CN105462921A - 一种高效富集血小板的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种高效富集血小板的方法，该方法采用的是先诱导扩增脐血里的巨核细胞，待得到较成熟的巨核细胞后再回输到人体内，每个巨核细胞在人体内平均能产生2000个血小板，能够快速恢复患者血小板数目及功能，该方法不仅临床安全性高，而且可以减少同种免疫抗体的产生，降低输血量及血源性感染的危险。

Description

一种高效富集血小板的方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种高效富集血小板的方法。
背景技术
血小板是一种具有较小体积的无核细胞，小于红细胞和白细胞，只存在于哺乳动物血液中，在正常血液中有较恒定的数量(如人体全血中血小板浓度为1～3×105/ml)，其除了可以在止血的时候提供凝聚作用外，还能通过胞内α颗粒的脱颗粒作用释放大量细胞生长因子，包括血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，可诱导骨细胞的分裂增殖及胶原合成，促进骨组织的修复与重建。血小板可从患者自身全血中提取，经富集处理后发挥治疗作用，具有来源丰富，取材方便，分离简单等特点，广泛应用于骨科、口腔科、运动医学等领域。
现有的血小板人工富集方法主要采用富血小板血浆(PRP)法，得到PRP用于实验研究和临床治疗。PRP是全血经过离心分离得到的血小板浓缩物，其制备原理是利用血液中各种成分沉降速度不同，通过离心将血液分层。全血经低速离心可分为三层，上层是贫血小板血浆层(PPP)、中间为富血小板血浆层(PRP)、下层为红细胞层，取中间层可得到高度浓缩的含血小板血浆。
现有技术例如富血小板血浆(PRP)法主要都是采用从人血里面直接提取血小板，但这样收集得到的血小板的数量有限，并且直接回输血小板后，血小板的增加值低于预期的回升值，即出现血小板输注无效的现象；同时，直接向人体输注血小板也不可避免地增加了血源性感染及输血反应发生的概率，并且我国各大城市的血小板供应存在极大的缺口，因此，临床上急需一种新的替代治疗法来有效的治疗血小板减少症。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种能较快恢复患者血小板数目及功能的高效富集血小板的方法，其不仅临床安全性高，而且可以减少同种免疫抗体的产生，降低输血量及血源性感染的危险。
本发明通过以下技术方案实现该目的：
一种高效富集血小板的方法，将脐血中的巨核细胞分离并进行培养，然后输注入人体内产生大量血小板，每个巨核细胞平均能够产生2000个血小板。
其中，巨核细胞分离培养包括巨核细胞的扩增培养以及巨核细胞悬液的制备步骤。
作为优选的，所述巨核细胞的扩增培养包括以下步骤：
1)用抗凝采血管采集脐血，将100ml脐血与浓度为0.06g/ml羟乙基淀粉混合，脐血与羟乙基淀粉的体积比为3～6：1，充分混匀后静止30min以上，沉降红细胞，吸取上清液，并加至装有等体积的淋巴细胞分离液的离心分离管中，2000rpm离心20min，收集单个核细胞；
2)将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次；
3)将洗涤后的单个核细胞按密度为1×106接种于IMDM培养基中，并加入浓度为50～100ng/ml的rhG-CSF，连续培养7天；
4)将上述步骤3)中的单个核细胞收集离心，1500rpm离心10min后，用StemSpanSFEM无血清培养基重悬，并加入细胞生长因子SCF20～100ng/mL、20～100ng/mLTPO、10～50ng/mLIL-3、20～100ng/mLIL-6、20～100ng/mLIL-11、10～50IU/ml肝素，置于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的条件下培养，每隔2天进行原体积的1/3量的换液，连续培养4～10天；
所述巨核细胞悬液的制备包括以下步骤：
5)将上述培养11～17天的巨核细胞进行收集，1500rpm离心5min，弃上清；
6)将步骤5)获得的巨核细胞用生理盐水重悬，离心1500rpm离心5min，弃上清；
7)最后将收集到的巨核细胞重悬于生理盐水中，制备成巨核细胞悬液。
进一步的，对步骤2)收集的单个核细胞进行计数，单个核细胞数量为(0.85±0.42)×108个，其中巨核细胞占比0.5％左右，取1.0×108个单核球细胞，含巨核祖细胞约(2.82±0.35)×105个。
进一步的，所述步骤3)中经过rhG-CSF刺激培养后，CD34+细胞的含量明显提高10倍左右，达到(2.62±0.57)×106个。
进一步的，所述步骤4)中连续培养4～10天后，CD34+细胞总数扩增了35.21±1.24倍，其中巨核细胞占细胞总数的70％，即(9.23±3.25)×107个。
