CN104337835B

CN104337835B - 一种富血小板血浆的制备方法

Info

Publication number: CN104337835B
Application number: CN201410638430.6A
Authority: CN
Inventors: 郝京生; 韩慧华; 张东丽; 李帅民
Original assignee: HENAN GENETICS BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HENAN GENETICS BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2014-11-13
Publication date: 2018-11-20
Anticipated expiration: 2034-11-13
Also published as: CN104337835A

Abstract

本发明属于血液制品技术领域，具体涉及一种富血小板血浆的制备方法。该方法包括血液采集、淋巴细胞分离液处理、第一次离心、第二次离心等步骤。本发明在现有的PRP制备技术基础上，首先通过采用淋巴细胞分离液对采集的血液进行处理，然后通过优化离心力和离心时间，所制备PRP的血小板浓缩效果得到了进一步的提升，而红细胞数量大幅度降低，具有较好的实际应用价值。

Description

一种富血小板血浆的制备方法

技术领域

本发明属于血液制品技术领域，具体涉及一种富血小板血浆的制备方法。

背景技术

富血小板血浆，也简称为PRP（Platelet-rich plasma），是指通过采集自身的静脉血液，经过离心浓缩血小板、白细胞等制作流程所制作的富含高浓度生长因子的自体血浆。关于PRP应用目前较为热门的是有关PRP美容方面的应用，以PRP为基础制作的注射液通过真皮浅层注射方法注射到皮肤中，PRP中的多种自体生长因子可深入整个皮肤组织，调整皮肤全层结构，修复老化、受损的皮肤组织，从而达到改善皮肤质地、收紧及提升面部皮肤、减轻皱纹凹陷性疤痕、恢复皮肤年轻状态、延缓皮肤衰老的目的。

现有技术中，制备PRP大致有两种方法：一种方法是采用常规的两步离心法，进行浓缩血小板制备富集血小板的血浆。具体操作方法是：将全血以313×g离心4分钟，巴氏吸管吸取上部血浆及靠近界面约1mm的红细胞转移至另一离心管中，再以1252×g离心6分钟，巴氏吸管吸取上部大部分血浆，剩余所需要血浆及血细胞成分，静止30分钟后振摇离心管，即得PRP。此种方法，因为吸取的有一定量的红细胞，因此，制备的PRP中含有一定量的红细胞。

另一种方法是采用PRP分离管，通过一步离心，取下层血浆，即可制备富集血小板的血浆PRP。此种方法，因为采用的是一步离心法，由于离心的转速和时间的限制，容易导致的问题有：①血小板不能被充分离心，收集的PRP中血小板的浓缩倍数有限，具体而言，目前销售的PRP分离管浓缩血小板的浓度约为4倍左右；②血浆中仍然残留有一定量的红细胞，因而制备的PRP中也含有一定量的红细胞。

综上，现有技术中有关PRP制备的主要技术缺陷在于：一是血小板的浓缩倍数有限；二是制备的PRP中含有一定数量的红细胞，影响应用效果，例如，如果以含有一定数量红细胞为基础的PRP制备的注射液用于皮肤美容，在使用初期会造成注射部位皮肤的红肿、暗紫、影响美观，因而急需进一步的改进。

