DE69929986T2

DE69929986T2 - Verfahren zur entfernung von hiv und anderen viren aus blut

Info

Publication number: DE69929986T2
Application number: DE69929986T
Authority: DE
Inventors: Julian L. Buffalo Ambrus; David O. Eggertsville Scamurra
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1999-08-30
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2019-08-31
Also published as: WO2000012103A1; EP1109564A4; AU770344B2; DE69929986D1; US6528057B1; EP1109564B1; AU5785299A; CA2342203A1; ATE318176T1; EP1109564A1; CA2342203C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der therapeutischen Möglichkeiten zur Behandlung viraler Infektionen. Insbesondere stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Reduktion der viralen Last durch extrakorporale Behandlung des Patientenbluts mit immobilisierten Molekülen mit einer spezifischen Affinität für virale Komponenten bereit.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Das humane Immundifiziensvirus (HIV) ist das ätiologische Agens des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) und infiziert ausgewählte Zellen des Immunsystems, indem die Immunantwort des infizierten Individuums beeinträchtigt wird. Es wird geschätzt, dass es über 1 Million HIV-infizierte Individuen in den Vereinigten Staaten gibt, und über 13 Millionen weltweit. Der klinische Verlauf einer HIV-Infektion besteht typischerweise aus einer ausgedehnten asymptomatischen Phase, gefolgt vom Abbau der T4-Lymphozyten, wodurch das Individuum empfänglich für opportunistische Infektionen und Neoplasmen gemacht wird.
Gegenwärtig ist keine Therapie für eine HIV-Infektion verfügbar. Die Mononukleosid-Wirkstoffe wie AZT, dI, ddC und d4T, welche die reverse Transkriptase inhibieren, sind für die Behandlung von HIV zugelassen worden. Weiterhin werden nun auch Protease-Inhibitoren eingesetzt. Gleichwohl begrenzt die Emergenz von Wirkstoff-resistenten Mutanten die Verwendbarkeit dieser Wirkstoffe.
Die Entwicklung einer wirksamen Vakzine gegen HIV-Infektionen ist gestört, teilweise bedingt durch die schnelle Mutation des HIV-Genoms und bedingt durch die fehlende Zugänglichkeit der Immunogen-Epitope viraler Proteine. Das gesamte HIV-Genom ist mittlerweile sequenziert worden (Ratner et al., 1987, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 3(1):57-69).
Das HIV-Genom kodiert für drei Hauptstruktur-Gene, gag, pol und env, welche an jedem Ende durch lange terminale Wiederholungs (LTR)-Sequenzen flankiert werden. Die HIV-Gene kodieren 3 virale Enzyme, die reverse Transkriptase (p51+p66+ RNase H), die Integrase (p32) und die Protease (p12), eingeschlossen in einem zylindrischen Proteinkern, zusammengesetzt im wesentlichen aus p24. Das Matrix-Protein (p17) und eine Lipid-Membran, welche zwei Hauptoberflächen-Glycoproteine ("envelope glycoproteins"), gp41 und gp120, enthält, umgeben den Proteinkern. Das Virion hat einen Durchmesser von 110 nm (Gallo, 1995, Nat. Med., 1:753-759).
Damit HIV-1 eine Zelle infizieren kann, muss das virale gp120 an CD4 sowie an einen Oberflächen-Chemokin-Rezeptor (im allgemeinen CCRS (R5) oder CxCR4 (X4)) binden. Sobald es durch Endozytose aufgenommen ist, wird das Virion entmantelt. Die virale RNA wird in doppelsträngige DNA reverstranskripiert, tritt in den Zellkern ein und integriert sich in das Wirtsgenom.
Die Transkription der integrierten viralen DNA führt zur Produktion von viraler RNA sowie zu verschiedenen mRNAs, welche in virale Proteine translatiert werden, wobei einige von diesen eine weitere proteolytische Verarbeitung benötigen. Reife Virionen setzen sich zusammen und werden aus der Zelle durch „budding" freigesetzt (Fauci et al., 1996, Ann. Int. Med., 124:654-663). Eine sterbende Zelle kann auch ihren Inhalt, einschließlich intakter Virionen und Fragmenten davon, in das Blut freisetzen. Daher enthält das zirkulierende Blut von HIV-infizierten Individuen sowohl intakte Virionen, Fragmente davon als auch freie RNA.
Isolate von HIV von verschiednen Spendern zeigen eine Variabilität in den Oberflächen-Glykoproteinen. Die Variabilität bei gp120 ist stärker ausgeprägt als die Variabilität bei gp41. Fünf variable Regionen sind mit konservierten Sequenzen innerhalb von gp120 durchsetzt. Die Mehrzahl der neutralisierenden Antikörper gegen HIV-1 ist gegen die V3-Schleife von gp120 gerichtet, obwohl einige neutralisierende Antikörper auch die V2- und die C4-Domänen sowie auch Epitope bei gp41 erkennen. Innerhalb der V3-Schleife von gp120 ist die am stärksten konservierte Sub-Domäne die Sequenzfolge Glycin317-Prolin318-Glycin319-Arginin320-Alanin321-Phenylalanin322. Die Viren mit Mutationen, die Glycin317-Prolin318-Alanin319 betreffen, sind nicht infektiös. Die Oberflächensequen zen („envelope sequences") lassen eine Unterscheidung von HIV-1 in die M- und O-Gruppen zu. Innerhalb von M werden die Untergruppen A-H erkannt, wobei die Untergruppe B prävalent in den Vereinigten Staaten ist.
