CN105255831A - 一种巨核祖细胞的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种巨核祖细胞的分离方法。该方法将分离得到的单个核细胞以rhG-CSF刺激培养，从而增加细胞中巨核系细胞的含量，以免疫磁珠对经刺激培养的细胞进行筛选，获得巨核祖细胞。采用本发明提供的方法对巨核祖细胞进行分离，得率较高且定向诱导分化成巨核细胞(表型CD41a⁺/CD61⁺)的数量较高。实验表明，以本发明提供的方法对20～100mL脐血进行分离，获得的巨核组细胞的数量可达2.75×10⁶个，所得细胞中巨核系细胞的数量百分比为5～10％，经14天定向诱导分化培养后，巨核细胞的数量总数可扩增132.5±21.2倍，巨核细胞的比例可达81％。

Description

一种巨核祖细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种巨核祖细胞的分离方法。

背景技术

巨核细胞祖细胞(megakaryocyteprogenitorcell)是一种使人们产生巨核细胞的细胞，它是从骨髓祖(CFU-GEMM)而得，简称巨核祖细胞。巨核祖细胞存在于CD126^-/Lin^-细胞群中，而CD34+细胞可分为两个细胞亚群，表达IL-6R和不表达IL-6R，IL-6R+细胞能被刺激形成粒-巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞，而IL-6R-细胞当被给予IL-6/sIL-6R时可形成红系及巨核系细胞。造血干细胞首先分化生成巨核系祖细胞，也称巨核系集落形成单位(colonyformingunit-megakaryocyte,CFU-Meg)。巨核系祖细胞分化成为成熟的巨核细胞后，其边缘部分破裂脱落，形成血小板，每个巨核细胞能生成1000-6000个左右的血小板；巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0.05％，但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。

如今恶性肿瘤严重危害人类健康的主要疾病之一，目前主要是通过手术治疗并结合放化疗。当患者在接受高剂量放化疗后，骨髓造血功能低下，常会出现血小板减少，严重时会造成患者出血死亡。临床上常采用输注血小板，但血小板来源有限，存活期短，体外易失活，且反复输注血小板易导致输注无效并增加输血传播疾病的危险。

1997年，Bertolini等从外周血中分离CD34+，体外诱导扩增巨核细胞7天，用于患者血小板恢复。结果显示，体外诱导的巨核细胞可替代血小板输入，或减少血小板输入次数。2000年，Paquette等将体外动员的外周血细胞经体外诱导扩增巨核细胞9天后，用于改善大剂量化疗的乳腺癌病人中性粒细胞减少、血小板减少和贫血症状。VandenOudenrijn等对外周血、骨髓、脐血来源的CD34+细胞体外扩增进行比较，发现脐血来源的CD34+具有更强的巨核细胞扩增能力。由于脐血造血干细胞移植后血小板的恢复较外周血、骨髓慢，因此采用体外诱导、扩增巨核祖细胞和巨核细胞，然后输注患者体内，进一步发育成血小板，缩短血小板的恢复期。因此，分离巨核祖细胞将其用于恶性肿瘤的治疗是目前的研究热点。

对于巨核祖细胞的分离，目前的方法主要有两种，一种是通过体外分离造血干细胞(HSC)来获得单核球细胞，再分选CD34+细胞，并对其进行直接诱导培养，得到巨核祖细胞；另一种是通过体外分离造血干细胞(HSC)来获得单核球细胞，进行免疫磁珠筛选，去除已确定分化方向的细胞，获得Lin-细胞，再将获得的Lin-细胞与IL-6受体的抗体孵育，获得Lin-/CD126-细胞，经过定向诱导分化得到巨核细胞。前者提供的方法相对简单，但得率低；后者得率相对较高，但提供的方法着重于得到巨核祖细胞，却忽略了其前提条件，分离单核球的数量直接影响到巨核祖细胞的得率，并且其方法分离过程所采用的甲基纤维素是不能用于人体静脉回输的，所得的巨核祖细胞诱导所得的巨核细胞(CD41a+/CD61+细胞)的比例低。

因此，应当进一步开发得率高，诱导分化后得到高表达CD41a⁺/CD61⁺的巨核细胞的分离巨核祖细胞的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种巨核祖细胞的分离方法，即动员扩增后分离CD126^-/Lin^-细胞的方法。本发明提供的方法分离巨核祖细胞得率高，其定向诱导分化后得到的巨核细胞高表达CD41a⁺/CD61⁺，且可以用于人体静脉回输。

