CN103505911A

CN103505911A - 一种以手工二次离心法制备富血小板血浆的方法

Info

Publication number: CN103505911A
Application number: CN201310480851.6A
Authority: CN
Inventors: 林子洪; 郑秋坚; 沈梓维
Original assignee: Guangdong General Hospital
Current assignee: Guangdong Weier hospital Co., Ltd.
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2014-01-15

Abstract

本发明属于富血小板血浆制备技术领域，具体公开了一种以手工二次离心法制备富血小板血浆（PRP）的方法。所述方法采用二次离心，第一次将混有抗凝剂的全血25ml以800g的离心力离心6分钟，吸取分层后全血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中；然后进行第二次离心，即以1400g的离心力离心5分钟，吸取分层后的中间层血浆，约4ml，即得富血小板血浆。采用本技术发明制备得到的PRP中血小板浓度为886.33×10⁹/L，血红蛋白量为27.72g/L，足够满足临床治疗需要。

Description

一种以手工二次离心法制备富血小板血浆的方法

技术领域

本发明涉及富血小板血浆的制备方法，具体地，涉及一种以手工二次离心法制备富血小板血浆的方法。

背景技术

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是来源于人体的富集血小板细胞的血浆制品，其血小板细胞浓度标准最初由美国迈阿密大学Marx教授于2001年提出，他认为PRP中血小板浓度应为全血中血小板浓度的5倍以上。但大多研究者制备的PRP很难达到这个标准，而且他们在研究中发现，即使PRP中血小板浓度稍低于这个标准仍然能获得良好的治疗效果。在2011年加拿大学者Drew W.T.提出一个新的标准——PRP中的血小板浓度为全血中血小板浓度的3至5倍，这个标准得到大多数人的认可。

PRP的概念最早于1954年由Kingsley CS在《自然》杂志中提出，而PRP最初被分离制备得到并用于临床是在1977年，当时成功用于心外科手术患者，避免了体外循环期间血小板功能的损伤和术后出血。在1982年，DAVID R. KNIGHTON等人将从兔子自身静脉血分离得到的PRP注入其角膜，发现血小板能促进血管增生、胶原合成，从而使角膜混浊、增厚，结果提示血小板能促进组织增生。自此人们便致力于将PRP应用于临床，期望能解决组织、器官损伤后修复的难题。但由于当时PRP的制作工艺不完善，难以得到符合标准的PRP，因此限制了其临床研究。经过将近10年的探索，到了90年代，才制作出成分较为单一的PRP。从此，PRP在临床中逐渐推广与应用。经过几十年的研究，已探索出几种较为合适的PRP制备方法：手工法（一次离心法、二次离心法和三次离心法）及设备制备法。

已经有文献报道并被广泛认可的一次离心法有Anitua法，在1999年，西班牙Eduardo Anitua博士发明了此法，他当时采集患者10至20mL静脉血，加入5mL的离心管内，以160g离心力离心6分钟，然后弃取上层（贫血小板血浆层）1ml，再吸取剩余上层血浆至下层（红细胞层）1～2mm，这样5mL的静脉血大约可以获取1.2mL的PRP，遗憾的是，他当时并未对所获得的PRP进行成分分析，从而无从得知PRP中的血红蛋白量。

而二次离心法公开发表并被广泛用于研究的方法为Landesberg法。当时Landesberg博士等研究采集3个健康志愿者的静脉血，经以下多种方法离心：第一次离心以100g和200g离心力进行离心2分钟至20分钟，然后吸取血浆层（上层和中层）移至另外一个离心管中，进行第二次离心；第二次离心的离心力为100g、200g、250g及400g，时间为2分钟至10分钟，然后吸取弃去上层血浆，剩余的下层血浆即PRP。结果分析得到：第一次离心得到的上中层血小板浓度为全血的229%是最高的浓度，此时的离心方法为以100g离心力离心10分钟；进行第二次离心时，少于5分钟的离心时间得到的结果与全血中血小板浓度相比没有意义，但时间增加至10分钟时，200g及250g的离心力均能使得到的结果明显高于全血中血小板浓度，且得到最高浓度血小板的离心力为200g，而以400g离心力进行离心时则出现血小板膜的破坏。因此，制备出含有最高浓度血小板的PRP的二次离心方法为采用200g离心力进行离心10分钟，此即Landesberg法。