作为优选的，所述步骤7)中将巨核细胞重悬于生理盐水，制备成200ml的细胞悬液，每袋细胞总量控制在0.5～1×107个。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的高效富集血小板的方法，采用的是先诱导扩增脐血里的巨核细胞，待得到较成熟的巨核细胞后再回输到人体内，每个巨核细胞在人体内平均能产生2000个血小板，能够快速恢复患者血小板数目及功能，该方法不仅临床安全性高，而且可以减少同种免疫抗体的产生，降低输血量及血源性感染的危险。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1。
本实施例提供一种高效富集血小板的方法，包括巨核细胞的扩增培养以及巨核细胞悬液的制备步骤。
其中，所述巨核细胞的扩增培养包括以下步骤：
1)用抗凝采血管采集脐血，将100ml脐血与浓度为0.06g/ml羟乙基淀粉混合，脐血与羟乙基淀粉的体积比为3：1，充分混匀后静止30min以上，沉降红细胞，吸取上清液，并加至装有等体积的淋巴细胞分离液的离心分离管中，2000rpm离心20min，收集单个核细胞；
2)将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次；
3)将洗涤后的单个核细胞按密度为1×106接种于IMDM培养基中，并加入浓度为50ng/ml的rhG-CSF，连续培养7天；
4)将上述步骤3)中的单个核细胞收集离心，1500rpm离心10min后，用StemSpanSFEM无血清培养基重悬，并加入细胞生长因子SCF、TPO、IL-3、IL-6、IL-11和肝素，其终浓度分别为20ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、20ng/mL、10IU/mL，置于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的条件下培养，每隔2天进行原体积的1/3量的换液，连续培养4天；
所述巨核细胞悬液的制备包括以下步骤：
5)将上述培养11天的巨核细胞进行收集，1500rpm离心5min，弃上清；
6)将步骤5)获得的巨核细胞用生理盐水重悬，离心1500rpm离心5min，弃上清；
7)最后将收集到的巨核细胞重悬于生理盐水中，制备成200ml的细胞悬液，每袋细胞总量控制在0.5～1×107个。
实施例2。
本实施例提供一种高效富集血小板的方法，包括巨核细胞的扩增培养以及巨核细胞悬液的制备步骤。
其中，所述巨核细胞的扩增培养包括以下步骤：
1)用抗凝采血管采集脐血，将100ml脐血与浓度为0.06g/ml羟乙基淀粉混合，脐血与羟乙基淀粉的体积比为6：1，充分混匀后静止30min以上，沉降红细胞，吸取上清液，并加至装有等体积的淋巴细胞分离液的离心分离管中，2000rpm离心20min，收集单个核细胞；
2)将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次；
3)将洗涤后的单个核细胞按密度为1×106接种于IMDM培养基中，并加入浓度为100ng/ml的rhG-CSF，连续培养7天；
4)将上述步骤3)中的单个核细胞收集离心，1500rpm离心10min后，用StemSpanSFEM无血清培养基重悬，并加入细胞生长因子SCF、TPO、IL-3、IL-6、IL-11和肝素，其终浓度分别为100ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、100ng/mL、50IU/mL，置于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的条件下培养，每隔2天进行原体积的1/3量的换液，连续培养10天；
所述巨核细胞悬液的制备包括以下步骤：
5)将上述培养17天的巨核细胞进行收集，1500rpm离心5min，弃上清；
6)将步骤5)获得的巨核细胞用生理盐水重悬，离心1500rpm离心5min，弃上清；
7)最后将收集到的巨核细胞重悬于生理盐水中，制备成200ml的细胞悬液，每袋细胞总量控制在0.5～1×107个。
实施例3。
本实施例提供一种高效富集血小板的方法，包括巨核细胞的扩增培养以及巨核细胞悬液的制备步骤。
其中，所述巨核细胞的扩增培养包括以下步骤：
1)用抗凝采血管采集脐血，将100ml脐血与浓度为0.06g/ml羟乙基淀粉混合，脐血与羟乙基淀粉的体积比为4：1，充分混匀后静止30min以上，沉降红细胞，吸取上清液，并加至装有等体积的淋巴细胞分离液的离心分离管中，2000rpm离心20min，收集单个核细胞；
2)将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次；
3)将洗涤后的单个核细胞按密度为1×106接种于IMDM培养基中，并加入浓度为70ng/ml的rhG-CSF，连续培养7天；
4)将上述步骤3)中的单个核细胞收集离心，1500rpm离心10min后，用StemSpanSFEM无血清培养基重悬，并加入细胞生长因子SCF、TPO、IL-3、IL-6、IL-11和肝素，其终浓度分别为50ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、50ng/mL、25IU/mL，置于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的条件下培养，每隔2天进行原体积的1/3量的换液，连续培养7天；
所述巨核细胞悬液的制备包括以下步骤：
