CN104307208A - 一种富集纯化血小板的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富集纯化血小板的方法，全血中加入抗凝剂，1000rpm离心10分钟，吸取红细胞层以上部分，剩余红细胞层中加入生理盐水，1000rpm离心10分钟，取红细胞层以上部分，两者混合得到富集物C；富集物C中加入红细胞裂解液，混匀后静置半小时后以1500rpm离心20分钟，收集上清液A与中间白色絮状层A，上清液A以1500rpm离心10分钟，收集其底部白色层B，与中间白色絮状层A混合，再加入生理盐水，1500rpm离心10分钟，收集中间白色层C，收集物即为浓缩富集的血小板。本发明在离心富集的基础上加入了去血浆和破红细胞的纯化方法，能完全去除红细胞，有效提高血小板富集纯度、减少白细胞和红细胞污染。

Description

一种富集纯化血小板的方法

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种适用于包括人与实验动物在内不同种属高纯度血小板的离心制备方法。

背景技术：

血小板(platelet)是哺乳动物血液中的无核细胞，小于红细胞和白细胞，除了可以在止血的时候提供凝聚作用外，还能通过胞内α颗粒的脱颗粒作用释放大量细胞生长因子，包括血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，可诱导骨细胞的分裂增殖及胶原合成，促进骨组织的修复与重建(MarxRE,Implant Dent,2001,10(4):225-228)。其中，PDGF可促进成骨细胞的趋化、增殖，增加胶原蛋白的合成能力；TGF-β具有刺激成骨前体细胞及成骨细胞的趋化和增殖、抑制破骨细胞形成和骨吸收的作用；IGF-1能增加成骨细胞活力、促进软骨与骨基质生成；VEGF可促进新生血管形成，有利于病灶区营养物质的供给，还能直接作用于成骨细胞和软骨细胞，增强其迁移、增值和细胞活力(Bouletreau PJ,et al.,Plast Reconstr Surg,2002,110(1):139-148；Maeda S,et al.,EMOB J,2004,23(3):552-563；Trippel SB,Clin Orthop Relat Res.1998.(355Suppl):301-313；Ferrara N,et al.,Nat Med.2003.9(6):669-676)。血小板可从患者自身全血中提取，经富集处理后发挥治疗作用，具有来源丰富，取材方便，分离简单等特点，广泛应用于骨科、口腔科、运动医学等领域。现有的血小板手工制备方法是富血小板血浆(PRP)法，得到PRP用于实验研究和临床治疗。

PRP是全血经过离心分离得到的血小板浓缩物，其制备原理是利用血液中各种成分沉降速度不同，通过离心将血液分层。全血经低速离心可分为三层，上层是贫血小板血浆层(PPP)、中间为富血小板血浆层(PRP)、下层为红细胞层，取中间层可得到高度浓缩的含血小板血浆。一般认为，人体全血中血小板浓度为1～3×10⁵/ml，PRP中的血小板浓度应达到全血血小板浓度的4倍以上，含有的生长因子浓度也应在3倍以上(Marx et al.,Oral Surg Oral Med Oral Pathol OralRadiol Endod,1998,85(6):638；Landesberg et al.,J Oral Maxillofac Surg,2000,58(3):297；Dugrillon et al.,Int J Oral Maxillofac Surg,2002,31(6):615.)。现有的PRP制备方法有一次离心法和二次离心法。公认的一次离心法是Anitua法，是将10～20ml全血加入5ml含抗凝剂的离心管中，以160g离心6分钟，上层是PPP，下层是红细胞，两层交界处可见一很薄的浅黄色层，即PRP层；弃去上层(PPP)1ml，吸取剩余上层血浆至下层(红细胞层)1～2mm，得到PRP(Anitua,IntJ Oral Maxillofac Implants,1999,14(4):529-535.)。用Anitua一次离心法每次能从5ml全血中获取约1.2mlPRP。公认的二次离心法有Landesberg法、Petrungaro法和Aghaloo法，三者的区别是离心力和离心时间的不同。如Landesberg法第一次200g离心10分钟，吸管吸取全部上清液(PPP+PRP)至交界面下3mm，移至另一离心管，平衡后第二次200g离心10分钟，吸取约3/4上清液(PPP)废弃，剩余摇匀即为PRP；Petrungaro法第一次1500g离心6分钟，第二次1000g离心6分钟；Aghaloo法第一次215g离心10分钟，第二次863g离心10分钟(Landesberg et al.,J Oral Maxillofac Surg,2000,58(3):297-300；Petrungaro,Compend Contin Educ Dent,2001,22(9):729-732；Aghaloo et al.,J Oral Maxillofac Surg,2002,60(10):1176-1181.)。上述三种二次离心法的血小板数与血小板回收率比较可知，Aghaloo法获得的血小板数最多，回收率最高(张长青和袁霆,上海科学技术出版社,2011,p32-33.)。