Die HIV-Replikation tritt vorwiegend in CD4+-Lymphocyten auf, wobei die Mehrzahl derselben in den Lymphorganen angesiedelt ist, z.B. in den peripheren Lymphknoten und der Milz. HIV-1 kann auch in Makrophagen und Makrophagen-artigen Zellen gefunden werden, z.B. in Mikroglia des zentralen Nervensystems (Cohen et al., 1997, Immunol Rev. 159:31-48). Die Plasma-HIV-1-Konzentrationen und die Präsenz von HIV-1-infizierten Lymphozyten im peripheren Blut korreliert stark mit dem klinischen Status des HIV-1-infizierten Patienten (Ferre et al., 1995, J Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol 10:51-56; Obrien et al., 1996, N Engl J Med., 334:426-431). Die Halbwertszeit der zirkulierenden Virionen beträgt 6 Stunden, während die Halbwertszeit von HIV-1-infizierten Zellen im peripheren Blut 1,6 Tage beträgt. Mehr als 10¹⁰ Virionen können in den Blutkreislauf an jedem Tag freigesetzt werden (Ho et al., 1995, Nature 373:123-126; Wei et al., 1995, Nature 373:117-122). Die Fähigkeit des Wirtsimmunsystems die HIV-Infektion unter Kontrolle zu halten und die klinischen Symptome zu begrenzen, ist direkt proportional zur viralen Last. Die antiretroviralen Therapien, Nukleosidanaloga, nicht-nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren und Protease-Inhibitoren, stellen auf eine Reduktion der viralen Last ab, so dass das Immunsystem die verbleibende Infektion kontrollieren oder beseitigen kann (Fauci et al., 1998, Harrison's Principles of Internal Medicine, 1791-1856).
Es sind keine früheren Verfahren entwickelt worden, welche HIV aus dem Blut unter Verwendung von in vivo Dialyse oder Immunabsorption direkt absorbieren. Extrakorporale Perfusion von Plasma über Protein A, Plasmapherese und Lymphapherese sind alle als immunmodulatorische Behandlungen für HIV-Infektionen eingesetzt worden, mit dem Ergebnis einer Trombozytenpänie (Kiprov, 1990, Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus., 57:184-197; Snyder et al., 1989, Artif Organs 13:71-77; Mittelman, 1989, Semin Hematol 26:15-18; Snyder et al., 1991, AIDS 5:1257-1260). Diese Therapien sind alle für eine Arbeitsweise vorgeschlagen wurden, bei der die Immunkomplexe und andere humorale Mediatoren, welche während der HIV-1-Infektion generiert werden, beseitigt werden. Sie beseitigen daher nicht direkt das HIV-Virus. Die extrakorporale Photopherese ist in vorläufigen klinischen Versuchen getestet wurde, und zwar als Mechanismus zur Begrenzung der viralen Replika tion (Bisaccia et al., 1990, Intern Med 113:270-275; Bisaccia et al., 1993, J. Acquir Immune. Defic. Syndr. 6:386-392). Sie absorbiert nicht das Virus aus dem Blut. Es ist berichtet worden, dass Kaninchen-Antiseren, die gegen HIV-1-Proteine erhalten wurden, wenn diese an Sepharose 4B oder Silika gekoppelt waren, für eine extrakorporale Beseitigung von HIV-Proteinen aus dem Blut der Kaninchen, welche mit rekominanten HIV-1-Proteinen injiziert worden waren, eingesetzt werden konnten (Lopukhin et al., 1991, Vestn Akad Med Nauk SSSR 11:60-63). Diese Strategie war ineffizient und wurde offenbar nicht weiterverfolgt. Sie machte die extrakorporale Absorption von Blut erforderlich und stellte keinen Mechanismus bereit, mit dem freie virale HIV-Partikel aus dem Blut beseitigt werden (Lopukhin et., 1991, supra).
Daher besteht ein fortdauernde Bedarf an neuen therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von HIV und anderen viralen Infektionen. Insbesondere besteht Bedarf für die Entwicklung neuer Ansätze zur Reduktion der viralen Last, so dass die Wirksamkeit von anderen Behandlungen und/oder die Immunantwort verstärkt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein ex-vivo-Verfahren zur Reduktion der viralen Last von Patienten bereit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt die Beseitigung von intakten Virionen, Fragmenten oder Komponenten davon, einschließlich freier viraler Nukleinsäure, aus dem Blut bereit, indem extrakorporal Blut durch Hohlfasern, welche auf der porösen äußeren Oberfläche Affinitätsmoleküle mit einer Spezifität für virale Komponenten haben, zirkuliert. Die Passage von Blut durch die Hohlenfasern verursacht die Bindung der Virionen und Komponenten davon an die Affinitätsmoleküle, wodurch die virale Last in dem Effluenz verringert wird.
