CN117487750A - Nk细胞在制备治疗免疫相关病症的药物中的用途 - Google Patents

Nk细胞在制备治疗免疫相关病症的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了NK细胞在制备治疗免疫相关病症的药物中的用途，属于细胞生物学技术领域。本发明所提供的NK细胞为使用地衣多糖和天蚕素A联合培养后获得的NK细胞。实验检测结果发现，本发明所提供的NK细胞具有高杀伤活性和高增殖能力，对于肺癌细胞具有显著的杀伤能力。因此，本发明为NK细胞的免疫治疗提供了更优异的细胞源，后续可以将地衣多糖和天蚕素A联合培养处理的NK细胞制备成免疫药物，用于有效治疗肿瘤等免疫相关疾病，提高NK细胞的免疫治疗效果。

Description

NK细胞在制备治疗免疫相关病症的药物中的用途
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及NK细胞在制备治疗免疫相关病症的药物中的用途。
背景技术
NK(自然杀伤)细胞是一类重要的先天性淋巴细胞，在机体的免疫监视和抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。NK细胞能够直接识别细胞表面异常的分子信号，并释放穿孔素等细胞毒分子杀伤这些异常细胞，包括肿瘤细胞、病毒感染细胞等，显示出强大的抗肿瘤和抗病毒活性。
由于NK细胞的这些独特功能，利用NK细胞进行免疫治疗已成为热门领域。目前，NK细胞常见的使用策略是从患者体内采集NK细胞，然后体外扩增后，将NK细胞回输给患者，从而使NK细胞充当抗肿瘤的生物导弹，从而直接攻击残留的肿瘤细胞。这种自体NK细胞回输疗法已被证实可以增强肿瘤患者的免疫力，提高肿瘤的响应率。
尽管NK细胞免疫治疗显示出巨大应用潜力，然而，现有的NK细胞回输疗法存在着扩增效率低和杀伤能力差的问题，因此需要进一步解决上述问题来提高NK细胞在免疫相关病症中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高细胞杀伤活性和高增殖能力的NK细胞，从而将其制备成高效的免疫相关病症的治疗药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种具有高杀伤活性和高增殖能力的NK细胞，所述NK细胞按照如下的培养方法培养得到：
(1)配置含有地衣多糖和天蚕素A的NK细胞培养基；
(2)使用NK细胞培养基将外周血单个核细胞重悬为细胞悬液；
(3)将细胞悬液接种到CD16包被的培养瓶中；
(4)置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中进行培养，每3天补充NK细胞培养基，培养至13天，收集纯化，得到具有高杀伤活性和高增殖能力的NK细胞。
优选地，所述NK细胞培养基的成分为：250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基，75μg/mL地衣多糖，75μg/mL天蚕素A；
或250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基，100μg/mL地衣多糖，50μg/mL天蚕素A；
所述细胞悬液的细胞含量为2.5×106/ml；
所述培养瓶的CD16包被浓度为10ng/mL。
第二方面，本发明提供了一种具有免疫增强作用的药物，所述药物由NK细胞和药学上可接受的载体组成；
所述NK细胞由如下的培养方法如下：
(1)按照如下配方配置NK细胞培养基：250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，100μg/mL地衣多糖，50μg/mL天蚕素A，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基；
(2)使用NK细胞培养基将外周血单个核细胞重悬为2.5×106/ml的细胞悬液；
(3)将每10mL的细胞悬液接种到10ng/mL CD16包被的培养瓶中；
(4)置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中进行培养，每3天补充NK细胞培养基，培养至13天，收集纯化，得到NK细胞。
第三方面，本发明提供了一种培养高杀伤活性和高增殖能力的NK细胞的培养方法，所述NK细胞的培养方法如上述NK细胞的培养方法所示。
第四方面，本发明提供了一种用于提高NK细胞杀伤活性和NK细胞增殖能力的培养基，所述培养基按照如下配方配置：
250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，100μg/mL地衣多糖，50μg/mL天蚕素A，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基。
第五方面，本发明提供了一种组合物在制备提高NK细胞杀伤活性的培养基中的应用，所述组合物由地衣多糖和天蚕素A组成，所述地衣多糖和天蚕素A的质量比例为2:1或1:1。
优选地，每1mL所述组合物中，地衣多糖和天蚕素A的含量为100μg和50μg，或75μg和75μg。
优选地，所述NK细胞杀伤活性为NK细胞对于肺癌细胞的杀伤活性。
第六方面，本发明提供了一种组合物在制备提高NK细胞增殖能力的培养基中的应用，所述组合物由地衣多糖和天蚕素A组成，所述地衣多糖和天蚕素A的质量比例为2:1或1:1。
