CN104357395A - 从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人类胃癌组织单细胞悬液制备及利用新型免疫磁珠高效分选单核细胞性骨髓来源抑制细胞的方法。分选方法包括：机械法剪碎所取胃癌组织；使用特殊的200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元获取单细胞悬液；使用Ficoll-Paque双层梯度密度离心法纯化单细胞悬液；运用新型CD14+正选免疫磁珠分选人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞，并通过功能学实验验证所获单核样骨髓来源免疫抑制细胞通过抑制T细胞免疫，参与人类胃癌免疫逃避机制。本发明提供一种高效的免疫分选方法；率先从人类胃癌中分选出单核样骨髓来源免疫抑制细胞并证实其免疫抑制功能，为胃癌以及多种人类肿瘤的研究提供了新的依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种胃癌组织单细胞悬液制备方法及利用新型免疫磁珠高效分选单细胞悬液中单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法。
背景技术
骨髓来源免疫抑制细胞(MDSC)是一群未成熟的骨髓细胞，从其首次被报道至今，越来越多的研究表明此群细胞在肿瘤的免疫逃避机制中起到了重要的作用。在正常人群中，骨髓细胞在正常生理条件下分化成为前体粒细胞，前体单核细胞，并最终分化成为成熟的粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞。然而在肿瘤等病理条件下，骨髓细胞无法正常分化为成熟细胞，而分化为具有免疫抑制功能的一群细胞，也就是骨髓来源免疫抑制细胞(MDSC)，研究表明，该群细胞根据其特异性表形及功能学特点可分为粒细胞样骨髓来源免疫抑制细胞及单核样骨髓来源免疫抑制细胞。
骨髓来源免疫抑制细胞(MDSC)主要通过多种途径抑制T细胞的激活与增殖，从而产生免疫抑制的作用。在此过程中粒细胞样和单核细胞样骨髓来源免疫抑制细胞是通过不同的机制抑制T细胞的免疫功能的。目前的研究认为根据CD14的表达差异，MDSC可分为两个亚群：一群为表达CD14分子的单核样骨髓来源免疫抑制细胞，另一亚群为不表达CD14分子，但表达CD15的粒细胞样骨髓来源免疫抑制细 胞。前者被认为是未成熟的骨髓细胞分化停滞于向巨噬细胞和树突状细胞分化的过程中；而后者被认为是未成熟的骨髓细胞分化停滞于向粒细胞分化的过程中，并占骨髓来源免疫抑制细胞总数的大多数。
流式细胞术对细胞的各种参数分析必须基于单细胞的基础上，根据不同实体组织成分的特点可选择不同的分散细胞的方法，以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。实体组织单细胞悬液制备方法主要有酶消化法，机械法和化学处理法。其中机械法分散实体组织与另外两种制备方法相比，操作过程简便，且具有较高的细胞存活率和检测准确性。所得单细胞更适于流式细胞术的开展。
免疫磁珠细胞分选(MACS)是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱试管上，实现对目标阳性细胞分离或阴性细胞的分离纯化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的方案是：采用机械法剪碎人类胃癌组织合并负压抽吸法及梯度密度离心法制备单细胞悬液，再运用CD14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。
本发明提供的一种从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫 抑制细胞的方法，包括以下步骤：
步骤一：机械法剪碎所取人类胃癌标本组织；
步骤二：使用200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元反复操作获取单细胞悬液；
步骤三：使用双层Ficoll-Paque分离液梯度密度离心法分离和纯化所获取的单细胞悬液；
步骤四：采用CD14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。
通过功能学实验将所获得的单核样骨髓来源免疫抑制细胞与正常人外周血CD4+T细胞共培养，进一步证实该群细胞具有抑制T细胞免疫功能，参与人类胃癌免疫逃避机制。
在单细胞悬液的制备操作中使用机械法剪碎法相对研磨法适用于人类胃癌组织标本。
本发明方法包括将CD14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法用于人类胃癌组织单核样骨髓来源免疫抑制细胞的分选及纯化。
本发明的有益效果：使用机械法剪碎人类胃癌细胞组织并通过负压抽吸法制备单细胞悬液，操作简便易行，且在保证单细胞得率高的同时，将操作过程给细胞带来的损伤降到了最低，使细胞维持原有的形态及功能，有利于进一步的科学研究；通过运用新型CD14+阳性选择免疫磁珠分选人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞，操作简便，所获得细胞纯度高；通过功能学研究证实该群细胞具有抑制 人类T细胞免疫，从而促进肿瘤的免疫逃避，为胃癌以及多种人类肿瘤的免疫学研究提供了新的依据。