In einer Ausführungsform verwendet die Erfindung DNA-Sequenzen, für welche gezeigt worden ist, dass sie an viele isolierte Subtypen von HIV-1 in vitro hybridisieren (Wilber, 1997, supra), und Antikörper, für welche gezeigt worden ist, dass sie an intakte Virionen vieler HIV-1-Subtypen in vitro binden (VanCott et al., 1994, Immunol. 153:449-459).
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verringert die Anzahl der Virionen im Blut und trägt somit die signifikant zur Reduktion der viralen Last bei. Es ist für die Fachleute ohne weiteres offensichtlich, dass die Vorrichtung modifiziert werden kann, um die „clearance" von anderen viralen Infektionen, häufig gleichzeitig auftretend mit HIV-1, bspw. Cytomegalovirus (CMV), Hepatitis B-Virus (HBV), und Hepatitis C-Virus (HCV) zu unterstützen (Fauci et al., 1998, supra).
Daher ist es ein Ziel der Erfindung ein ex-vivo-Verfahren zur Reduktion der viralen Last im Blut eines Individuums, das mit dem Virus infiziert ist, bereitzustellen.
Ein anderes Ziel dieser vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Reduktion der viralen Last im Blut durch extrakorporale Zirkulation des Bluts durch Hohlfasern, enthaltend immobilisierte Moleküle mit einer spezifischen Affinität für virale Komponenten, bereitzustellen. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Apparat, umfassend Hohlfasern, bereitzustellen, wobei die äußere Oberfläche der Fasern in enger Nachbarschaft mit Molekülen mit einer spezifischen Affinität für Zielmoleküle in dem Virus ist.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen:
1 ist eine schematische Illustration eines Längsschnitts einer Affinitätskartusche.
2 ist eine schematische Illustration eines Horizontalschnitts bei Ebene 2 von 1.
3 ist eine Illustration eines Kanals aus 2.
4 ist eine graphische Darstellung der Beseitigung von gp120 aus Kulturmedien durch eine Anti-HIV-Säule entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Die 5a und 5b sind graphische Darstellungen der Beseitigung von HIV aus dem Überstand von HL 2/3-Zellen unter Verwendung einer Anti-HIV-Säule.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Bezeichnung „Zielmolküle" („target molecules"), wie sie hierin für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet wird, bedeutet ein Molekül, welches Bindungsspezifität an ein Affinitätsmolekül zeigt. Das Zielmolekül kann das ganze Molekül sein, wie es in einem intakten Virus auftritt, oder es kann ein Teil davon sein.
Die Bezeichnung „Affinitätsmolekül" („affinity molecule"), wie hierin für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet, bedeutet ein Molekül mit einer spezifischen Affinität für das Zielmolekül. Somit sind ein Antikörper (monoklonal oder polyklonal), der spezifisch an ein Molekül oder einen Liganden von Interesse bindet, oder eine Oligonukleotid-Sequenz, die mit einer Nukleinsäure von Interesse hybridisiert, wie bspw. einer viralen RNA, Beispiele von Affinitätsmolekülen. Der Ligand, an den der Antikörper bindet, und die Nukleinsäure-Sequenz, mit der die Oligonukleotid-Sonde hybridisiert, sind die Zielmoleküle.
Die Bezeichnung „virale Last" („viral load"), wie für den Zweck der Beschreibung und der Ansprüche hierin verwendet, bezieht sich auf alle Formen von Virus oder Fragmenten oder Komponenten davon in einer Flüssigkeit, wie bspw. Blut, insbesondere allen Formen von HIV oder Fragmenten davon. Somit schließt sie intakte Virionen, Fragmente davon und freie virale Nukleinsäure ein.