优先地，每1mL所述组合物中，地衣多糖和天蚕素A的含量为100μg和50μg，或75μg和75μg。
第七方面，本发明提供了一种组合物在制备提高NK细胞穿孔素蛋白表达的培养基中的应用，所述组合物由地衣多糖和天蚕素A组成，所述地衣多糖和天蚕素A的质量比例为2:1或1:1。
优先地，每1mL所述组合物中，地衣多糖和天蚕素A的含量为100μg和50μg，或75μg和75μg。
本发明的有益效果在于：
本发明将地衣多糖和天蚕素A联合使用培养NK细胞，其能够显著提高NK细胞中穿孔素的表达，增强NK细胞的杀伤活性。实验检测结果显示，相较于单独使用地衣多糖或天蚕素A，联合使用两者培养的NK细胞对于肺癌细胞的杀伤率提高了58.49％；
其次，地衣多糖和天蚕素A的联用还可以显著促进NK细胞的增殖能力，实验检测结果显示，联合实验二者培养的NK细胞的增殖率提高了86.23％，明显高于单独使用二者培养的NK细胞；
因此，本发明为NK细胞的免疫治疗提供了更优异的细胞源，后续可以将地衣多糖和天蚕素A联合培养处理的NK细胞制备成免疫药物，用于有效治疗肿瘤等免疫相关疾病，提高NK细胞的免疫治疗效果。
附图说明
图1为采用不同培养方法培养的NK细胞中穿孔素的蛋白表达差异；
图2为采用不同培养方法培养的NK细胞对于肺癌细胞的杀伤率差异；
图3为采用不同培养方法培养的NK细胞的细胞增殖能力差异；
在图2和图3中，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员需要理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
(1)取新鲜抗凝血5ml，以3500转/分钟的速度离心10分钟，使血液分离为两层，上层为淡黄色血浆，下层为血细胞；
(2)去除上侧的淡黄色血浆层，按1:1的比例向下层血细胞加入生理盐水，用无菌的枪头轻轻混匀；
(3)在无酶离心管中加入10ml淋巴细胞分离液，小心将混合血细胞的生理盐水添加，1500转/分钟的速度离心20分钟；
(4)离心后，液体分为三层，最上层为淡黄色血浆，中间层为乳白色的淋巴细胞层，下层为红色的血细胞，小心收集中间的淋巴细胞层，转移到离心管中，10000转/分钟的速度离心5分钟；
(5)弃去上清，保留沉淀，用生理盐水洗涤2次后，得到外周血单个核细胞。
实施例2
(1)按照如下配方配置NK细胞培养基A：250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，100μg/mL地衣多糖(CAS号1402-10-4)，50μg/mL天蚕素A(CAS号80451-04-3)，10％自体血清，GT-T551H3无血清培养基；
(2)使用NK细胞培养基A将外周血单个核细胞重悬为2.5×106/ml的细胞悬液；
(3)将每10mL的细胞悬液接种到10ng/mL CD16包被的培养瓶中；
(4)置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中进行培养，每3天补充NK细胞培养基A，培养至13天。
实施例3
(1)按照如下配方配置NK细胞培养基B：250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，75μg/mL地衣多糖，75μg/mL天蚕素A，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基；
(2)使用NK细胞培养基B将外周血单个核细胞重悬为2.5×106/ml的细胞悬液；
(3)将每10mL的细胞悬液接种到10ng/mL CD16包被的培养瓶中；
(4)置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中进行培养，每3天补充NK细胞培养基B，培养至13天。
实施例4
(1)按照如下配方配置NK细胞培养基C：250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，150μg/mL地衣多糖，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基；
(2)使用NK细胞培养基C将外周血单个核细胞重悬为2.5×106/ml的细胞悬液；
(3)将每10mL的细胞悬液接种到10ng/mL CD16包被的培养瓶中；
(4)置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中进行培养，每3天补充NK细胞培养基A，培养至13天。
实施例5
(1)按照如下配方配置NK细胞培养基D：250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，150μg/mL天蚕素A，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基；
(2)使用NK细胞培养基D将外周血单个核细胞重悬为2.5×106/ml的细胞悬液；
(3)将每10mL的细胞悬液接种到10ng/mL CD16包被的培养瓶中；
(4)置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中进行培养，每3天补充NK细胞培养基D，培养至13天。
实施例6