附图说明
图1是用负压抽吸装置制备单细胞悬液示意图；
其中a是负压抽吸装置中使用的无菌200目尼龙滤网；
b是负压抽吸装置中使用的50ml无菌离心管；
c是负压抽吸装置中使用的50ml无菌注射器；
A操作是通过持续抽吸无菌注射器提供离心管内有效负压；
图2A，2B是通过流式细胞术验证所获人类胃癌组织中分选所得单核样骨髓来源免疫抑制细胞抑制了正常CD4+T细胞IL-2的表达；
图3A，3B是通过流式细胞术验证所获人类胃癌组织中分选所得单核样骨髓来源免疫抑制细胞抑制了正常CD4+T细胞IFN-γ的表达；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明从人类胃癌组织中分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的操作系统包括以下步骤：
(1)机械法剪碎所取人类胃癌标本组织；
(2)使用200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元反复操作获取单细胞悬液；
(3)使用双层Ficoll-Paque分离液梯度密度离心法分离和纯化 所获取的单细胞悬液；
(4)运用新型CD14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。
(5)通过功能学实验将所获得的单核样骨髓来源免疫抑制细胞与正常人外周血CD4+T细胞共培养，进一步证实该群细胞具有抑制T细胞免疫功能，参与人类胃癌免疫逃避机制。
在单细胞悬液的制备操作中使用机械法剪碎法相对研磨法适用于人类胃癌组织标本。
本操作系统包括将新型CD14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法用于人类胃癌组织单核样骨髓来源免疫抑制细胞的分选及纯化。
实施例2
人类胃癌组织中单核样骨髓来源免疫抑制细胞的分选及功能学验证。
1.1肿瘤组织和瘤旁正常组织中提取制作单细胞悬液
(1)直接在手术室内切取癌组织与癌旁组织标本，要求无菌，体积相当。分别放入无菌密闭容器中(无菌PBS液含2％胎牛血清浸泡),及时带回进行处理。
(2)在无菌操作台上，将标本放入无菌器皿，用含两性霉素B(5μg/ml)和双抗(1％)的无菌PBS液冲洗，去除脂肪及坏死组织，然后用含两性霉素B(50μg/ml)、胎牛血清(10％)、双抗(5％)的无菌PBS液浸泡10mins。
(3)在新的无菌器皿中，用无菌剪刀将组织粉碎至细糊状，要求室温下20mins。
(4)用无菌吸管将所得混合液移至含有200目尼龙滤网的负压吸引装置对细胞悬液进行过滤2次，装置及操作如图1；
(5)离心过滤悬液，4℃，1800rpm，6mins
(6)弃上清，无菌PBS重悬，再用无菌滤网过滤2次，离心滤过后的悬液，4℃，1800rpm；6min。
(7)弃上清，15ml无菌PBS液重悬，震荡混匀备用。
注：癌组织与癌旁正常组织均以此法提取实验所需的单细胞悬液
1.2肿瘤组织及瘤旁组织浸润白细胞提取(双层Ficoll-Paque分离液梯度密度离心法)
由于肿瘤组织及瘤旁组织中浸润的各类白细胞与肿瘤细胞的密度不尽相同，因此可用双层Ficoll-Paque分离液梯度密度离心法分离所需白细胞。
(1)取50ml无菌离心管，先加15ml 100％Ficoll-Paque分离液，然后倾斜45°，沿管壁加入15ml 75％Ficoll-Paque分离液,要求界面分层清晰。
(2)加入单细胞悬液，要求界面分层清晰。
(3)匀加减速离心，4℃，1800rpm，20mins。
(4)小心取出离心管，此时明显呈现两个富含细胞界面层：上层为主要肿瘤细胞，下层主要为肿瘤浸润白细胞。
(5)用无菌吸管缓慢吸取下层细胞群，置入20ml无菌离心管， 无菌PBS液重悬，再次离心，4℃，1800rpm,6mins。
(6)弃掉上清液，用含10％胎牛血清的无菌PBS液重悬细胞备用。
1.3人外周血单核细胞(PBMC)提取(Ficoll分离液梯度密度离心法)
(1)取健康人外周血10ml，置入无菌离心管，再加入无菌PBS液10ml，充分混悬。
(2)取50ml无菌离心管，先加10ml 100％Ficoll分离液，然后倾斜45°，沿管壁加入加入上述混悬液20ml，要求界面分层清晰。
(3)匀加减速离心，4℃，1800rpm，20mins。
(4)小心取出离心管，此时离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带：红细胞和白细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状。
(5)用无菌吸管缓慢吸取该层细胞，置入20ml无菌离心管，无菌PBS液重悬，再次离心，4℃，1800rpm,6mins。
(6)弃掉上清液，用含10％胎牛血清的无菌PBS液重悬细胞备用。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上。