Seit der Identifizierung von HIV als dem ursächlichen Agens für AIDS wurden Methoden zur ex-vivo-Abtötung von HIV etabliert. Das Screening von Blutprodukten und -spenden auf die Anwesenheit von HIV ist zur Routine geworden (Fauci et al., 1998, supra). Sensitive PCR- und Hybridisierungstechniken sind entwickelt worden, um HIV im Blutproben zu quantifizieren (Ordea et al., 1993, AIDS 7 Suppl 2:S11-14; Wilber, 1997, Immunol Invest 26:9-13). Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Reduktion der viralen Last durch extrakorporale Behandlung des Bluts des Individuums bereit. Die Methode umfasst die Schritte des Erhaltens des Patientenbluts, des Kontaktieren des Bluts mit immobilisierten Affinitätsmolekülen, spezifisch für das Virus, und der Rückführung des ungebundenen Bluts zum Individuum. Die Affinitätsmoleküle der vorliegenden Erfindung können gegen die virale Nukleinsäure oder gegen virale Proteine gerichtet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Affinitätskartuschen durchgeführt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung einer Vorrichtung, wie in 1 illustriert, durchgeführt werden. Vorrichtungen dieses allgemeinen Typs werden in den US-Patentnummern 4,714,556 und 4,787,974 offenbart. In dieser Vorrichtung wird das Blut durch das Lumen einer Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran geführt, welche in engem Kontakt auf der nicht-blutnassen Seite der Membran mit immobi lisierten Affinitätsmolekülen ist, welche Mittel ausbilden, um die Viren zu akzeptieren und zu immobilisieren. Daher wird die Ultrafiltrationsmembran die intakten Virionen und freie virale Nukleinsäure zurückhalten, während es anderen Komponenten ermöglicht wird, durch das Lumen hindurchzutreten. HIV ist das prototypische Virus, für welches diese Erfindung beschrieben wird, allerdings kann die Erfindung auch an die Beseitigung beliebiger in Blut enthaltener Viren angepasst werden. Die Vorrichtung, beschrieben im Detail in den US-Patenten 4,714,556 und 4,787,974, schließt Vielfachkanäle einer Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran ein, welche eine Filtrationskammer ausbilden. Eine Einlass- und eine Ausflussöffnung stehen in Verbindung mit der Filtrationskammer.
Die Ultrafiltrationsmembran ist vorzugsweise eine anisotrope Membran mit der dichten oder Retentionsseite, welche den Blutstrom ausgesetzt ist. Die Membran wird üblicherweise gebildet von einer Anzahl von Polymeren, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel Polysulfon, Polyethersulfon, Polyamide, Polyimide, Cellulose-Acetat und Polyacrylamid. Vorzugsweise hat die Membran Poren von 200 bis 500 nm im Durchmesser, welche die Passage von intakten Viren und viralen Partikeln und Fragmenten ermöglichen (nämlich einem HIV-Virion mit 110 nm Durchmesser), allerdings nicht der meisten Blutzellen (rote Blutzellen mit einem Durchmesser von 2.000 nm, Lymphozyten mit 7.000 bis 12.000 nm Durchmesser und Macrophagen mit 10.000 bis 18.000 nm Durchmesser). Ein Diagram der Vorrichtung ist in 1 gezeigt. Ein Querschnitt dieser Vorrichtung wird in 2 gezeigt. Ein Querschnitt einer individuellen Hohlfaser-Membran wird in 3 gezeigt. In Bezug auf 1 enthält die Kammer 12 eine Vielzahl an Hohlfaser-Membranen. Diese Membranen haben vorzugsweise einen Innendurchmesser von 0,3 mm und einen Außendurchmesser von 0,5 mm.
Für das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird Blut aus einem Patienten entnommen und mit der Ultrafiltrationsmembran (mit den Zielmolekülen) kontaktiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Blut in sein Plasma und in die zellulären Komponenten getrennt. Das Plasma wird dann mit den Affinitätsmolekülen, die spezifisch für das Virus sind, kontaktiert, um das Virus oder dessen Komponenten zu entfernen. Nach Entfernung der Virionen und/oder der freien Nukleinsäure kann das Plasma mit den zellulären Komponenten wieder kombiniert werden und zum Patienten zurückgeführt werden. Alternativ können die zellulären Komponenten zum Patienten separat zurückgeführt werden. Die Behandlung kann periodisch wiederholt werden, bis die erwünschte Antwort erreicht worden ist. Zum Beispiel kann die Behandlung für zwei Stunden alle zwei Wochen durchgeführt werden. Die essentiellen Schritte der vorliegenden Erfindung sind somit (a) das Kontaktieren der Körperflüssigkeit mit dem Affinitätsmolkül, das auf einer Ultrafiltrationsmembran immobilisiert ist, unter Bedingungen, die die Bildung von gebundenen Komplexen der Affinitätsmoleküle und ihrer jeweiligen Zielmoleküle ermöglichen; (b) das Sammeln ungebundener Materialien; und (c) Reinfusion der ungebundenen Materialien in den Patienten.
Der Affinitätsmoleküle der vorliegenden Erfindung können gegen Proteine/Peptide oder Nukleinsäure-Sequenzen der Virionen gerichtet sein. Der Affinitätsmoleküle für die Nukleinsäuresequenzen sind im allgemeinen Oligonukleotid-Sequenzen, die zu der viralen Sequenz komplementär sind. Die viralen Nukleinsäuren werden für die Affinitätsmoleküle teilweise dadurch zugänglich, dass freie virale RNA aus den sterbenden Zellen oder aus den Zellen, die defektive Viren enthalten (wie es während einer antiviralen Therapie auftreten kann), freigesetzt wird. Es ist bevorzugt, die Affinitätsmoleküle, die gegen Nukleinsäure-Sequenzen oder Epitope, die in dem Virus konserviert sind, gerichtet sind, zu verwenden. Zum Beispiel im Falle von HIV-1 schließen einige der konservierten Regionen die 5'- und 3'-LTR und Regionen des env-Gens ein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Sonden für den 5'-LTR-Bereich entworfen. Für den Fall, dass das Zielmolekül ein Protein ist, können die Epitope aus den konservierten Bereichen der viralen Hüllproteine (coat proteins), die gegenüber Antikörpern im intakten Virus zugänglich sind, ausgewählt werden. Solche Bereiche schließen die V3-Schleife von gp120 ein, sind hierauf aber nicht beschränkt.