大多研究都表明：以二次离心法比一次离心法制备的PRP中血小板浓度要高，而在已有文献报道的二次离心法中，有研究者将它们进行了比较，结果认为Landesberg法是一种最优的方法，如袁霆、张长青用4种方法（Aniua法（一次离心160g×6min）、Petrungaro法、Landesberg法、Aghaloo法，后三者为2次离心）进行对照研究，比较不同方法制备的PRP中血小板计数，结果显示Anitua法制备的PRP中血小板计数较另外三种方法低，而最高的为Landesberg法。

目前虽能制备出成分较为单一、浓度达标的PRP，但其制备技术仍未完全成熟。因为从现今几种制备方法的探索过程来看，研究者均是主观地将离心力固定在几种上，如Landesberg法的探索过程，Landesberg博士就将离心力固定在100g、200g、250g及400g这几个上，而未曾对其他离心力进行研究，得出的结论只能是这几种离心力中能制备出血小板浓度最高的离心力。因此，用这种探索方法要想得到很好的离心力与离心时间的组合，必须要有大量的分组作为基础，得出的结论才有更大的说服力。因此，我们有理由怀疑，Landesberg法并非最好的离心方法。

另外，利用手工法制备PRP存在着很大的不稳定性，制备的PRP中血小板浓度的高低与操作者关系密切。目前虽有上市的PRP设备，能稳定地制备出符合标准的PRP，但其价格相当昂贵，在临床应用推广方面受到较大限制，尤其在发展中国家。目前，解决PRP制备问题的方法仍值得进一步探究。

发明内容

本发明为了克服现有手工法制备PRP质量不稳定以及设备套装制备技术成本高的缺陷的问题，提供一种以手工二次离心法制备PRP的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种二次离心法制备富血小板血浆的方法，包括如下步骤：首先，将混有抗凝剂的全血进行第一次离心，第一次离心的条件为800g离心6分钟，第一次离心后，吸取分层后静脉血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中进行第二次离心，第二次离心的条件为1400g离心5分钟，第二次离心结束后，吸取分层后的血浆中的中间层，即得PRP。

第一次离心的目的是为了弃去全血中的血红蛋白，弃去离心后的下层血浆可达到这个目的。即第一次离心应尽可能使全血中的血红蛋白沉降至最下层，但同时又要保证仅有少量血小板被离心沉降至下层，因此第一次离心最佳的方法应使得下层中的血红蛋白量更多而血小板更少。本发明经过创造性的探索发现，以800g离心6分钟是第一次离心的最佳条件。

第二次离心的目的是为了将血小板细胞聚集于中间层，然后吸取中层血浆可得到富含血小板细胞的血浆。采用合适的离心时间和离心力，可以将经过第一次离心提取得到的血液成分中的血小板细胞聚集于中间层，而不损伤血小板。本发明经过创造性的探索发现，以1400g离心5分钟是第二次离心的最佳条件，可以达到这个目的。

优选地，所述抗凝剂为肝素或水蛭素。更优选地，所述抗凝剂为肝素。

优选地，所述肝素在全血中的添加量按照肝素与全血的体积比为0.2：10来确定，所述肝素的浓度为12500单位/2mL。

优选地，所述富血小板血浆的具体制备方法为：将混有0.5mL浓度为12500单位/2mL肝素的25mL全血以800g的离心力离心6分钟，吸取分层后静脉血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中，然后以1400g的离心力离心5分钟，吸取分层后的血浆中的中间层，约4ml，即PRP。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明作为一种手工制备PRP的技术方法，与国外利用设备套装制备的方法相比，具有如下优点：在能制备出高质量PRP的基础上，本发明所述方法的制备成本低，用于临床治疗费用少，易于推广。而上市的PRP设备，单单是制备出PRP就需300～400美元，还未计算患者治疗过程的其他费用，如美国的GenesisCS设备系统的套装价格为1550美元，我国威高公司即将上市的PRP设备系统的套装价格为8000元。本发明专利技术方法已在我院骨科开展，患者整个治疗过程约花费3500元。

（2）本发明作为一种手工二次离心法，与一次离心法相比，具有以下优势：所需的全血少。采用本发明制备PRP所需患者的静脉血液为25mL，最终能得到4mL的PRP；而一次离心法所需的静脉血为50mL，最终仅能得到4mL PRP，造成患者血液的巨大浪费，而且每次治疗均需50mL静脉血液作为制备来源，会导致患者贫血、体质下降等不良反应。