目前虽然能制备出浓度达标的PRP，但其技术尚未完全成熟。无论一次离心法还是二次离心法都存在诸多缺点，极大地限制其在实验室和临床的应用：①缺少质量控制体系和公认的统一标准，无法保证每次制备PRP的重复性和生物稳定性；②血小板和生长因子获得率和纯度相对较低，仍有大量白细胞和红细胞污染，具有潜在风险；③无法避免血浆残留引起的不良反应(Brittinghan and Chaplin,JAMA,1957,165(7):819-825.)。因此，现有的PRP制备方法仍有待改进。

赖真阳等(CN 102367435B，中国专利申请号201110344464.0，发明名称：人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用)公开了一种人富血小板血浆的制备方法，所得产物用于人间充质干细胞的分离、培养具有较理想的效果。该方法以二次离心法收集全血中血小板并进行≤0℃和不低于常温条件的反复冻—融处理，去除沉淀得到富血小板血浆。反复冻融能使血小板破裂，释放大量细胞生长因子。因此该发明获得的主要成分实际为富含生长因子的血小板裂解液，最后去除沉淀步骤已去除所有细胞残留，即该产物不存在血小板。郑秋坚等(CN 103505910A，中国专利申请号201310480780.X，发明名称：一种一次离心法制备富血小板血浆的方法)公开了一种一次离心法制备富血小板血浆的方法，类似于前文提到的Anitua法。林子洪等(CN 103505911A，中国专利申请号201310480851.6，发明名称：一种以手工二次离心法制备富血小板血浆的方法)以及林卓衡等(CN 102755770A，中国专利申请号201210267055.X，发明名称：富血小板血浆的提取方法和提取的富血小板血浆)分别公开了两种二次离心法制备富血小板血浆的方法，区别在于离心转速和时间，类似于前文提到的Landesberg等法。

发明内容：

本发明提供一种人及动物血小板富集纯化的手工制备方法，特别是在离心富集的基础上加入了去血浆和破红细胞的纯化方法。该方法在操作过程中，不需要刻意避免抽取红细胞，却能完全去除红细胞，比现有的手工富血小板血浆制备方法具有较高的可操作性与可重复性。通过本发明的应用能有效提高血小板富集纯度、减少白细胞和红细胞污染、避免血浆的潜在不良反应，旨在解决现有手工法制备PRP浓度或纯度不高、白细胞和红细胞污染、血浆残留以及质量不稳定等缺陷问题。

本发明采用的技术方案是：

一种富集纯化血小板的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)全血中加入抗凝剂，以1000rpm离心10分钟，离心结束后，全血分为三层：上层为贫血小板层、中层为富血小板层(白膜层)、下层为红细胞层，吸取红细胞层以上部分，得到富集物A；剩余红细胞层中加入生理盐水，再以1000rpm离心10分钟，取红细胞层以上部分，得到富集物B，富集物B与富集物A混合，得到富集物C；

(2)向富集物C中加入红细胞裂解液，混匀后静置半小时后以1500rpm离心20分钟，分别收集上清液A与中间白色絮状层A，上清液A以1500rpm离心10分钟，收集其底部白色层B，与中间白色絮状层A混合，再加入生理盐水，以1500rpm离心10分钟，弃上清液B，收集中间白色层C，收集时避免底部红色残留，收集物即为浓缩富集的血小板。

所述步骤(1)中，所述抗凝剂优选为枸橼酸钠、肝素或水蛭素，更优选为枸橼酸钠。

所述抗凝剂可以以含抗凝剂的真空采血管的方式加入全血中，这是本领域技术人员公知的采血抗凝方法。

所述抗凝剂与全血的体积比一般为1：9，所述抗凝剂的体积是指抗凝剂溶液的体积。

所述枸橼酸钠在全血中的添加量按照枸橼酸钠溶液与全血的体积比为1:9来确定，所述枸橼酸钠溶液的质量浓度为3.2％～3.8％(相当于0.109mol/L～0.129mol/L)。该比例与含枸橼酸钠真空采血管(蓝盖)一致，因此本发明便于临床血样采集。