Die Technologie zur Imobilisierung der Enzyme, Chelatoren und Antikörper in den dialyseartigen Kartuschen ist entwickelt wurden (Kalghatgi et al., 1980, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 27:551-561; Armbrus, 1978, Science, 201:837-839) und wird hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Die Kartuschen können direkt mit dem Blut der Patienten durch direkten venösen Zugang perfundiert werden, was zu den Patienten ohne weitere Eingriffe rückgeführt wird. Alternativ kann das Blut auch in Plasma und zelluläre Komponenten durch Standardtechniken separiert werden. Die zellulären Komponenten können mit dem Plasma kombiniert werden, und zwar vor Reinfusion, oder die zellulären Komponenten können separat reinfundiert werden. Die virale Last kann im Effluens aus der Kartusche durch Standardtechniken, wie bspw. ELISA oder Nukleinsäure-Amplifiktations- und -Detektionstechniken untersucht werden. Prototypische Kartuschen sind eingesetzt worden, um Überschuss-Phenylalanin zu metabolisieren (Kalghatgi et al., 1980, supra; Ambrus, 1978, supra) oder um Überschuß-Aluminium aus dem Blut von Patienten zu entfernen (Anthone et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol., 6:1271-1277). Diese Technologie kann mit Antikörpern oder anderen absorbierenden Materialien eingesetzt werden. Eine Illustration der Präparation von Antikörpern für die Immobilisierung an Hohlfasern für das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wird in den US-Patenten 4,714,556 und 4,787,974 dargestellt.
Die Technologie zur Immobilisierung von DNA-Fragmenten auf Plastik, welche die Fähigkeit zur spezifischen Hybridisierung an HIV, HBV oder HCV beibehalten, ist für in vitro ELISA-artige Assays entwickelt worden (Urdea et al., 1993, supra; Wilber, 1997, supra; Chen et al., 1995, J. Virol. Methods, 53:131-137; Deeks et al., 1997, J. Infect. Dis., 176:514-517; Flood et al., 1997, J. Infect. Dis., 176:348-352; Lu et al., 1998, J. Clin. Lab. Anal., 12:121-125; Sherman et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31:2679-2682). Dieselbe Technologie kann auch eingesetzt werden, um die Fragmente der DNA auf dialyseartigen Kartuschen zu immobilisieren.
Zur Bindung von Affinitätsmolekülen an eine Ultrafiltrationsmembran werden die Polymere der Ultrafiltrationsmembran zuerst aktiviert, nämlich indem sie für die chemische Kombination mit Proteinen durch im Stand der Technik eingesetzte Verfahren empfänglich gemacht werden. Jede beliebige Anzahl von verschiedenen Polymeren kann eingesetzt werden. Um ein reaktives Polyacrylsäure-Polymer zu erhalten, können z.B. Carbodiimide verwendet werden (Valuev et al., 1998, Biomaterials, 19:41-43). Sobald das Polymer einmal aktiviert worden ist, können die Affinitätsmoleküle direkt oder über einen Linker angehängt werden. Geeignete Linker schließen Avidin, Strepavidin, Biotin, Protein A und Protein G ein, ohne hierauf beschränkt zu sein. Zum Beispiel können Antikörper gegen virale Hüllproteine auf Strepavidin-beschichtete Polymere der Ultrafiltrationsmembran gebunden werden. Die Strepavidin-beschichtete Ultrafiltrationsmembran kann auch für die Anhängung von Oligonukleotid verwendet werden, an welches eine Biotin-markierte Base zum 3'-Ende hinzugefügt worden ist.
Die Antikörper können auch direkt an das Polymere der Ultrafiltrationsmembran gebunden werden und zwar unter Verwendung von Kopplungsagenzien, wie bspw. bifunktionalen Reagenzien, oder können indirekt gebunden werden. Zum Beispiel können Protein A oder Protein G zur Immobilisierung von IgG gegen spezifische HIV-Epitope eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde Protein G-Sepharose verwendet, um die Anti-HIV-Antikörper zu binden, und wurde dann mit den Antikörpern kreuzvernetzt unter Verwendung eines biofunktionalen Reagenz.