（3）本发明作为一种新的技术方法，与过去传统的二次离心法相比，具有以下优势：制备过程耗时少，采用本发明所述方法制备PRP时所需的时间为11分钟（6分钟和5分钟），而Landesberg法耗时20分钟（2次均为10分钟）。纯度高，采用本技术发明制备得到的PRP中血红蛋白量为27.72g/L(95%置信区间为（18.41,37.03)），采用Landesberg法制备得到的PRP中HGB均值59.533/L（95%置信区间为（46.48,72.59））。

说明书附图

图1. 经过第一次离心后，各种离心方法使得沉降至下层中的血红蛋白量及血小板浓度均值的曲线图。

图2. 经过第二次离心后，各种离心方法获得的PRP中的血红蛋白量及血小板浓度均值的线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

因为制备得到的富血小板血浆（PRP）最终要用回至人体，所以，制备PRP的全过程需严格无菌。

实施例1

S1. 材料与方法

主要仪器设备及试剂：eppendorf5702离心机，离心管，EDTA采血管，注射器，肝素钠，全自动血细胞分析仪。

S2. 实验对象：拟自愿接受PRP注射治疗的患者。实验对象的筛选条件：

（1）患者静脉血血细胞分析结果三系在正常范围内：血小板计数在100～300×10⁹/L之间，血红蛋白女性在135～150g/L之间，男性在140～155g/L之间，白细胞数在4～10×10¹²/L之间。

（2）红细胞沉降率、C反应蛋白在正常范围内。

（3）全身及治疗局部无感染表现者。

（4）基础情况好，无高脂血症、糖尿病等对血液成分影响巨大的血液系统外疾病。

（5）患者知情同意。

S3. 实验方法

S31.第一次离心的实验探索过程：

将133例患者分成21组（时间-离心力组合（时间单位为分钟，离心力单位为g）：1、5-800，2、6-200，3、6-600，4、6-800，5、6-1000，6、6-1400，7、6-1800，8、6-3000，9、8-600，10、8-800，11、10-1900，12、14-1400，13、15-1000，14、15-1200，15、15-1300，16、15-1400，17、15-1400增加肝素量，18、15-1900，19、16-1300，20、20-1400，21、20-1900。分组方式根据患者意愿自愿选择。其中，1～16组和18～21组中，肝素的加入量按照肝素与全血的体积比为0.2：10来确定，17组中肝素的加入量按照肝素与全血的体积比为0.25：10来确定。所述肝素的浓度均为12500单位/2mL。

用预先用0.5ml肝素湿润的60ml注射器1支，于患者肘静脉采集25ml血液，轻轻摇匀后，注入50ml离心管中。用另外一支离心管配平后，根据原先设计好的分组方案，进行第一次离心。第一次离心结束后，用长针头吸取分层后静脉血中的上层及分界层血浆，加入另一洁净离心管内；剩余的下层血浆层为血红蛋白层，将其摇匀后吸取2ml加入EDTA采血管内进行血常规分析。

结果分析：第一次离心的目的是为了弃去全血中的血红蛋白，弃去离心后的下层血浆可达到这个目的。即第一次离心应尽可能使全血中的血红蛋白沉降至最下层，但同时又要保证仅有少量血小板被离心沉降至下层，因此第一次离心最佳的方法应使得下层中的血红蛋白量更多而血小板更少。

经过21种不同的离心方法处理后，得到的下层血浆中的（富血小板）PLT及（血红蛋白）HGB结果描述如表1、表2和图1所示。

表1.经过第一次离心后，各种离心方法使得沉降至下层中的血红蛋白量的大小

Figure 2013104808516100002DEST_PATH_IMAGE001

表2.经过第一次离心后，各种离心方法使得沉降至下层中的血小板浓度的大小

由图1结果可见：随着离心时间或离心力的增加时，下层血红蛋白量波动在290.00g/L至300.00g/L之间；而下层PLT则随着时间或离心力的增加而不断增大。当离心时间-离心力组合为6分钟-800g时，下层中的PLT为7.33/L为最少，此时下层中的血红蛋白量为292.52g/L，正好在290与300之间。因此可以认为，第一次以6分钟、800g进行离心后，下层中的血浆包含了大部分的血红蛋白，而且仅有少量的血小板，此时弃去下层血浆可达到弃去全血中大部分血红蛋白的目的。因此可确定，以6分钟-800g的离心方法进行离心，为最好的第一次离心方法。