发明内容

本发明目的在于提供一种富血小板血浆的制备方法，相较于现有技术着重从提高血小板的浓缩效果和降低红细胞的含量两个方面进行了改进。

本发明所采取的技术方案如下。

一种富血小板血浆制备方法，包括以下步骤：

（1）以预装抗凝剂的采血管，无菌操作下采集血液；

（2）将步骤（1）所采集的血液，分装到含有淋巴细胞分离液的离心管中；优选配比为，以体积配比计，淋巴细胞分离液︰血液= 1︰2；

（3）对步骤（2）的全血进行第一次离心，180~250× g离心8~10分钟；优选为：220×g 离心8分钟；

（4）吸取步骤（3）离心后上层绝大部分大约4/5的血浆于另一新的离心管中；

（5）对步骤（4）所吸取的上层血浆进行二次离心，800~1300× g 离心6~8分钟；优选为：1000× g 离心6分钟；

（6）弃去步骤（5）离心后上层血浆，保留所需血浆用量，静置约20min后振摇离心管，使管底沉淀重悬于剩余的血浆中，即为富血小板血浆。

经对比验证，采用本发明所制备的PRP，相较于现有技术，血小板浓度提升了近一倍，而红细胞数量下降了数个数量级，技术效果显著，因而具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1为采用现有技术制备PRP时，离心后血液分层结构示意图；

图2为采用本发明所提供方法制备PRP时，加入淋巴细胞分离液和离心后血液分层结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

介绍具体实施例前，对本发明所用到的主要仪器设备和试剂介绍如下。

血液：来源于申请人公司员工自愿者的捐献。

主要设备：低速冷冻离心机，JW-1044R，安徽嘉文仪器装备有限公司。

主要试剂：淋巴细胞分离液（医用级）：天津市灏洋生物制品科技有限公司，批号为20140710；

尿素（AR级）：天津天力化学试剂有限公司，批号为20130528；

枸橼酸钠：天津天力化学试剂有限公司，批号为20130502；

40%甲醛：北京索莱宝科技有限公司，批号为：20140422。

另外需要强调和说明的是，实验过程中全程无菌操作。

对比例

为具体说明本发明的技术效果，发明人首先以现有技术为基础制备了适量的PRP，简要介绍如下。步骤如下：

（1）以预装枸橼酸钠抗凝剂的采血管，无菌操作下采取志愿者肘部静脉血20mL，分装到15mL离心管中；

（2）对全血进行第一次离心：低速冷冻离心机以313× g的离心力，离心4分钟；

（3）巴氏管吸取上部血浆及靠近界面约1 mm 的血细胞转移至另一15 mL离心管中；

（4）对上层血浆进行二次离心：低速冷冻离心机以1250 × g的离心力，离心6分钟；可见在底部薄层血细胞上沉积有白膜样物质，即为血小板沉积层，其上部为含有极少量未沉降血小板的血浆层；

（5）弃去上部大部分血浆，保留管底0.5mL的血浆，静置20 min后振摇离心管，使离心管底部的红细胞、血小板等沉淀成分重悬于剩余的血浆中，即为富血小板血浆（PRP）。

如图1所示，现有技术制备PRP时血液分层效果示意图，为最大限度的提取PRP，不可避免的会吸取到上层部分红细胞。实验结果计数表明，对现有技术所制备的PRP进行经过血小板和红细胞计数，结果表明：血小板的浓度为1363.80 ± 919.74×10⁹/L，红细胞数目为300±100×10⁷/L。

血小板计数方法如下：

1）配置血小板稀释液：尿素（AR级）10克，枸橼酸钠0.5克，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水充分溶解后，用蒸馏水定容至100ml，再加40%甲醛溶液0.1ml，混匀，过滤，置于-4℃保存。

