CN107119013A

CN107119013A - 一种增强型cik细胞的制备方法及白术多糖和枸杞多糖的应用

Info

Publication number: CN107119013A
Application number: CN201710244770.4A
Authority: CN
Inventors: 向双林; 黄招琴; 颜峰; 彭海宁; 杨满君; 王怡雅; 刘京韬; 胡翔
Original assignee: Nanhua Biological Medicine Ltd By Share Ltd
Current assignee: Nanhua Biological Medicine Ltd By Share Ltd
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2017-09-01

Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种中药诱导增强CIK细胞活性的方法，该方法包括向CIK细胞培养液加入白术与枸杞提取物，所述的白术与枸杞提取物为白术多糖和枸杞多糖。该方法能激活CIK细胞增殖、杀瘤及免疫方面的活性，在提高CIK细胞在体外的杀瘤效果的同时又能获得大量CIK细胞，节省细胞培养时间又能增强CIK细胞的免疫活性，利用该方法制备得到的增强型CIK细胞能用于肿瘤疾病的治疗。

Description

一种增强型CIK细胞的制备方法及白术多糖和枸杞多糖的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种中药提取物组合诱导增强型CIK细胞的制备方法及其在CIK功能活性方面的应用。

背景技术

恶性肿瘤严重危害人类健康，目前常规的手术和放化疗等治疗方法均不能彻底清除体内的癌细胞，体内回输免疫活性细胞的过继免疫治疗法可以直接杀伤肿瘤细胞，还可调节和增强机体免疫力，从而成为肿瘤治疗的重要辅助手段。

免疫细胞治疗包括NK、LAK、CIK 、DC-CIK、TIL等，其中，细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK细胞）是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，兼具T淋巴细胞的强大抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤功能，具有增值迅速、杀瘤活性光谱且高效、毒副作用小等优点，已成为了肿瘤免疫治疗领域的一种新选择。

目前，CIK作为一种过继免疫治疗细胞在临床试验中已被用于治疗多类实体瘤及非实体瘤。CIK 细胞毒性分子触发机制使得CIK对一系列肿瘤或新鲜分离的肿瘤组织具有潜在毒性，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓白血病以及B淋巴瘤细胞等。除了造血细胞癌，从病人或健康志愿者分离诱导产生的CIK在体外也有同样的强抗肿瘤活性，能杀伤多种实体瘤，如肝癌、胃癌、肺癌、胶质瘤等。研究表明，CIK细胞在体外对正常骨髓细胞及脾细胞几乎没有毒性，但是杀伤肿瘤细胞特异性很强。

CIK细胞在免疫调节及抗肿瘤免疫治疗中有着重要作用，但其治疗效果与细胞输注剂量、效应细胞比例和对肿瘤细胞毒性有着密切关系，而CIK细胞的增殖和杀瘤活性依赖于多种细胞因子及外源因子的刺激，因此CIK细胞在临床上应用受到其在体外增殖活性及体内杀瘤活性的限制，研究如何提高其体外的增殖效率和毒性是首要解决的问题。

白术多糖(PAM)是白术的主要活性成分，主要是由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖组成的杂多糖，具有调节免疫、抗氧化及抗衰老、抗肿瘤、降血糖等作用。枸杞多糖（LBP）是枸杞的主要活性成分，实验证明枸杞多糖可通过激活机体的免疫系统来达到调节免疫功能及抗肿瘤目的。

发明内容

为培养出更具有高效杀瘤活性又能大量扩增的CIK细胞，本发明的目的在于提供一种中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，该方法能促进CIK细胞体外增殖能力，使其能高效扩增，同时又可以提高 CIK 细胞体外杀伤肿瘤细胞的效率，且通过该方法可增强CIK的免疫细胞活性。

本发明提供了一种CIK细胞培养基，包括：无血清基础培养基、细胞因子和白术多糖和枸杞多糖。

优选地，所述无血清基础培养基包括 GT-T551 无血清培养基。

优选地，还包括血清。

所述血清在无血清基础培养基中的体积百分含量约为 10％。

优选地，所述细胞因子包括白细胞介素-2（IL-2）、抗 CD3 单克隆抗体(CD3 mAB)的一种或两种。

优选地，所述的细胞因子包括培养基中终浓度为500 ng/mL的抗CD3 单克隆抗体及终浓度为 1000 U/mL的白介素-2。

所述白术多糖在CIK细胞培养液中的作用浓度为100 μg/mL~200 μg/mL，枸杞多糖在CIK细胞培养液中的作用浓度为100 μg/mL~200 μg/mL。