2.1免疫磁珠细胞分选
依据上述方法制备备选细胞，根据实验所需细胞不同选用不同的 方案，并用流式细胞仪进行纯度分析。所有操作均需在无菌超净台环境下进行，具体分选操作如下：
2.1.1CD14+单核样细胞分选体系及操作方法：
选择CD14+单核样细胞正选试剂盒分选外周血中CD14+单核样细胞，样品要求：体积100ul-2.5ml,细胞数最好达到2.5×108。步骤如下：
(1)用DMEM培养基重悬使浓度达到1×108/ml，加入无菌流式管(5ml)中。如果浓度低于1×107/ml，重悬成100ul。
(2)加入Cocktail(100ul/ml),充分混匀，室温下(15-25°)孵育15mins。
(3)加入磁珠抗体(50ul/ml)，轻轻翻转5次，充分混匀。室温，10mins。
(4)加入DMEM培养基至2.5ml,混匀细胞，去帽，室温下放置磁铁内，5mins。
(5)拿起磁铁，轻轻倾斜流式管倒掉上清，此时目的细胞贴在管内壁上。
(6)取出流式管，加入2.5mlDMEM培养基，小心轻轻吹打管内壁细胞，混匀后，再放入磁铁内，室温下，5mins。
(7)再次重复步骤5-6-5，重复总共3次后，纯度可达95％，然后取出流式管，培养基重悬细胞，备用。
2.1.2CD4+T细胞分选体系及操作方法
选用CD4+T细胞负选试剂盒进行分选外周血中的CD4+T细胞，样 品要求：体积100ul-2.5ml,细胞数最好达到1×108。
(1)用DMEM培养基重悬使浓度达到5×107/ml。
(2)加入Cocktail(50ul/ml),充分混匀，室温下(15-25°)，10mins。
(3)充分翻转混匀，不要有颗粒聚集。
(4)加入磁珠抗体(100ul/ml)充分混匀，室温下，5mins。
(5)加入DMEM培养基到2.5ml,混匀，去帽后放入磁铁内，室温下，5mins。
(6)拿起磁铁，轻轻倾斜流式管，将含有目的细胞的上清倒入新的5ml无菌流式管中，分选完毕，备用。
2.2胃癌组织和癌旁正常组织来源的CD14+单核样细胞对T细胞免疫抑制能力测定，步骤如下：
(1)如步骤1.1，1.2制备肿瘤组织和癌旁正常组织的单细胞悬液。
(2)如步骤2.1.1分别分选肿瘤组织及癌旁正常组织的CD14+单核样细胞。
(3)如步骤2.1.2分选正常人外周血中CD4+T细胞。
(4)胃癌组织和癌旁正常组织来源的CD14+单核样细胞与正常人外周血来源的CD4+T细胞共培养72h(加入刺激剂anti-CD3 2.5μg/mL，anti-CD28 1.25μg/mL)。
(5)培养完成后，小心留取孔板上清液，-80℃冷冻保存，留作备用。
(6)将目的细胞转入无菌流式管，离心后，培养基重悬，加入终止试剂，放入培养箱4h。
(7)运用流式细胞术检测免疫相关的细胞因子IL-2和IFN-γ的表达，结果显示胃癌组织中的CD14+单核样细胞明显抑制了正常人外周血来源的CD4+T细胞免疫相关因子的表达，结果如图2与图3所示。
本实验步骤证明了人类胃癌组织中单核样骨髓来源免疫抑制细胞具有抑制T细胞免疫，证实了其促进肿瘤免疫逃避的作用。
综上所述，本分选方法首次在人类胃癌组织中，采用机械法剪碎人类胃癌组织合并负压抽吸法及梯度密度离心法制备单细胞悬液，再运用CD14+正选免疫磁珠细胞分选方法获得胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞，并且进一步通过功能学实验证实了该群细胞的抑制CD4+T细胞免疫，促进肿瘤免疫逃逸。
本发明的内容并不只局限于上述人类胃癌实例中，而且可扩展至人类多种实体肿瘤的单核样骨髓来源免疫抑制细胞分选方法中，相关领域内的有识之士可在本发明的指导思想之内提出其他实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (5)
1.一种从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法，包括以下步骤：
步骤一：机械法剪碎所取人类胃癌标本组织；
步骤二：使用200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元反复操作获取单细胞悬液；
步骤三：使用双层Ficoll-Paque分离液梯度密度离心法分离和纯化所获取的单细胞悬液；
步骤四：采用CD14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用机械法获取单细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获取单细胞悬液方法是使用200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在获取目标细胞群体后加入了功能性验证步骤，即T细胞免疫功能抑制实验。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的功能性验证步骤是通过功能学实验将所获得的单核样骨髓来源免疫抑制细胞与正常人外周血CD4+T细胞共培养，进一步证实该群细胞具有抑制T细胞免疫功能及参与人类胃癌免疫逃避机制。
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