S32. 第二次离心的实验探索过程：

第一次离心原有133例样本，但在第一次离心、提取过程中，存在着污染、丢失等情况，因此会造成样本脱落，所以133例患者的样本经第一次离心后最终剩余88例样本进入第二次离心实验得到的上层及中层血浆。

将剩余的88例样本分成18组（时间-离心力组合（时间单位为分钟，离心力单位为g）：1、1-1900，2、2-1000，3、2-1200，4、2-1400，5、3-1000，6、3-1400，7、3-1900，8、4-1000，9、4-1400，10、5-1000，11、5-1400，12、6-350、13、6-600，14、6-1000，15、6-1200，16、6-1400，17、8-1400，18、10-1400。入组方法随患者意愿自愿选择。

经过18种不同的离心方法处理后，吸取分层后的血浆中的中间层，约4ml，即为PRP，其中的血小板（PLT）及血红蛋白（HGB）结果描述如表3、表4和图2所示。

表3.经过第二次离心后，各种离心方法得到的PRP中血小板计数的大小

Figure 2013104808516100002DEST_PATH_IMAGE003

表4.经过第二次离心后，各种离心方法得到的PRP中血红蛋白浓度的大小

由图2结果可知：随着离心时间或离心力的增大，PRP中的PLT先逐渐增大，达到峰值后逐渐下降，呈现一个抛物线样状态，因为随着时间或离心力的增加，血小板先逐渐沉降至中层，此时PLT逐渐上升；当超过一定力量时，血小板逐渐沉降到了下层，此时中间层血浆中的PLT逐渐下降。此峰值即为中间层血浆中PLT最高值，此时对应的离心方法能使PRP中的PLT最高，即此时的离心方法最好。由图2可知，PLT峰值为886.33×10⁹/L（95%置信区间为（840.63×10⁹/L, 932.03×10⁹/L）），所对应的离心方法为5分钟、1400g离心力。因此第二次离心时，以5分钟、1400g进行离心，所得的PRP中PLT最高，而其中的血红蛋白量HGB为27.71g/L（95%置信区间为（18.40, 37.03）。

综上所述，采集患者外周静脉血25ml，以手工二次离心法进行制备PRP时，采用本技术方法（第一次离心时间为6分钟，离心力为800g；第二次离心时间为5分钟，离心力为1400g）所得的PRP，其PLT浓度高，血红蛋白少，是一种高品质的PRP。

实施例2

经过实施例1的条件摸索后，本实施例再对实施例1中所述的6例患者采用本发明所述方法进行富血小板血浆的制备。

采集患者外周静脉血25mL至于50mL离心管内，加入0.5mL肝素抗凝，配平后放入离心机按设定的时间（6分钟）和离心力（800g）进行第一次离心；然后取出离心管，吸取分层后静脉血中的上层及分界层血浆，加入另一洁净离心管内；配平后放入离心机按设定的时间（5分钟）和离心力（1400g）进行第二次离心；然后取出离心管，吸取分层后的中间层血浆，约4ml，即为富血小板血浆。整个过程仅需一台高速自动离心机，一次移液。

经统计，采用此技术方法所得的富血小板血浆中，其中血小板计数浓度及血红蛋白量如下表5。从表5中可知，本发明专利制备得到的PRP中其平均血小板浓度达886.33×10⁹/L，大于全血血小板浓度的3倍，平均血红蛋白量为27.71g/L，这样，既能达到纯度高，又能达到浓度高的目的。

表5

Claims

1.一种手工二次离心法制备富血小板血浆的方法，其特征在于，将混有抗凝剂的全血以800g的离心力离心6分钟，吸取分层后静脉血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中，然后以1400g的离心力离心5分钟，吸取分层后的中间层血浆，即得富血小板血浆。

2.根据权利要求1所述制备富血小板血浆的方法，其特征在于，所述抗凝剂为肝素或水蛭素。

3.根据权利要求1所述制备富血小板血浆的方法，其特征在于，所述抗凝剂为肝素。

4.根据权利要求3所述制备富血小板血浆的方法，其特征在于，所述肝素在全血中的添加量按照肝素与全血的体积比为0.2：10来确定，所述肝素浓度为12500单位/2mL。

5.根据权利要求1所述制备富血小板血浆的方法，其特征在于，所述富血小板血浆的具体制备方法为：将混有0.5mL浓度为12500单位/2mL肝素的25mL全血首先以800g的离心力离心6分钟，吸取分层后静脉血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中，然后以1400g的离心力离心5分钟，吸取分层后的中间层血浆，约4ml，即得富血小板血浆。