本发明提供的CD126^-/Lin^-细胞的分离方法，包括以下步骤：

步骤1：分离获得脐血中的单个核细胞，以rhG-CSF刺激培养；

步骤2：刺激培养获得的细胞经免疫磁珠分离筛选得到Lin-细胞；

步骤3：Lin-细胞经免疫磁珠分离筛选得到CD126^-/Lin^-细胞。

在本发明的实施例中，rhG-CSF在刺激培养的培养基中的浓度为50ng/mL～100ng/mL。

在一些实施例中，rhG-CSF在刺激培养的培养基中的浓度为100ng/mL。

在本发明的实施例中，刺激培养的条件为5％CO₂、37℃；时间为3天～7天。

在一些实施例中，刺激培养的时间为5天。

重组人粒细胞集落刺激因子(recombinanthumanGranulocyteColonyStimulatingFactor，rhG-CSF)，可促进髓系造血祖细胞的增殖、分化和成熟，调节中性粒细胞系的增殖与分化成熟；也可驱使中性粒细胞释放至血流，使外周中性粒细胞数量增多。本发明采用rhG-CSF对脐血中分离得到的单个核细胞进行刺激培养以增加其中巨核祖细胞的含量。实验表明，与未经rhG-CSF刺激的直接用脐血分离单核球筛选得到的巨核祖细胞相比，以浓度为50ng/ml～100ng/ml的rhG-CSF连续刺激培养单个核细胞3天～7天后，CD34⁺细胞的在培养所得细胞中的数量百分比提高了10倍。从根本上提高了巨核祖细胞的含量，从而提高分离巨核祖细胞的得率和向巨核细胞定向诱导分化后高表达CD41a⁺/CD61⁺。

在本发明的实施例中，刺激培养的培养基为StemSpanSFEM无血清培养基。

在本发明的实施例中，刺激培养的单个核细胞的接种密度为1×10⁶个/mL。

本发明采用免疫磁珠分离的方法从经刺激培养的细胞中分离巨核祖细胞，首先采用cocktail抗体混合物分离得到Lin-细胞，而后采用CD126抗体(抗白细胞介素6受体抗体)筛选获得CD126^-/Lin^-细胞，即IL-6R^-细胞群。经鉴定，筛选得到的IL-6R_-细胞群进行体外定向诱导分化培养得到的巨核细胞高表达CD41a⁺/CD61⁺，比例高达81％。

在本发明的实施例中，步骤2中免疫磁珠分离的抗体为CD2抗体、CD3抗体、CD5抗体、CD14抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD24抗体、CD41抗体、CD66b抗体及GlycophorinA抗体的混合物。

在本发明的实施例中，CD2抗体、CD3抗体、CD5抗体、CD14抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD24抗体、CD41抗体、CD66b抗体及GlycophorinA抗体的质量比为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1。

在本发明的实施例中，步骤2中免疫磁珠分离的温度为4℃，时间为30min。

具体的，步骤2中免疫磁珠分离的步骤包括：将经刺激培养后的细胞以1～2mLPBS缓冲液重悬，向细胞悬液中添加免疫磁珠，然后添加CD2抗体、CD3抗体、CD5抗体、CD14抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD24抗体、CD41抗体、CD66b抗体及GlycophorinA抗体，4℃孵育30min，后分选得到Lin-细胞。

在本发明的实施例中，步骤3中免疫磁珠分离的抗体为CD126抗体。

在本发明的实施例中，步骤3中免疫磁珠分离的温度为4℃，时间为30min。

具体的，步骤3中免疫磁珠分离的步骤包括：将步骤2中分离得到的Lin-细胞与免疫磁珠和CD126抗体混合，4℃孵育30min，后分选得到Lin^-/CD126^-细胞。

在本发明的实施例中，单个核细胞的制备方法包括：

步骤1：经抗凝处理的脐血与羟乙基淀粉溶液混合，去除红细胞，获得上清液；

步骤2：上清液与淋巴细胞分离液混合后，经离心收集单个核细胞。

在一些实施例中，羟乙基淀粉溶液中包括羟乙基淀粉和氯化钠，其中羟乙基淀粉的浓度为60g/L；氯化钠的浓度为9g/L。

在一些实施例中，经抗凝处理的脐血与羟乙基淀粉溶液的体积比为(2～6)：1。

在本发明的实施例中，脐血采集采用抗凝采血管采集。

在本发明的实施例中，上清液与淋巴细胞分离液混合的体积比为2:1。

本发明提供了一种巨核祖细胞的分离方法，该方法将分离得到的单个核细胞以rhG-CSF刺激培养3～7天，从而增加细胞中巨核系细胞的含量，以免疫磁珠对经刺激培养的细胞进行筛选，获得巨核祖细胞。采用本发明提供的方法对巨核祖细胞进行分离，得率较高且向巨核细胞定向诱导分化后得到表型为CD41a⁺/CD61⁺的细胞比例较高。实验表明，对20～100mL脐血进行分离，获得的巨核组细胞的数量可达2.75×10⁶个，显著优于不进行刺激培养分离筛选的对照组。经鉴定，所得细胞中巨核组细胞的数量百分比为5～15％，经14天定向诱导分化培养，巨核细胞的数量总数可扩增312.5+21.2倍，CD41a⁺/CD61⁺细胞(巨核细胞)的比例可达81％。且采用该方法分离获得的细胞可直接用于人体回输。

