JP2008278897A - 混在した細胞性組成物からのras介在性新生物細胞のレオウイルスクリアランス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ras介在性新生物細胞を選択的に溶解するレオウイルスで、混在した細胞性組成物を感染することによる、混在した細胞性組成物からras介在性新生物細胞を除去する方法に関する。多くの新生物細胞が活性化ras経路と関連しているため、本発明は広範囲の混在した細胞性組成物から、混在したまたは自然発生的な新生物細胞を除去するために使用できる。
【選択図】なし
Description
本出願は、35 U.S.C. 119(e)の下で、2000年5月3日に出願された米国予備出願60/201,990、2000年5月19日に出願された60/205,389、2001年2月13日に出願された60/268,054の利益を享受する。前述の予備出願のそれぞれの全体の開示は、参考としてここに取り込まれる。
ここで使用される用語、「新生物細胞」、または「増殖性疾患を有する細胞」は、正常な増殖阻害特性を有さずに増殖する細胞を指す。新生物細胞を含む新たな増殖物は、新生物または腫瘍である。新生物は、一般的に別個の塊を形成する異常な組織増殖であり、正常な組織増殖より迅速な細胞増殖によって増殖する。新生物は、正常な組織との構造的組織化及び機能的強調の部分的または完全な欠如を示すであろう。ここで使用される新生物は、造血性新生物、並びに固形新生物を包含するように企図される。
本発明は、ras介在性新生物細胞を含む疑いのある細胞性組成物からras介在性新生物細胞を除去するレオウイルスの使用に関する。活性化ras経路は多くの腫瘍と関連しているため、本発明は広範囲の新生物細胞のいずれを有する疑いのある細胞性組成物にも適用できる。
℃ = 摂氏の温度
hr = 時間
min = 分
μM = マイクロモーラー
mM = ミリモーラー
M = モーラー
ml = ミリリットル
μl = マイクロリットル
mg = ミリグラム
μg = マイクログラム
PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動
rpm = 回転/分
FBS = 胎児ウシ血清
DTT = ジチオスレイトール
SDS = ドデシル硫酸ナトリウム
PBS = リン酸緩衝生理食塩水
DMEM = ダルベッコ修飾イーグル培地
α−MEM = α−修飾イーゲル培地
β−ME = β−メルカプトエタノール
MOI = 感染の多様性
PFU = プラーク形成ユニット
PKR = 二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ
EGF = 上皮増殖因子
PDGF = 血小板由来増殖因子
DMSO = ジメチルスルホキシド
CPE = 細胞変性効果
GCSF = 顆粒球コロニー刺激因子
新生物細胞の生存能力に対するレオウイルスの効果を測定するために、最初に3種の乳ガンモデル系、MCF7(ATCCナンバーHTB-22)、SKBR3(ATCCナンバーHTB-30)、及びMDA MB 468(ATCCナンバーHTB 132)を使用した。各細胞系の細胞を50−60%の密度に増殖し、40の感染の多様性でレオウイルス血清型3、Dearing株で感染した。レオウイルスは、米国特許第6,136,307号に記載されたように得て維持した。レオウイルス感染及び非感染細胞を、感染の0、24、48及び72時間後に回収し、生存能力を測定した。
幹細胞の選択的なウイルス感染のさらなる証拠のために、ウイルスタンパク質の35Sラベリング/SDS/PAGEを実施した。ウイルスタンパク質合成は、レオウイルスで感染されたMCF7細胞において1−2日後に明らかであった一方、細胞のタンパク質合成は同じ時点で減少し、レオウイルスが細胞マシネリーを乗っ取っていることが示された。感染の4日後では、タンパク質合成はさらには検出できず、全ての細胞が死んでいることを示唆した。細胞を死んだレオウイルスまたはウイルスなしで感染したコントロール実験では、ウイルスタンパク質合成は存在しない一方、細胞のタンパク質合成は正常レベルであった。対照的に、レオウイルスの存在下または不存在下でのCD34+幹細胞の35Sラベリングは、ウイルスの添加の後72時間までウイルスタンパク質合成を示さなかった。それ故、レオウイルスはMCF7細胞に選択的に感染するが、CD34+幹細胞には感染しない。