优选地，其特征在于所述的白术与枸杞提取物是在CIK细胞培养至第7-9天时加入，加入药物的作用时间为72 h。

本发明采用的技术方案为：先从人外周血中分离单个核细胞，通过细胞因子诱导成CIK细胞。在CIK细胞基本成熟后，向 CIK 细胞培养液中加入白术和枸杞提取物来激活CIK细胞活性与功能，通过相关实验技术检测白术和枸杞提取物对CIK细胞增殖、杀瘤及免疫活性方面的影响，所述的白术和枸杞提取物为白术多糖和枸杞多糖。

进一步的，本发明的中药诱导增强型 CIK 细胞的制备方法，包括如下步骤：

1) 外周血采集：请专业医务采血人员通过静脉采血方式采集健康自愿者血液20 mL到含有肝素钠抗凝剂的真空采血管中，反复颠倒采血管几次。

2）外周血单个核细胞（PBMCs）分离：将血液转移到50 mL离心管中，离心，转移上层血浆，加入生理盐水稀释剩余血样，采用医用级人淋巴细胞分离液通过密度梯度离心分离单个核细胞，用RPMI-1640洗涤获得的单个核细胞沉淀。

3）PBMCs诱导培养成CIK细胞：加入无血清GT-T551基础培养基重悬打散细胞沉淀，再加入抗CD3 单克隆抗体(CD3 mAB)至终浓度500 ng/mL、白介素-2（IL-2）终浓度为1000U/mL 及体积分数为10% 的血清，转移细胞悬液至T175瓶中，置于37 ℃、5% CO₂、90%相对湿度的细胞培养箱培养。隔天观察CIK细胞状态，若细胞培养基颜色发黄，适当补液。每3天进行细胞计数，按1.5-2.0×10⁶个/mL的细胞密度补加CIK培养液或半量换液。

4）加入白术多糖和枸杞多糖处理CIK细胞：CIK培养至7-9天时，在CIK细胞培养基中加入0 ug/mL ～200 ug/mL浓度的白术多糖和枸杞多糖混合液，作用CIK细胞72 h。

5）通过CCK法检测CIK细胞的增殖活性及杀瘤活性，采用流式细胞术检测CIK细胞中CD3⁺CD56⁺、CD3⁺CD8⁺细胞百分含量。

本发明提供了一种白术多糖和枸杞多糖在制备免疫细胞培养基中的应用。

本发明提供的 CIK 细胞培养方法在 CIK 细胞培养过程中添加了白术多糖和枸杞多糖，白术多糖和枸杞多糖能够提高CIK细胞的增殖活性及杀瘤活性。实验结果表明：本发明提供的CIK细胞培养基，在CIK细胞培养至第7天时加入白术多糖和枸杞多糖作用72 h，在其浓度为100 μg/mL~200 μg/mL实验组中，CIK活细胞数显著增加，统计学分析有意义（p<0.05)；在CIK细胞培养至第9天时加入白术多糖和枸杞多糖作用72 h，在其浓度为100 μg/mL~200 μg/mL实验组中，CIK细胞杀瘤效果也明显提高，约83.7%-88.8%；另外，白术多糖和枸杞多糖浓度为100 μg/mL~200 μg/mL实验组中CD3⁺CD56⁺、CD3⁺CD8⁺细胞百分含量也显著增多，CD3⁺CD56⁺约占40.28%，CD3⁺CD8⁺细胞约占84.02%。

附图说明

图 1 为本发明实施例1的CIK 细胞增殖活性曲线图。

图 2 为本发明实施例2的 CIK细胞对人宫颈癌细胞株Hela杀伤率。

图3（a为对照组，b 为实验组）为本发明实施例3的CIK 细胞中CD3⁺CD56⁺细胞百分含量流式结果。

图 4（c为对照组，d为实验组）为本发明实施例3的CIK 细胞中CD3⁺CD8⁺细胞百分含量流式结果。

具体实施方式

本发明提供了一种中药诱导增强型CIK细胞的制备方法及其在CIK细胞培养中的应用。

本发明使用的试剂及仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明：

实施例1

1、密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMCs），步骤为：

1）外周血采集：请专业医务采血人员通过静脉采血方式采集健康自愿者血液30 mL到含有肝素钠抗凝剂的真空采血管中，反复颠倒采血管几次。

2）收集血清：将血液转移到50 mL离心管中，1000g离心10 min，离心完成后形成上层血清和下层细胞两相。收集上层血浆至新的离心管，做好标记，56度水浴30 min灭活，备用。