(1)按照如下配方配置NK细胞培养基E：250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基；
(2)使用NK细胞培养基E将外周血单个核细胞重悬为2.5×106/ml的细胞悬液；
(3)将每10mL的细胞悬液接种到10ng/mL CD16包被的培养瓶中；
(4)置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中进行培养，每3天补充NK细胞培养基E进行扩增培养，培养至13天。
实施例7
(1)将5×106个实施例2-6培养后的NK细胞收集至离心管中，离心去除培养基；
(2)加入1ml的无菌PBS缓冲液，反复吹打清洗后，离心弃去上清；
(3)将离心管置于冰上，加入50μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液
(4)冰上放置30min，期间每10分钟涡旋混合一次，确保细胞完全裂解；
(5)将离心管置于离心机中，在4℃、12000转/分钟条件下离心20min，收集上清到新的离心管中；
(6)使用BCA法检测上清中蛋白浓度，之后根据浓度，分别加入上样缓冲液，混合均匀后，将离心管在100℃的沸水中孵育5分钟，从而使蛋白完全变性；
(7)准备玻璃板，按照要求配置分离胶溶液，加入玻璃板间隙中，用去离子水保护凝固的分离胶，待其凝固后弃去水层；
(8)配置浓缩胶溶液，按要求体积缓慢加入玻璃板间隙，插入相应梳子，待凝胶凝固后小心拔出梳子；
(9)组装电泳装置，加入电泳缓冲液，使用移液器吸取变性的蛋白样本和蛋白Marker加入到凝胶孔道中，之后接好电源进行80V预跑，蛋白Marker分开；
(10)调节电压至120V，继续进行电泳，直到溴酚蓝运行到胶片下端时结束电泳；
(11)将甲醇活化的PVDF膜、滤纸、海绵放入转膜液中浸泡，组装电转夹，300mA恒流转膜1.5h；
(12)将PVDF膜取出并放置到5％的脱脂奶粉中，室温下摇床封闭1h；
(13)使用TBST清洗PVDF膜3次，每次5min，孵育穿孔素(Perforin)抗体和GAPDH抗体，置于4℃冰箱中孵育过夜；
(14)一抗孵育结束后，使用TBST清洗PVDF膜3次，每次5min，孵育二抗，室温下孵育1h；
(15)暗室中，快速将发光液滴加至PVDF膜上，进行显像，得到图1的结果。
从图1的结果可以看出，相较于未添加地衣多糖和天蚕素A的实施例6，添加了地衣多糖和/或天蚕素A的实施例2-5的NK细胞中的穿孔素表达量均有一定程度的提高；
其次，可以看出，单独添加地衣多糖处理后的NK细胞穿孔素表达量高于单独添加天蚕素A处理后的NK细胞；
而，地衣多糖和天蚕素A同时添加处理后的NK细胞穿孔素表达量高于二者单独添加，产生了协同的效果；
同时，可以看出当地衣多糖和天蚕素A按照2:1的比例处理NK细胞时，对于NK细胞中穿孔素的表达促进效果最为显著。
因此，将地衣多糖和天蚕素A联合使用来培养NK细胞，可以显著的提高NK细胞中穿孔素的蛋白表达，从而可以增加NK细胞对于肿瘤细胞或病毒感染细胞的直接杀伤能力。
实施例8
(1)将1×107的按照实施例2-6方法培养的NK细胞分别重悬于40μL的NK细胞分选缓冲液中；
(2)加入10μL生物素标记的NK细胞分选抗体混合物，混匀后，4℃孵育5min；
(3)再次加入30μL的NK细胞分选缓冲液，并加入20μLNK细胞分选磁珠混合物(金准生物医药科技有限公司)混匀，4℃孵育10min；
(4)将MS分选柱放置在MiniMACS分选器中，使用500μL的NK细胞分选缓冲液冲洗分选柱；
(5)将步骤(2)的混合溶液置于分选柱上，收集包含未标记细胞的液体；
(6)使用500μL的NK细胞分选缓冲液洗涤MS分选柱，收集未经标记的细胞，将其于步骤(5)液体合并即得到分离后的NK细胞。
实施例9
(1)将处于对数生长期的肺癌细胞A549消化后，制备成1×105/mL的细胞悬液，接种100μL至96孔板中，置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中进行培养至细胞完全贴壁；
(2)将实施例8所分离的按照实施例2-6方法培养的NK细胞调整为2×106/ml的细胞悬液(实施例2-6分别设置为实验组1-5，实施例6设置为对照组)；按照5:1的效靶比加入到96孔板中，同时设置不添加NK细胞的空白组，每个处理组设置3个重复孔；
(3)96孔板置于细胞培养箱中，孵育4小时；
(4)取出加入CCK-8测定各孔的450nm的OD值，计算相较于空白组的杀伤率。
实验组1的杀伤率为65.49±4.98，实验组2的杀伤率为58.65±4.32，实验组3的杀伤率为50.92±3.29，实验组4的杀伤率为47.05±3.341，对照组的杀伤率为41.32±3.66。
相较于，对照组，实验组1的杀伤率提高了58.49％，实验组2的杀伤率提高了41.94％，实验组3的杀伤率提高了23.23％，实验组4的杀伤率为13.87％；
相较于单独使用地衣多糖和天蚕素A，实验组1的q值为1.73，实验组2的q值为1.24；
从上述结果能够看出，单独使用地衣多糖或天蚕素A培养NK细胞虽然可以一定程度的提高NK细胞的杀伤活性，但是提升的幅度较小；而当将地衣多糖和天蚕素A按照2:1或者是1:1的比例共同使用培养NK细胞时，q值均大于1.15。说明两组联用处理NK细胞后，能够对于NK细胞的杀伤活性产生明显的协同效果。
实施例10