具体实施方式

本发明提供了一种巨核祖细胞的分离方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1单个核细胞分离

将采集的脐血50mL中加入25mL羟乙基淀粉注射液(北京双鹤药业股份有限公司)(脐血：羟乙基淀粉＝2:1(v/v))，充分混匀，静止15min以上，沉降红细胞，吸取上清液；

将上清液加至装有淋巴细胞分离液的离心分离管中(上清：分离液＝2:1(v/v))，3000rpm离心20min，收集单个核细胞。

将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次。经细胞计数，单个核细胞数量为5.82×10⁷个，其中CD34+的细胞数量3.05×10⁵个。

实施例2单个核细胞分离

将采集的脐血50mL中加入12.5mL羟乙基淀粉注射液(北京双鹤药业股份有限公司)(脐血：羟乙基淀粉＝4:1(v/v))，充分混匀，静止15min以上，沉降红细胞，吸取上清液；

将上清液加至装有淋巴细胞分离液的离心分离管中(上清：分离液＝2:1(v/v))，3000rpm离心20min，收集单个核细胞。

将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次。经细胞计数，单个核细胞数量为6.15×10⁷个，其中CD34+的细胞数量为3.18×10⁵个。

实施例3单个核细胞分离

将采集的脐血50mL中加入8.3mL羟乙基淀粉注射液(北京双鹤药业股份有限公司)(脐血：羟乙基淀粉＝6:1(v/v))，充分混匀，静止15min以上，沉降红细胞，吸取上清液；

将上清液加至装有淋巴细胞分离液的离心分离管中(上清：分离液＝2:1(v/v))，3000rpm离心20min，收集单个核细胞。

将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次。经细胞计数，单个核细胞数量为6.04×10⁷个，其中CD34+的细胞数量为3.10×10⁵个。

实施例4刺激培养

将实施例1中分离得到的单个核细胞以PBS洗涤两次后，按密度为1×10⁶个/mL接种于StemSpan无血清培养基(SFEM无血清培养基，stemcell公司)中，并加入rhG-CSF，使其在培养液中的终浓度为50ng/mL，5％CO₂、37℃、湿度95％；连续培养3天。

3天后，收集培养获得的细胞，用PBS洗涤2次，经免疫磁珠分选富集后的细胞进行流式细胞检测，CD34⁺细胞的数量为1.25×10⁶个。

实施例5刺激培养

将实施例1中分离得到的单个核细胞以PBS洗涤两次后，按密度为1×10⁶个/mL接种于StemSpan无血清培养基(SFEM无血清培养基，stemcell公司)中，并加入rhG-CSF，使其在培养液中的终浓度为100ng/mL，5％CO₂、37℃、湿度95％；连续培养7天。

7天后，收集培养获得的细胞，用PBS洗涤2次，经免疫磁珠分选富集后的细胞进行流式细胞检测，CD34⁺细胞的数量为1.74×10⁶个。

实施例6刺激培养

将实施例1中分离得到的单个核细胞以PBS洗涤两次后，按密度为1×10⁶个/mL接种于StemSpan无血清培养基(SFEM无血清培养基，stemcell公司)中，并加入rhG-CSF，使其在培养液中的终浓度为75ng/mL，5％CO₂、37℃、湿度95％；连续培养5天。

5天后，收集培养获得的细胞，用PBS洗涤2次，经细胞计数，经免疫磁珠分选富集后的细胞进行流式细胞检测，CD34⁺细胞的数量为1.42×10⁶个。

对比例1

将实施例1中分离得到的单个核细胞以PBS洗涤两次后，经免疫磁珠分选富集后的细胞进行流式细胞检测，CD34⁺细胞的数量为3.1×10⁵个。

实施例7免疫磁珠分离筛选

将实施例4～6和对比例1培养获得的细胞分别用1mL～2mL的PBS稀释，加入适量的cocktail抗体混合物(包含CD2、CD3、CD5、CD14、CD16、CD19、CD24、CD41、CD66b及GlycophorinA)混合均匀，于4℃冰箱孵育30min，采用免疫磁珠分离筛选得到Lin^-细胞。

再取适量的CD126抗体(抗白细胞介素6受体抗体)，另取免疫磁珠与CD126抗体混合，混匀，4℃冰箱孵育30min，并将分离得到的Lin^-细胞与其混合，4℃冰箱孵育30min，进行免疫磁珠分离筛选得到CD126^-/Lin^-细胞，即IL-6R^-细胞群(主要是巨核祖细胞)。