3）样品稀释：加入生理盐水稀释剩下的细胞层至体积为30 mL，用移液管充分吹打均匀。

4）梯度离心：取另一50 mL离心管加入15 mL 人血淋巴细胞分离液，用10 mL移液管将稀释血样缓缓转移至分离液上方，形成上下两相。22 ℃，390 g离心30 min。

5）收集白膜层：离心完成后，离心管内液相分为四层，从下往上分别为血浆(含血小板)、白膜层(即单个核细胞)、淋巴分离液、红细胞和粒细胞层，用10 mL移液管或1 mL移液器小心收集中间的白膜层至新50 mL离心管。

6）清洗：于收集了白膜层的离心管中加RPMI-1640至45 mL，混匀，22 ℃，1000 g离心10 min，弃去上清。

7）重复步骤6）一遍，并在离心前取20 uL细胞悬液进行苔盼蓝细胞计数。

2、PBMCs加入CIK细胞培养液诱导培养：按细胞数2×10⁶个/mL加入无血清GT-T551基础培养基重悬打散细胞沉淀，再加入抗CD3 单克隆抗体(CD3 mAB)至终浓度500 ng/mL、白介素-2（IL-2）终浓度为1000 U/mL 及体积分数为10% 的血清。

3、细胞种瓶：转移细胞悬液至T175瓶中，置于37 ℃、5% CO₂、90%相对湿度的细胞培养箱培养，该天定为第0天（d0）。隔天观察CIK细胞状态，若细胞培养基颜色发黄，适当补液。每3天进行细胞计数，按1.5-2.0×10⁶个/mL的细胞密度补加CIK培养液或半量换液。

4、在CIK细胞培养至第7天时加入白术多糖和枸杞多糖混合液处理CIK细胞，作用72 h：

1) CIK细胞铺板：将培养7天的CIK细胞数调整至2×10⁵个/mL，于96 孔细胞培养板中加入细胞悬液100 μL/孔，每孔2×10⁴个细胞。

2) 加入白术多糖及枸杞多糖：设置对照组与实验组，对照组加入生理盐水，实验组分为2组，每个组4个平行复孔，在铺好CIK细胞的孔中分别加入CIK细胞培养基含终浓度为100 μg/mL、200 μg/mL白术多糖及枸杞多糖混合液各100 μL/孔，置于细胞培养箱中培养72 h。

5、CCK-8法检测细胞活性：培养72 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h后，用酶联免疫检测仪检测各孔细胞在 450nm处吸光值(吸光值的大小与活细胞的数量呈正比)，记录结果并对数据进行统计学分析。

6、CIK细胞增殖活性结果分析。

1) 将对照组（生理盐水）与实验组中2个不同浓度的白术多糖及枸杞多糖混合液处理CIK 细胞后，不同组CIK 细胞在OD450的读值如表1。

相比对照组（生理盐水），实验组1（100 μg/mL）及实验组2（200 μg/mL）的OD值明显提高，表明两组的活细胞数量较对照组明显增加，说明100 μg/mL及200 μg/mL浓度的白术多糖及枸杞多糖混合液能明显促进CIK细胞的增殖。

实施例2

4、在CIK细胞培养至第9天时加入白术多糖和枸杞多糖混合液处理CIK细胞，作用72 h：

1）CIK细胞铺板：取培养至9d的CIK细胞数调整至3×10⁶个/mL，于6 孔细胞培养板中加入细胞悬液1 mL/孔。

2）加入白术多糖及枸杞多糖：设置对照组与实验组，对照组加入生理盐水，实验组分为2组，每个组2个平行对照孔，在铺好CIK细胞的孔中分别加入CIK细胞培养基含终浓度为100 μg/mL、200 μg/mL白术多糖及枸杞多糖混合液各1 mL/孔，置于细胞培养箱中培养72h。

3）接种Hela细胞：在CIK细胞加入白术多糖和枸杞多糖作用48 h后（11d），将培养至对数生长期的Hela细胞调整细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔板中接种细胞悬液100 μL/孔，培养箱中培养24 h。

4）CIK杀伤Hela细胞：CIK细胞加入白术多糖和枸杞多糖作用72 h后（d12）进行CIK杀伤Hela细胞实验。弃去Hela旧的培养液，分别按效应细胞/靶细胞为20:1比例调整五组CIK细胞（悬浮细胞）至相应数目，按每孔100 μL CIK细胞悬液加入Hela细胞孔中，每个比例4个复孔，同时每个比例设对应的单独靶细胞和单独效应细胞孔，于细胞培养箱中培养4 h。

5）CCK-8法检测杀伤活性：培养4 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，细胞培养箱中孵育4 h。