5)将上述培养14天的巨核细胞进行收集，1500rpm离心5min，弃上清；
6)将步骤5)获得的巨核细胞用生理盐水重悬，离心1500rpm离心5min，弃上清；
7)最后将收集到的巨核细胞重悬于生理盐水中，制备成200ml的细胞悬液，每袋细胞总量控制在0.5～1×107个。
实施例4、巨核细胞形态观察
将实施例1～3制备所得的巨核细胞置于光学显微镜和电子显微镜下观察，细胞有前血小板伸出，培养的巨核细胞和血小板大小颗粒与正常的巨核细胞和血小板结构一致。
实施例5、巨核细胞免疫组织化学检测
将实施例1～3培养制备所得的巨核细胞进行免疫组织化学检测，结果如下表1所示：
表1
表1结果显示：实施例1～3的细胞表达血小板特异性抗原GPⅡbⅢa的阳性率均在95％以上，且表达为强阳性，说明以上细胞95％以上是巨核细胞，实施例3的结果最佳。
实施例6、凝血功能检测
将本发明实施例1～3培养的巨核细胞产生的血小板与凝血酶作用，能产生聚集反应，这说明脐血CD34+细胞能在体外诱导生成高纯度且成熟的巨核细胞并产出血小板。
实施例7、血小板数升高水平检测
将实施例1～3培养的巨核细胞悬液应用于45例血小板减少症状的患者，其血小板的数值在20～50×109个，远低于正常人体血液中的血小板数量水平。输注前给与病人10％葡萄糖酸钙10ml预防输液反应，输注时间持续2小时，同时密切观察病人的生命体征和有无不良反应。在观察期间，主要通过观察血小板数升高水平(主要指升高到50～100×109个/L)以及所需的时间来评价本细胞产品的疗效。
经统计，45例患者均能顺利完成临床输注，并无不良反应的发生，其中32例患者的血小板数升高到上述水平，评定为有效，有效率为71.1％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种高效富集血小板的方法，将脐血中的巨核细胞分离并进行培养，然后输注入人体内产生大量血小板。
2.如权利要求1所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，巨核细胞分离培养包括巨核细胞的扩增培养以及巨核细胞悬液的制备步骤。
3.如权利要求2所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，所述巨核细胞的扩增培养包括以下步骤：
1)用抗凝采血管采集脐血，将100ml脐血与浓度为0.06g/ml羟乙基淀粉混合，脐血与羟乙基淀粉的体积比为3～6：1，充分混匀后静止30min以上，沉降红细胞，吸取上清液，并加至装有等体积的淋巴细胞分离液的离心分离管中，2000rpm离心20min，收集单个核细胞；
2)将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次；
3)将洗涤后的单个核细胞按密度为1×106接种于IMDM培养基中，并加入浓度为50～100ng/ml的rhG-CSF，连续培养7天；
4)将上述步骤3)中的单个核细胞收集离心，1500rpm离心10min后，用StemSpanSFEM无血清培养基重悬，并加入细胞生长因子SCF20～100ng/mL、20～100ng/mLTPO、10～50ng/mLIL-3、20～100ng/mLIL-6、20～100ng/mLIL-11、10～50IU/ml肝素，置于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的条件下培养，每隔2天进行原体积的1/3量的换液，连续培养4～10天；
所述巨核细胞悬液的制备包括以下步骤：
5)将上述培养11～17天的巨核细胞进行收集，1500rpm离心5min，弃上清；
6)将步骤5)获得的巨核细胞用生理盐水重悬，离心1500rpm离心5min，弃上清；
7)最后将收集到的巨核细胞重悬于生理盐水中，制备成巨核细胞悬液。
4.如权利要求3所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，对步骤2)收集的单个核细胞进行计数，单个核细胞数量为(0.85±0.42)×108个，其中巨核细胞占比0.5％左右，取1.0×108个单核球细胞，含巨核祖细胞约(2.82±0.35)×105个。
5.如权利要求3所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，所述步骤3)中经过rhG-CSF刺激培养后，CD34+细胞的含量明显提高10倍左右，达到(2.62±0.57)×106个。
6.如权利要求3所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，所述步骤4)中连续培养4～10天后，CD34+细胞总数扩增了35.21±1.24倍，其中巨核细胞占细胞总数的70％，即(9.23±3.25)×107个。
7.如权利要求3所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，所述步骤7)中将巨核细胞重悬于生理盐水，制备成200ml的细胞悬液，每袋细胞总量控制在0.5～1×107个。
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