统计各实施例培养获得的细胞经筛选后所得的CD126^-/Lin^-细胞数量进行计数和细胞活率统计，结果如表1：

表1实施例4～6和对比例1培养的巨核祖细胞的计数

组别	细胞数(个)	细胞活率
			实施例4	6.93×105	97.3％
实施例5	8.30×105	98.2％
			实施例6	7.59×105	97.4％
对比例1	1.72×105	98％

从上述表1结果可以看出，实施例4～6培养的细胞经分离获得的巨核组细胞数量是对比例1的4倍～5倍。说明本发明提供的方法能够显著提高巨核祖细胞的得率。

实施例8巨核祖细胞向巨核细胞定向诱导分化扩增培养

将实施例7分离获得的IL-6R^-细胞群(主要为巨核祖细胞)进行体外向巨核细胞定向诱导分化培养(实施例4～6及对比例1～2经分离后的细胞分别诱导)，诱导分化培养基为IMDM(Gibco公司)，培养条件为，5％CO₂、37℃；每3天换液一次，经过10天的培养，进行巨核细胞计数及表型分析，结果如

表2：

表2扩增培养后巨核细胞细胞检测

组别	细胞数(个)	扩增倍数	细胞活率	CD41a+/CD61+(％)
					实施例4	5.36×107	77.3倍	96.1％	78％
实施例5	6.42×107	77.3倍	97.2％	81.7％
					实施例6	5.73×107	75.5倍	95.4％	80.5％
对比例1	1.32×107	76.7倍	96.3％	45％

结果表明，经过10天的培养，实施例中巨核细胞的扩增数量明显高于对比例，实施例中巨核细胞的CD41a⁺/CD61⁺表型高达81％，明显高于对比例。在培养的10天内，细胞数量和表型的表达未见降低。

结合上述各实施例和对比例的结果，可以看出实施例中经过刺激培养后进行免疫磁珠筛选得到的巨核祖细胞是对比例中未经刺激培养筛选的4～5倍，而筛选后进行诱导分化培养实施例的扩增倍数与对比例相差不大，但由于刺激培养后是巨核组细胞的基数变大，以致放大了后面巨核细胞培养的数量，可以看出本发明方法分离的巨核组细胞诱导培养巨核细胞的倍数由于实施例，由于实施例6与对比例1的CD34+细胞的起始量相等，使用采用此两组的实验结果进行对比巨核细胞的增殖倍数，巨核细胞的扩增倍数＝刺激培养后筛选的巨核组细胞/未经刺激筛选的巨核祖细胞×巨核细胞诱导分化扩增的倍数，参照表3计算巨核细胞总的扩增倍数：

表3巨核细胞总的扩增数

从以上表3可计算出经刺激培养和没有经刺激培养后诱导分化培养巨核细胞的倍数，实施例6巨核细胞的扩增倍数为333.14倍，对比例1扩增倍数为76.74倍，由此可看出本发明分离巨核祖细胞的方法诱导分化培养的巨核细胞的增殖倍数高于直接分离脐血筛选巨核祖细胞诱导分化培养的巨核细胞的增殖倍数。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种CD126^-/Lin^-细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：分离获得脐血中的单个核细胞，以rhG-CSF刺激培养；

步骤2：所述刺激培养获得的细胞经免疫磁珠分离筛选得到Lin-细胞；

步骤3：所述Lin-细胞经免疫磁珠分离筛选得到CD126^-/Lin^-细胞。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述rhG-CSF在刺激培养的培养基中的浓度为50ng/mL～100ng/mL。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述刺激培养的条件为37℃，CO₂浓度为5％，时间为3～7天。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述刺激培养的培养基为StemSpanSFEM无血清培养基。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述刺激培养的单个核细胞的接种密度为1×10⁶个/mL。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤2中所述免疫磁珠分离的抗体为CD2抗体、CD3抗体、CD5抗体、CD14抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD24抗体、CD41抗体、CD66b抗体及GlycophorinA抗体的混合物。

7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3中所述免疫磁珠分离的抗体为CD126抗体。

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述单个核细胞的制备方法包括：

步骤1：经抗凝处理的脐血与羟乙基淀粉溶液混合，去除红细胞，获得上清液；

步骤2：所述上清液与淋巴细胞分离液混合后，经离心收集单个核细胞。

9.根据权利要求8所述的分离方法，其特征在于，所述羟乙基淀粉溶液中包括羟乙基淀粉和氯化钠，其中羟乙基淀粉的浓度为60g/L；氯化钠的浓度为9g/L。

10.根据权利要求8所述的分离方法，其特征在于，所述经抗凝处理的脐血与羟乙基淀粉溶液的体积比为(2～6)：1。