所述肝素的浓度一般为15IU/mL。

所述水蛭素的浓度一般为0.2mg/mL。

所述步骤(1)中，对全血进行了两次离心，目的是弃去全血中大部分红细胞，并充分收集血小板组分。为了尽可能多的分离血小板和红细胞，本发明经过前期探索发现，以1000rpm离心10分钟是最佳条件。

所述步骤(1)中，剩余红细胞层中加入生理盐水，生理盐水主要起到稀释分散的作用，生理盐水的加入量一般为全血体积的0.2～1倍。

所述步骤(2)中，所述红细胞裂解液为氯化铵水溶液、淋巴细胞分离液或其他商品化或自行配制的红细胞裂解液。

所述步骤(2)中，所述氯化铵水溶液与富集物C的体积比是1:2，所述氯化铵水溶液的质量浓度为1.0％。

所述淋巴细胞分离液可于市场上购买获得，按照商品的使用说明进行操作即可。本发明实施例中所用的淋巴细胞分离液购自上海索莱宝生物科技有限公司，淋巴细胞分离液与富集物C的体积比是1:1。

所述步骤(2)中，加入红细胞裂解液的目的是为了去除剩余红细胞，并通过离心聚集血小板；将上清液A再离心的目的是尽可能多的收集血小板；最后与生理盐水混合并离心的目的是为了去除血浆和红细胞碎片残留，进一步浓缩纯化血小板。本发明经过前期探索发现，以1500rpm离心是上述最佳条件。

所述步骤(2)中，收集其底部白色层B，与中间白色层A混合，再加入生理盐水，生理盐水主要起到稀释分散的作用，生理盐水的加入量一般为全血体积的0.2～1倍。

进一步，本发明所述方法优选按以下步骤进行：

(1)全血中加入抗凝剂，抗凝剂与全血的体积比为1：9，以1000rpm离心10分钟，离心结束后，吸取红细胞层以上部分，得到富集物A；剩余红细胞层中加入生理盐水，再以1000rpm离心10分钟，取红细胞层以上部分，得到富集物B，富集物B与富集物A混合，得到富集物C；

(2)向富集物C中加入氯化铵水溶液，所述氯化铵水溶液与富集物C的体积比是1:2，所述氯化铵水溶液的质量浓度为1.0％，混匀后静置半小时后以1500rpm离心20分钟，分别收集上清液A与中间白色絮状层A，上清液A以1500rpm离心10分钟，收集其底部白色层B，与中间白色絮状层A混合，再加入生理盐水，以1500rpm离心10分钟，弃上清液B，收集中间白色层C，收集时避免底部红色残留，收集物即为浓缩富集的血小板。

与现有的手工PRP制备技术相比，本发明具有以下有益效果：

所获血小板纯度更高，有利于提高其利用率与有效性。申请人进行了不同种属(人、大鼠、小鼠)的血小板制备，并将本发明涉及的方法与经典的一次离心法(Anitua法)和二次离心法(Aghaloo法)进行比较，应用全自动血液分析仪(Automated Hematology Analyzer,XT-2000i,Sysmex Corporation,Japan)对结果进行分析。实验结果表明，相较于一次离心法和二次离心法，本发明方法能得到纯度更高的血小板(人99.84％，大鼠99.19％，小鼠99.16％)，同时减少了白细胞的含量(人0.13％，大鼠0.81％，小鼠0.83％)，并完全去除了红细胞(人0.00％，大鼠0.00％，小鼠0.00％)，各参数均优于一次离心法和二次离心法。结果说明本发明适用于人、大鼠、小鼠三个物种。与一次离心和二次离心法得到的产物相比，本发明获得的血小板为透明色，说明其不含红细胞等有色杂质。通过流式细胞术检测发现，本发明方法能有效减少人、大鼠、小鼠的杂细胞污染和干扰，使制备产物的血小板阳性率高达99％以上，明显优于一次离心法和二次离心法。