2）取0.38mL血小板稀释液置于0.5mL无菌EP管中，加入已充分混匀的待测液20μL，立即充分混匀；

3）取步骤2）中混匀的悬液注入血球计数板计数池内，静置5~10min，使血小板下沉；

4）莱卡荧光倒置显微镜（Leica-DMIL LED）高倍镜下计数中央大方格内细胞数，乘以0.2×10⁹即为每升中血小板数目。

红细胞计数方法如下：

1）配制红细胞稀释液：取枸橼酸钠1.0g，40%甲醛液1.0ml，氯化钠0.6g，加蒸馏水至100ml，混匀、过滤两次后备用。

2）量取红细胞稀释液2.0ml于EP管中；加入10uL 待测PRP，上下颠倒混匀；

3）将步骤2）中的红细胞悬液冲入计数池，不得有空泡或外溢，充池后静置2~3min后计数；

4）莱卡荧光倒置显微镜（Leica-DMIL LED）高倍镜下计数中央大方格内细胞数，乘以0.2×10⁹即为每升中红细胞数目。

实施例1~5

进一步地，发明人以本发明所提供的富血小板血浆的制备方法进行了PRP的制备，过程简要介绍如下。

本发明所提供的富血小板血浆的制备方法包括以下步骤：

（1）以预装抗凝血剂枸橼酸钠的采血管，无菌操作下采取志愿者肘部静脉血20mL，分装到15mL离心管中；

（2）将步骤（1）所采集的血液缓慢分装到含有淋巴细胞分离液的15mL离心管中；以体积配比计，淋巴细胞分离液︰血液= 1︰2；

（3）对全血进行第一次离心：低速冷冻离心机以180~250× g的离心力，离心8~10分钟；

（4）巴氏管吸取步骤（3）离心后上层4/5的血浆于另一新的15mL离心管中；

（5）对步骤（4）所吸取的上层血浆进行二次离心：低速冷冻离心机以800~1300× g的离心力，离心6~8分钟；

（6）弃去步骤（5）离心后上层血浆，仅保留管底0.5mL的血浆，静置20min后振摇离心管，使红细胞和血小板重悬于剩余的血浆中，即为富血小板血浆（PRP）。

实验结果如下表所示。

从上表数据可以看出，以血小板和红细胞数量两个标准衡量，实施例3所制备的PRP效果最好。与现有技术制备的PRP对比来看，以血小板浓度数据而言，本发明最佳的浓缩效果可以比现有的浓缩效果提升近一倍，浓缩效果较好；以红细胞数量而言，本发明的红细胞数量则有大幅度的数个数量级的降低，因而技术效果较为突出。

本发明所采取的技术思路是首先通过加入淋巴细胞分离液将红细胞分离，然后进行离心分离，从而降低PRP中的红细胞数量。如图2所示，加入淋巴细胞分离液和离心后的血液分层结构示意图，血小板基本集中在了上层血浆中，与红细胞分离较为充分，同时与血液中其他细胞组分也有较好的分离效果。

综上，本发明在现有的PRP制备技术基础上，首先通过采用淋巴细胞分离液对采集的血液进行处理，然后通过优化离心力和离心时间，所制备PRP的血小板浓缩效果得到了进一步的提升，而红细胞数量大幅度降低，因而具有较好的实际应用价值。

Claims

1.一种富血小板血浆的制备方法，其特征在于，该方法适用于来源于人的血液，包括以下步骤：

（1）以预装抗凝剂的采血管，无菌操作下采集血液；

（2）将步骤（1）所采集的血液，分装到含有淋巴细胞分离液的离心管中；

以体积配比计，淋巴细胞分离液︰血液= 1︰2；

（3）对步骤（2）的全血进行第一次离心；

（4）吸取步骤（3）离心后上层血浆于另一新的离心管中；

（5）对步骤（4）所吸取的上层血浆进行二次离心；

步骤（3）、步骤（5）中第一次离心和二次离心的具体参数组合方式为如下四种组合方式中一种：

第一种组合：

第一次离心，离心力为220×g，离心时间为8min；二次离心，离心力为1000×g，离心时间为6min；

第二种组合：

第一次离心，200×g，离心时间为9min；二次离心，900×g，离心时间为7min；

第三种组合：

第一次离心，230×g，离心时间为8min；二次离心，1100×g，离心时间为6min；

第四种组合：

第一次离心，250×g，离心时间为8min；二次离心，1300×g，离心时间为6min；

（6）弃去步骤（5）离心后上层血浆，保留所需血浆用量，静置后振摇离心管，使管底沉淀重悬于剩余的血浆中，即为富血小板血浆。

2.如权利要求1所述富血小板血浆的制备方法，其特征在于，步骤（1）的抗凝剂为枸橼酸钠。