Beispiel 1
Diese Ausführungsform illustriert eine Vorrichtung für die Methode der vorliegenden Erfindung. Wie in 1 gezeigt, umfasst die Vorrichtung eine Kartusche 10, die eine Blutprozessierungskammer 12 umfasst, gebildet aus einer inneren Glaswand 14. Um die Kammer 12 ist eine optionale äußere Kammer 16 angeordnet. Eine Flüssigkeit zur Temperaturkontrolle kann in die Kammer 16 durch einen Zugang bzw. Öffnung 18 und einen Auslass 20 zirkuliert werden. Die Vorrichtung schließt eine Einlass-Öffnung 32 für das Blut und eine Auslass-Öffnung 34 für das Effluens ein. Die Vorrichtung stellt auch einen oder mehr Zugänge bzw. Öffnungen 48 und 50 bereit, um den außerhalb des Kanals/der Kanäle befindlichen Raum in der Kartusche zugänglich zu machen. Wie in den 1 und 2 gezeigt, enthält die Kammer 12 eine Vielzahl von Ultrafiltrationsmembranen 22. 3 ist eine Querschnitts-Darstellung eines Kanals 22 und zeigt die anisotrope Natur der Membran. Wie in 3 gezeigt, ist die Hohlfaser-Membranstruktur 40 aus einem einzigen Polymermaterial zusammengesetzt, das zu einem tubulären Abschnitt geformt ist, umfassend eine relativ feste Ultrafiltrationsmembran 42 und einen relativ porösen äußeren Teil 44, in welchem die Affinitätsmoleküle 46 immobilisiert werden können.
Während des Betriebs der Vorrichtung wird eine Lösung, enthaltend die Affinitätsmoleküle, nämlich den Antikörper oder die Oligonukleotid-Sonde, auf die Vorrichtung durch den Zugang bzw. Öffnung 48 geladen. Die Affinitätsmoleküle können auf der äußeren Seite 22 der Membran in 2 immobilisiert werden. Ungebundene Affinitätsmoleküle können aus dem Zugang bzw. Öffnung 50 durch Waschen mit (Koch)-Salzlösung oder anderen Lösungen gesammelt werden.
Beispiel 2
Die Präparation von Antikörpern für die Immobilisierung an die Ultrafiltrationsmembranen wird im US-Patent US 4,787,984 offenbart. Die Aktivierung der Polymere wird so ausgeführt, wie in US-Patent 4,787,974 beschrieben. Eine Illustration der Methode zur Präparation der Affinitätsmoleküle für die Immobilisierung auf den äußeren Oberflächen der Ultrafiltrationsmembranen 22 erfolgt, wie nachfolgend beschrieben.
Die Antikörper gegen die viralen Hüllproteine (nämlich gp120 von HIV) und ein Linker (bspw. Strepavidin), welche im Stand der Technik bekannt sind, werden bei Konzentrationen von jeweils 50 bis 200 mg/ml in einer Phosphat-gepufferten (Koch)salzlösung pH 7,0 aufgelöst. Glutaraldehyd wird in einer Konzentration von 0,1% zur Antikörper- und Strepavidin-Lösung hinzugefügt und für 12 Stunden bei 4° C inkubiert. Überschuß-Glutaraldehyd wird durch Zugabe von Glycin zur Lösung am Ende der Reaktion entfernt. Die Lösung wird dann mit normaler (Koch)salzlösung unter Verwendung einer Membran, welche Moleküle größer als 50.000 Dalton ausschliesst, dialysiert und die Reaktion mit einem aktivierten Polymer wird zugelassen, was zu einem Polymer mit dem Antikörper und Strepavidin, welches mit dem Antikörper irreversibel kreuzvernetzt ist, führt. Die Oligonukleotide, die mit dem viralen Genom von Interesse (nämlich HIV) hybridisieren werden, werden unter Hinzufügung einer Biotin-markierten Base am 3'-Ende synthetisiert. Geeignete Sequenzen für die Oligonukleotid-Synthese sind im Stand der Technik bekannt. Die Biotin-markierten Oligonukleotide lässt man mit den Strepavidin-gekoppelten Polymeren reagieren, was zu Hohlfaser-Membranen führt, welche sowohl die Antikörper als auch die irreversibel gebundenen Oligonukleotide aufweisen.
Die Kartuschen, die aus den Hohlfaser-Membranen mit den gekoppelten Antikörpern und Oligonukleotiden bestehen, werden mit einem Liter steriler (Koch)salzlösung gewaschen und dann durch Exposition mit 7% Ethylenoxid in Kohlendioxid sterilisiert. Die Kartuschen können dann mit dem Blut oder Plasma eines Patienten perfundiert werden, welcher die bezeichnete virale Infektion aufweist, durch direkten venös-venösen oder venös-arteriellen Zugang, ähnlich den Hausdialyse-Kartuschen. Diese Technologie ist gut eingeführt (Pastan et al., 1998, N. Engl. J. Med. 338:1428-1437). In einer Ausführungsform kann das Virus durch Interleukin-2 oder ähnliches aktiviert werden, vor dem Filtrationsverfahren. Die Aktivierung des Virus setzt virale Komponenten in die Blutzirkulation des Patienten frei.
