灰黄层，向其中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。
实施例5
一种大量人外周血PBMC快速分离方法，包括如下步骤：
S1、将40ml人外周血送入50ml离心管中离心，离心速度为1500rpm，离心时间为16min；
S2、吸取5ml灰黄层至50ml离心管中，加入生理盐水稀释至体积为25ml；
S3、将30ml S2得到的产物送入含有15ml淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，离心速度为1500rpm，离心时间为30min，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。
实施例6
一种大量人外周血PBMC快速分离方法，包括如下步骤：
S1、将40ml人外周血送入50ml离心管中离心，离心速度为1600rpm，离心时间为14min；
S2、吸取8ml灰黄层至50ml离心管中，加入生理盐水稀释至体积为25ml，剩余灰黄层按上述步骤稀释处理；
S3、将20ml S2得到的产物送入含有30ml淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，离心速度为1800rpm，离心时间为10min，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。
实施例7
一种大量人外周血PBMC快速分离方法，包括如下步骤：
S1、将40ml人外周血送入50ml离心管中离心，离心速度为1500rpm，离心时间为15min；
S2、吸取6ml灰黄层至50ml离心管中，加入生理盐水稀释至体积为25ml，剩余灰黄层按上述步骤稀释处理；
S3、将25ml S2得到的产物送入含有20ml淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，离心速度为1600rpm，离心时间为20min，剩余S2得到的产物按上述步骤离心处理；吸取中间白膜层至50ml离心管中，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。
将采用实施例7的方法与普通方法对比，其中普通方法为将人外周血直接与PBS等量混合，然后加入淋巴分离液进行梯度分离，最后获得PBMC。
将两者使用的淋巴分离液的使用量、移液管数量、离心管数量、操作时间进行对比，测试结果如下表1所示：
表1本发明方法与普通方法测试结果对比表
本发明可节约大量的淋巴分离液，用本方法只需要60ml的淋巴分离液，而传统的方法却需要近280mL淋巴分离液；节约近2/3的耗材，如离心管、吸管等；相比传统的方法节约大量的时间。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种大量人外周血PBMC快速分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将人外周血转入离心管中离心；
S2、吸取灰黄层，向其中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到PBMC。
2.根据权利要求1所述的大量人外周血PBMC快速分离方法，其特征在于，离心速度为1200-1800rpm，离心时间为10-20min。
3.根据权利要求1所述的大量人外周血PBMC快速分离方法，其特征在于，在S1中，将30-200ml人外周血转入离心管中离心。
4.根据权利要求3所述的大量人外周血PBMC快速分离方法，其特征在于，在S1中，将40ml人外周血转入50ml离心管中离心。
5.根据权利要求4所述的大量人外周血PBMC快速分离方法，其特征在于，在S2中，除去上层血浆后，吸取灰黄层，向灰黄层中加入生理盐水稀释。
6.根据权利要求4所述的大量人外周血PBMC快速分离方法，其特征在于，在S2中，吸取5-8ml灰黄层至50ml离心管中，加入生理盐水稀释至体积为25ml。
7.根据权利要求4所述的大量人外周血PBMC快速分离方法，其特征在于，在S3中，吸取20-30ml S2得到的产物，加入到含有15-30ml淋巴细胞分离液的离心管中。
8.根据权利要求7所述的大量人外周血PBMC快速分离方法，其特征在于，在S3中，吸取25ml S2得到的产物，加入到含有20ml淋巴细胞分离液的离心管中。
9.根据权利要求1所述的大量人外周血PBMC快速分离方法，其特征在于，离心速度为1500-1800rpm，离心时间为10-30min。
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