タンパク質合成の結果と一致して、生存細胞カウントは、レオウイルス処理が、ウイルスなしのコントロールと比較してCD34+細胞における生存細胞の数を減少しないことを示した(図3A)。
新生物細胞をアフェレーシス産物と混合し、レオウイルス感染にかけ、レオウイルスが混在した細胞性組成物から新生物細胞を選択的に除去できるかを調べた。アフェレーシス産物は、以前に記載された方法に従って調製した(Stewart等, 1999; Duggan等, 2000)。アフェレーシス産物(90%)とMCF7(10%)の混合物をレオウイルスで処理し、細胞カウントを生存能力について毎日試験すると、サイトケラチンポジティブMCF7細胞の数の100倍の枯渇が存在する一方、CD34+細胞は完全で生存したままであった。図4A−4Cは、MCF7、SKBR3またはMDA MB 468細胞を有するアフェレーシス産物の混合物に対するレオウイルスの清浄化効果を示す。これらの結果は、レオウイルスが細胞混合物中の新生物細胞を選択的に殺傷し、幹細胞は完全なまま維持すること示す。
Claims (24)
- ras介在性新生物細胞を含む疑いのある細胞性組成物からras介在性新生物細胞を除去する方法であって、ras介在性新生物細胞の腫瘍崩壊を引き起こす条件下で、前記細胞性組成物をレオウイルスと接触させることを含む方法。
- 細胞性組成物が造血幹細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 造血幹細胞が骨髄から収集されている、請求項2記載の方法。
- 造血幹細胞が血液から収集されている、請求項2記載の方法。
- 細胞性組成物が、組織、器官、または組織若しくは器官のいずれかの一部を含む、請求項1記載の方法。
- 組織または器官が、肝臓、腎臓、心臓、大腸、皮膚、肺、膵島細胞、及び全血からなる群から選択される、請求項5記載の方法。
- 組織、器官、または組織若しくは器官の一部が、移植に有用である、請求項5記載の方法。
- 細胞性組成物が、培養細胞、精子、または卵を含む、請求項1記載の方法。
- レオウイルスが哺乳動物レオウイルスである、請求項1記載の方法。
- レオウイルスが鳥類レオウイルスである、請求項1記載の方法。
- 哺乳動物レオウイルスがヒトレオウイルスである、請求項9記載の方法。
- 哺乳動物レオウイルスが血清型3ウイルスである、請求項9記載の方法。
- 血清型3ウイルスがDearing株である、請求項12記載の方法。
- DMSOを含む溶液中にレオウイルスで処理された組成物を凍結して貯蔵する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- レオウイルスで処理された組成物を、抗レオウイルス抗体及び補体で処理する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- レオウイルスから細胞を分離する勾配に処理された細胞をかけ、細胞を含む層を回収する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 以下の工程:
(a)移植のための細胞性組成物を選択する工程;並びに
(b)ras介在性新生物細胞の腫瘍崩壊を引き起こす条件下で、前記組成物をレオウイルスと接触させる工程;
を含む、受容者に移植するための細胞性組成物を調製する方法。 - 前記移植が自己移植である、請求項17記載の方法。
- 抗レオウイルス抗体及び/または免疫系刺激剤からなる群から選択される少なくとも一つの物質を、移植受容者に投与する工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 移植を受ける患者から造血幹細胞を含む細胞性組成物を収集する工程、ras介在性新生物細胞の腫瘍崩壊を引き起こす条件下で、前記細胞性組成物をレオウイルスと接触させる工程、レオウイルスで処理された組成物を患者に戻す工程を含む、ras介在性新生物細胞を含む疑いのある自己造血幹細胞の移植のための腫瘍の再発の危険を減少する方法。
- 請求項1記載の方法に従って調製された細胞性組成物。
- 移植において使用される、請求項21記載の組成物。
- 前記移植が自己移植である、請求項22記載の組成物。
- 前記組成物が造血幹細胞を含む、請求項23記載の組成物。
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