Beispiel 3
Diese Ausführungsform illustriert, dass Oligonukleotide, die gegen spezifische Bereiche des HIV-Virus gerichtet sind, für die Reduktion der viralen Last von HIV-1 in Plasma des Bluts verwendet werden können. Geeignete Bereiche zur Konstruktion von Oligonukleotid-Sonden können durch Vergleich bekannter Sequenzen der verschiedenen HIV-1-Stämme identifiziert werden. Die Fachleute, vertraut mit dem Stand der Technik, wissen, dass viele Software-Werkzeuge zum Vergleich von Sequenzen zur Identifizierung konservierter Bereiche verfügbar sind. Zum Beispiel wurde eine HIV-1-Sonde, wie in Sequenz ID Nr. 1 gezeigt, unter Verwendung einer kommerziell verfügbaren Software (BLAST) identifiziert und ist komplementär zu einer konservierten Sequenz im 5'-LTR-Bereich. Diese Sequenz wurde als in vielen verschiedenen HIV-1-Stämmen konserviert identifiziert.
In einer anderen Illustration dieser Ausführungsform wurde auch eine konservierte Sequenz aus dem 5'-NTR-Bereich für das HCV-Virus identifiziert. Eine Sonde, die komplementär zu dieser konservierten Sequenz ist, wird als Sequenz ID Nr. 2 offenbart.
Beispiel 4
Diese Ausführungsform zeigt, dass verschiedene Antikörper identifiziert werden können, die die Oberflächen-Antigene in Viren erkennen. Antikörper gegen die exponierten Bereiche von HIV und HCV können durch Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, erzeugt werden. Weiterhin können auch Antikörper gegen HIV-Proteine durch das NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (NIH AIDS Forschungs- und Referenzreagenzprogramm) erhalten werden. Zum Beispiel wird der monoklonale Antikörper 902 (Katalognummer 522) gegen gp120 als mit der immundominanten hypervariablen Schleife von gp120 von HIV-1-LAV- und HTLV-IIIB-Stämmen von HIV reagierend beschrieben. Ein monoklonaler Antikörper F 105 (Katalognummer 857) bindet an gp120 der Oberfläche von IIIB, SF2, MN, RF und CC-infizierten Zellen. Zwei andere monoklonale Antikörper (257-D und 268-D (Katalognummern 1510 und 1511)) binden an das HIV-1MN-V3-Epitop KRIHI bzw. HIGPGR. Von beiden Antikörpern wird berichtet, dass sie die HIV-1MN-Infektion von MT-2-Zellen neutralisieren. Ein monoklonaler Antikörper, ID6 (Katalognummer 2342), reagiert mit gp120 in IIB und RF-Assays. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper, die spezifisch für eine Vielzahl von Epitopen sind, an die Kartusche gebunden. In einer anderen Illustration dieser Ausführungsform können Antikörper gegen Oberflächenproteine von HCV verwendet werden. Die Verfahren zur Identifizierung oder Erzeugung von Antikörpern gegen Oberflächen-exponierte Epitope sind den Fachleuten im Stand der Technik gut bekannt. Einige Antikörper sind auch kommerziell erhältlich, wie bspw. Katalognummer MA5-692p von Harlan Bioproducts, Nr. 434-26 von Signet laboratories, Nr. 141925-11 von U.S. Biological, und Nr. 2235-11 von Innogenex.
Beispiel 5
Diese Ausführungsform zeigt, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung die virale Last in einer Flüssigkeit reduzieren kann, wenn sie durch die Hohlfaser, an welcher Affinitätsmoleküle immobilisiert werden, zirkuliert wird. In einer Illustration dieser Ausführungsform wurde eine Anti-HIV-DNA-Sepharose aus Avidin-Sepharose (Pierce Chemical Co.) hergestellt. Fünf ml Avidin-Sepharose wurden drei Mal mit Bindungspuffer gewaschen (20 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, pH 7,5). Die Oligonukleotid-Sonde nach Sequenz ID Nr. 1 wurde als Anti-HIV-DNA-Sonde verwendet. Die Sonde wurde mit Biotin markiert, und das Produkt wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Biotin-Markierungs-Kits (GIBCO/BRL), wie folgt, gereinigt. Eine Gesamtmenge von 2,7 mg Anti-HIV-DNA-Sonde nach Sequenz ID Nr. 1 wurde in 1 ml Wasser aufgelöst und es wurden 5 ml Avidin-Sepharose in 10 ml Bindungspuffer zugegeben. Die Reagenzien wurden bei 4° C über Nacht schwach geschüttelt und die Sepharose wurde drei Mal in einer Phosphatgepufferten (Koch)salzlösung gewaschen (PBS). Eine Gesamtmenge von 5 ml Sepharose wurde in 10 ml PBS suspendiert und bei 4° C aufbewahrt.