(1)将实施例8所分离得到的实施例2-6的NK细胞使用NK细胞培养基E制备成单细胞悬液；
(2)按照每孔2×105/mL，每孔100μL的量接种到96孔板中，每种细胞设置3个重复孔，放置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中；
(3)待细胞培养72h后，加入CCK-8试剂测定各孔的450nm的OD值，计算相较于实施例6的NK细胞的细胞增殖率。
相较于对照组，实验组1的细胞增殖率为186.28±10.92，提高了86.28％，实验组2的细胞增殖率158.53±10.56，提高了58.53％，实验组3的细胞增殖率为134.28±10.65，提高了34.28％，实验组4的细胞增殖率为113.24±10.29，提高了13.24；
相较于单独使用地衣多糖和天蚕素A，实验组1的q值为2.01，实验组2的q值为1.36；
从上述结果能够看出，与NK细胞杀伤活性类似，联用地衣多糖和天蚕素A可以协同的促进NK细胞的增殖能力。
综上所述，当联合使用地衣多糖和天蚕素A处理NK细胞时，可以显著的增强培养的NK细胞中穿孔素的表达，从而可以有效的增强NK细胞对于如肺癌细胞的杀伤活性，增强NK细胞的免疫效果。
同时，地衣多糖和天蚕素A的联用还能够有效的促进NK细胞的增殖能力，从而可以进一步的更好发挥NK细胞的免疫效果。
因此，可以将本发明通过联合使用地衣多糖和天蚕素A处理后的NK细胞制备成免疫药物来有效的治疗肿瘤等免疫相关疾病。

Claims (10)

1.一种具有高杀伤活性和高增殖能力的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞按照如下的培养方法培养得到：
(1)配置含有地衣多糖和天蚕素A的NK细胞培养基；
(2)使用NK细胞培养基将外周血单个核细胞重悬为细胞悬液；
(3)将细胞悬液接种到CD16包被的培养瓶中；
(4)置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中进行培养，每3天补充NK细胞培养基，培养至13天，收集纯化，得到具有高杀伤活性和高增殖能力的NK细胞。
2.根据权利要求1所述的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞培养基的成分为：250IU/mLIL-2，20ng/mL IL-12，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基，75μg/mL地衣多糖，75μg/mL天蚕素A；
或250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基，100μg/mL地衣多糖，50μg/mL天蚕素A；
所述细胞悬液的细胞含量为2.5×106/ml；
所述培养瓶的CD16包被浓度为10ng/mL。
3.一种具有免疫增强作用的药物，其特征在于，所述药物由NK细胞和药学上可接受的载体组成；
所述NK细胞由如下的培养方法如下：
(1)按照如下配方配置NK细胞培养基：250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，100μg/mL地衣多糖，50μg/mL天蚕素A，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基；
(2)使用NK细胞培养基将外周血单个核细胞重悬为2.5×106/ml的细胞悬液；
(3)将每10mL的细胞悬液接种到10ng/mL CD16包被的培养瓶中；
(4)置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中进行培养，每3天补充NK细胞培养基，培养至13天，收集纯化，得到NK细胞。
4.一种培养高杀伤活性和高增殖能力的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述NK细胞的培养方法如权利要求3所述的培养方法所示。
5.一种用于提高NK细胞杀伤活性和NK细胞增殖能力的培养基，其特征在于，所述培养基按照如下配方配置：
250IU/mL IL-2，20ng/mL IL-12，100μg/mL地衣多糖，50μg/mL天蚕素A，10％自体血清，GT-T551 H3无血清培养基。
6.一种组合物在制备提高NK细胞杀伤活性的培养基中的应用，其特征在于，所述组合物由地衣多糖和天蚕素A组成，所述地衣多糖和天蚕素A的质量比例为2:1或1:1。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，每1mL所述组合物中，地衣多糖和天蚕素A的含量为100μg和50μg，或75μg和75μg。
8.根据权利要求7所述的应用，所述NK细胞杀伤活性为NK细胞对于肺癌细胞的杀伤活性。
9.一种组合物在制备提高NK细胞增殖能力的培养基中的应用，其特征在于，所述组合物由地衣多糖和天蚕素A组成，所述地衣多糖和天蚕素A的质量比例为2:1或1:1。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，每1mL所述组合物中，地衣多糖和天蚕素A的含量为100μg和50μg，或75μg和75μg。
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