5、细胞杀伤活力的检测：培养4 h后，用酶联免疫检测仪检测各孔在 450 nm处吸光值，记录数据并按照以下公式计算杀伤率，杀伤率(%)=[1-(实验组的OD值-单独效应细胞组的OD值)/单独靶细胞组的OD 值]×l00% 。

6、细胞杀伤活力结果分析。

1) 将对照组（生理盐水）与实验组中2个不同浓度的白术多糖及枸杞多糖混合液处理CIK 细胞，然后杀伤Hela细胞，CIK 细胞的杀伤率如表2。

组别	效靶比	杀伤率	显著性（p）
				对照组	20:1	71.5%±1.1%
实验组1（100 μg/mL）	20:1	83.7%±2%**	P<0.01
				实验组2（200 μg/mL）	20:1	88.8%±2.2%***	P<0.001

相比对照组（生理盐水），实验组1（100 μg/mL）及实验组2（200 μg/mL）的杀伤率显著提高，说明100 μg/mL及200 μg/mL浓度的白术多糖及枸杞多糖混合液能明显提高CIK细胞的杀瘤活性。

实施例3

1）CIK细胞铺板：调整培养至第9天的CIK细胞数目至2×10⁶个/mL，于6 孔板中加入细胞悬液1 mL/孔。

2) 白术多糖及枸杞多糖处理CIK细胞：设实验组和对照组，实验组在CIK细胞孔中加入白术多糖枸杞多糖终浓度为200 mg/mL的培养基1 mL，对照组在CIK细胞孔中加入等体积生理盐水，置于细胞培养箱中培养72 h。

5、收集细胞：收集悬浮细胞至1.5 mL EP管，500 g离心5 min，吸掉培养基。用PBS洗涤细胞两遍，加入 300 μL PBS重悬细胞。

6、抗体染色：加5 μL FITC标记的抗体至细胞悬液，轻轻混匀后放置于冰上，避光孵育 15 min。然后加入5 μL PE标记的抗体，轻轻混匀于冰上避光孵育10 min。

7、流式细胞术检测：抗体孵育1 h内用流式细胞仪进行检测。

8、细胞表面抗原通过流式结果分析。

1) 将对照组（生理盐水）与实验组的白术多糖及枸杞多糖混合液处理CIK 细胞后，CIK 细胞CD3⁺CD56⁺ 、CD3⁺CD8⁺表面抗原含量结果如表3。

CIK表明抗原	对照组	实验组（200 μg/mL）	显著性（p）
				CD3⁺CD56⁺	29.61%	40.28%**	P<0.01
CD3⁺CD8⁺	78.51%	84.02%*	P<0.05

相比对照组（生理盐水），实验组（200 μg/mL）的CD3⁺CD56⁺、CD3⁺CD8⁺细胞百分含量明显要高，说明200 μg/mL浓度的白术多糖及枸杞多糖混合液能明显促进CIK细胞中CD3⁺CD56⁺、CD3⁺CD8⁺细胞分化。

Claims

1.一种中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于：向CIK细胞培养液中加入白术与枸杞提取物。

2.根据权利要求1所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于：所述的CIK细胞培养液包括无血清基础培养基、抗CD3单克隆抗体(CD3mAB)，白介素-2(IL-2)、白术与枸杞提取物。

3.根据权利要求2所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于：所述的抗CD3单克隆抗体(CD3mAB)在无血清培养基中的浓度为500ng/mL，白介素-2(IL-2)在无血清培养基中的终浓度为1000U/mL。

4.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，还包括血清。

5.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，所述血清在培养液中的体积百分含量约为10％。

6.根据权利要求1所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于所述的白术与枸杞提取物主要为白术多糖和枸杞多糖。

7.根据权利要求1所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于所述的白术多糖在CIK细胞培养液中的作用浓度为100μg/mL～200μg/mL，枸杞多糖在CIK细胞培养液中的作用浓度为100μg/mL～200μg/mL。

8.根据权利要求1所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于所述的白术与枸杞提取物是在CIK细胞培养至第7-9天时加入，加入药物的作用时间为72h。

9.根据权利要求1所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)外周血单个核细胞(PBMCs)分离及获得；

2)根据权利要求1-5任意一项所述的培养液培养外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞诱导培养成CIK细胞，转移细胞悬液至T175瓶中，置于37℃、5％CO2、90％相对湿度的细胞培养箱培养。

10.一种如权利要求1至9任一所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法制备得到CIK细胞。

11.一种白术多糖和枸杞多糖在CIK细胞培养中的应用。

12.一种如权利要求1至9任一所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法制备得到的CIK细胞可用于肿瘤疾病的细胞治疗。