本发明提供了一种高度纯化血小板的手工制备方法，与现有专利授权或公开的发明相比有较大区别，不仅能获得纯度极高的血小板，还能减少白细胞和红细胞的污染，同时避免血浆引起的不良反应，并具有较高的重复性和可操作性，能应用于骨组织工程的实验研究和临床中。本发明有望成为本领域技术人员迫切期待的一种血小板富集技术。

附图说明：

图1不同方法制备富集血小板的实物图。

图2.不同方法制备富集人血小板的流式结果。

图3.不同方法制备富集大鼠血小板的流式结果。

图4不同方法制备富集小鼠血小板的流式结果。

具体实施方式：

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述和说明。然而，本发明的保护范围并不限于下述实施例。

实施例1：

(1)把人的全血采集到含有枸橼酸钠的真空采血管里，枸橼酸钠质量浓度为3.2％～3.8％。抗凝剂与全血的体积比例是1:9。采集3mL全血。

(2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。

(3)将3mL含有抗凝剂血液分配到离心管，以转速1000rpm离心10分钟，离心后血液应分为三层：最底层为红细胞，最上层为贫血小板层，中间层为富血小板层，含有血小板和白细胞。

(4)利用移液器把最上层部分和中间层部分抽出并转移到新的离心管中，无须刻意避免抽取红细胞，得到富集物A。

(5)往含有剩余红细胞的原离心管中加入1mL生理盐水，以转速1000rpm离心10分钟，利用移液器把红细胞层以上的部分抽出，得到富集物B并与前一次收集的富集物A混合，得到富集物C。

(6)往收集了富集物C的离心管中加入红细胞裂解液，所述红细胞裂解液为质量分数1.0％的氯化铵水溶液，氯化铵水溶液与富集物C的体积比是1:2，混匀后静置30分钟，以转速1500rpm离心20分钟，利用移液器分别收集上清与中间白色絮状层，分别置于两根新的离心管中。其中上清液再以1500rpm离心10分钟，收集底部白色沉淀，与另一管中的白色絮状层混合，再加入1mL生理盐水，以转速1500rpm离心10分钟，收集中间白色层，即为浓缩血小板。

取大鼠、小鼠全血按照上述步骤(1)～(6)进行浓缩富集，分别得到大鼠浓缩血小板、小鼠浓缩血小板。各抽取100微升样本，利用全自动血液分析仪进行检测，重复实验，统计所得结果见下表1。

另外分别取人、大鼠、小鼠全血，按照一次离心法即Anitua法提取血小板，具体方法是：将全血加入5ml含抗凝剂的离心管中，以160g离心6分钟，上层是PPP，下层是红细胞，两层交界处可见一很薄的浅黄色层，即PRP层；弃去上层(PPP)1ml，吸取剩余上层血浆至下层(红细胞层)1～2mm，得到PRP(Anitua,Int J OralMaxillofac Implants,1999,14(4):529-535.)。

取人、大鼠、小鼠全血，按照二次离心法(Landesberg法)提取血小板，具体方法是：将全血加入5ml含抗凝剂的离心管中，以200g离心10分钟，吸管吸取全部上清液(PPP+PRP)至交界面下3mm，移至另一离心管，平衡后第二次以200g离心10分钟，吸取约3/4上清液(PPP)废弃，剩余摇匀即为PRP(Landesberg et al.,J OralMaxillofac Surg,2000,58(3):297-300)。

一次离心法和二次离心法制得的浓缩血小板同样利用全自动血液分析仪进行检测，所得结果见下表1。

表1.对血小板不同制备方法的全自动血液分析结果

表1数据为细胞数量的百分含量。

表1结果表明，本发明方法能得到纯度更高的血小板(人99.84％，大鼠99.19％，小鼠99.16％)，同时减少了白细胞的含量(人0.13％，大鼠0.81％，小鼠0.83％)，并完全去除了红细胞(人0.00％，大鼠0.00％，小鼠0.00％)，各参数均优于一次离心法和二次离心法。并且本发明方法适用于人和动物。

本发明方法、一次离心法、二次离心法针对人血在进行第一次离心后的照片以及所制得的浓缩血小板终产物照片如图1所示。与一次离心和二次离心法得到的产物相比，本发明获得的血小板为透明色，说明其不含红细胞等有色杂质。

本发明、一次离心法、二次离心法提取的人血小板、大鼠血小板、小鼠血小板分别进行流式细胞术检测，所得结果分别见图2、3、4，结果表明，本发明方法能有效减少人、大鼠、小鼠的血小板中的杂细胞污染和干扰，使制备产物的血小板阳性率高达99％以上，明显优于一次离心法和二次离心法。

实施例2：制备浓缩血小板

操作步骤同实施例1，所不同的是，步骤(6)中，红细胞裂解液为淋巴细胞分离液(P8610-200,上海索莱宝生物科技有限公司)，淋巴细胞分离液与富集物C的体积比为1:1。

制备得到的人、大鼠、小鼠血小板纯度均为99％以上。

实施例3：制备浓缩血小板

操作步骤同实施例1，所不同的是，步骤(1)中使用肝素(15IU/mL)为抗凝剂，抗凝剂与全血体积比为1:9。

制备得到的人、大鼠、小鼠血小板纯度均为99％以上。

实施例4：制备浓缩血小板

操作步骤同实施例1，所不同的是，步骤(1)中使用肝素(15IU/mL)为抗凝剂，抗凝剂与全血体积比为1:9。

步骤(6)中，红细胞裂解液为淋巴细胞分离液，淋巴细胞分离液与制备中间产物体积比为1:1。

制备得到的人、大鼠、小鼠血小板纯度均为99％以上。

实施例5：制备浓缩血小板

操作步骤同实施例1，所不同的是，步骤(1)中使用水蛭素(0.2mg/mL)为抗凝剂，抗凝剂与全血体积比为1:9。

制备得到的人、大鼠、小鼠血小板纯度均为99％以上。

实施例6：制备浓缩血小板

操作步骤同实施例1，所不同的是，步骤(1)中使用水蛭素为抗凝剂，抗凝剂与全血体积比为1:9。

步骤(6)中，红细胞裂解液为淋巴细胞分离液，淋巴细胞分离液与制备中间产物体积比为1:1。

制备得到的人、大鼠、小鼠血小板纯度均为99％以上。

Claims (10)

1.一种富集纯化血小板的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)全血中加入抗凝剂，以1000rpm离心10分钟，离心结束后，吸取红细胞层以上部分，得到富集物A；剩余红细胞层中加入生理盐水，再以1000rpm离心10分钟，取红细胞层以上部分，得到富集物B，富集物B与富集物A混合，得到富集物C；

(2)向富集物C中加入红细胞裂解液，混匀后静置半小时后以1500rpm离心20分钟，分别收集上清液A与中间白色絮状层A，上清液A以1500rpm离心10分钟，收集其底部白色层B，与中间白色絮状层A混合，再加入生理盐水，以1500rpm离心10分钟，弃上清液B，收集中间白色层C，收集时避免底部红色残留，收集物即为浓缩富集的血小板。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述抗凝剂为枸橼酸钠、肝素或水蛭素。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述红细胞裂解液为氯化铵水溶液或淋巴细胞分离液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述氯化铵水溶液与富集物C的体积比是1:2，所述氯化铵水溶液的质量浓度为1.0％。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所用的淋巴细胞分离液购自上海索莱宝生物科技有限公司，淋巴细胞分离液与富集物C的体积比是1:1。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述抗凝剂与全血的体积比为1：9。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述枸橼酸钠质量浓度为3.2％～3.8％。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，收集其底部白色层B，与中间白色层A混合，再加入生理盐水，所述生理盐水的加入量为全血体积的0.2～1倍。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，剩余红细胞层中加入生理盐水，所述生理盐水的加入量为全血体积的0.2～1倍。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行：

(1)全血中加入抗凝剂，抗凝剂与全血的体积比为1：9，以1000rpm离心10分钟，离心结束后，吸取红细胞层以上部分，得到富集物A；剩余红细胞层中加入生理盐水，再以1000rpm离心10分钟，取红细胞层以上部分，得到富集物B，富集物B与富集物A混合，得到富集物C；

(2)向富集物C中加入氯化铵水溶液，所述氯化铵水溶液与富集物C的体积比是1:2，所述氯化铵水溶液的质量浓度为1.0％，混匀后静置半小时后以1500rpm离心20分钟，分别收集上清液A与中间白色絮状层A，上清液A以1500rpm离心10分钟，收集其底部白色层B，与中间白色絮状层A混合，再加入生理盐水，以1500rpm离心10分钟，弃上清液B，收集中间白色层C，收集时避免底部红色残留，收集物即为浓缩富集的血小板。