Die Anti-gp120-Sepharose wurde durch Kombination von Antikörpern gegen gp120 aus verschiedenen Quellen hergestellt: (NIH AIDS Reference Reagents #902 (30μg), #F105 (199μg), #489.1 (110μg), HIV 1 V3 (0,5 ml), 4,8D (200 μg), AD3 (1 ml), ID6 (1 ml), IgG1 b12 (100 μg) und INTRACEL corporation (Issaquah, WA) Kaninchen-anti-gp120 (Katalognummer #00401; 1 ml Serum). Das ImmunoPure Protein G Plus Orientation Kit (Katalognummer #44990zz) wurde von Pierce Chemical Company gekauft. Die verwendeten Antikörper wurden in Form von Seren der lyophilisierten Antikörper eingesetzt, welche mit Wasser wie gerichtet rekonstituiert wurden. Die Antikörper wurden alle gepoolt und 1:1 mit Bindungspuffer (50mM Natriumborat pH 8,2) verdünnt. 2 ml Protein G-Sepharose wurden drei Mal mit 5 ml Bindungspuffer gewaschen. Die Antikörper-Lösung wurde dann zur Protein G-Sepharose hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 30 Min. schwach geschüttelt. Die Sepharose wurde dann drei Mal mit 5 ml Bindungspuffer gewaschen.13 mg DSS (Disuccinumidylsubet(h)erat) wurde in 1 ml DMSO und 1,5 ml Vernetzungspuffer (0,15 M NaCl, 0,1 M Na2PO4, pH 7,2) aufgelöst. Die DSS-Lösung wurde zur Protein G-Sepharose, enthaltend die Anti-gp120-Antikörper, hinzugefügt und bei Raumtemperatur für eine Stunde schwach geschüttelt. Das Gel wurde mit 5ml Vernetzungspuffer gewaschen. Nach dem Waschen wurden 2 ml des Blockierungspuffers (0,1M Ethanolamin, pH 8,2) hinzugefügt und die Sepharose schwach bei Raumtemperatur für 10 Min. geschüttelt. Die Sepharose wurde zweimal mit 5 ml Elutionspuffer (primäres Amin enthaltender Puffer, pH 2,8), drei Mal mit 5 ml Bindungspuffer und drei Mal mit 5 ml PBS gewaschen. Die Sepharose wurde bei 4° C in 5 ml PBS aufbewahrt. Anti-HIV-Säulen können durch die Beladung der Anti-gp120-Sepharose oder der Anti-HIV-DNA-Sepharose oder beiden hergestellt werden.
Um die Verwendung der obengenannten Sepharose zur Entfernung von Virus oder Fragmenten oder Komponenten davon zu illustrieren, wurde eine Anti-HIV-Säule unter Verwendung einer Mikrokros-Filtrationsvorrichtung (0,5 μm Porengröße, Spectrum, Laguna Hills, CA) hergestellt. Keine Leckage von Sepharose wurde bei diesen Kartuschen beobachtet. Die Kartusche wurde mit Anti-gp120- und Anti-HIV-DNA-Sepharose beladen, hergestellt, wie zuvor beschrieben. Für dieses Experiment wurden gleiche Mengen von Anti-gp120- und Anti-HIV-DNA-Sepharose verwendet. Die Kontrollkartusche enthielt Albumin-Sepharose. Für jedes Experiment ließ man 4 ml des Mediums ungefähr 20 mal über einen Zeitraum von 30 Min. hin und zurück durch die Kartusche passieren, um eine adäquate Zeit für die viralen Partikel oder Fragmente und Komponenten davon in den Überständen bereitzustellen, um durch die Membranen durchzutreten um die Sepharosen zu binden. Das Effluens wurde auf die Anwesenheit von gp120 durch einen kommerziell verfügbaren ELISA-Kit (INTRACEL corp.) untersucht.
Um zu demonstrieren, dass die Anti-HIV-Säule effizient von viralen Proteinen befreit werden kann, wurde gp120 mit 4,0 ml des RPMI-Mediums, enthaltend 10%iges fötales Kälberserum, gemischt und durch die Säule geschickt. Das Effluens wurde auf gp120 untersucht. Wie in 4 gezeigt, reduzierte das Effluens durch die Anti-HIV-Säule die Menge von gp120, während die Kontrollsäule keinen Effekt hatte.
Um zu zeigen, dass die Anti-HIV-Säule HIV-Partikel zurückhält, wurde der Überstand aus der Zelllinie HL 2/3 verwendet. HL 2/3 ist eine Zelllinie, welche ein reverse Transkriptase defektives Virus und verschiedene virale Partikel und RNA erzeugt (1995, AIDS Res. Hum. Retroviruss 6(11):1281-1285). Die 5a und 5b zeigen die Ergebnisse der zwei verschiedenen Experimente. In beiden Experimenten wurde p24-Absorbanz gemessen, um die HIV-Partikel zu bestimmen. Wie in den 5a und 5b gezeigt, reduzierten die Anti-HIV-Säulen die HIV-Partikel in einem größeren Maß als die Kontroll-Säulen.
Aus dem Voranstehenden ist es für den Fachmann offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen in den voranbeschriebenen Methoden und Zusammensetzungen gemacht werden können, ohne dabei den Gegenstand der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Entsprechend kann die Erfindung in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne dadurch die charakteristischen Eigenschaften hiervon aufzugeben. Die vorliegenden Beispiele und Ausführungsformen sind daher in jeder Hinsicht als illustrativ und nicht als abschließend zu verstehen und alle Änderungen, welche innerhalb der Bedeutung und des Bereichs der Äquivalenz der Ansprüche liegen, sind daher beabsichtigt, hierin umfasst zu sein.
Seqüenzprotokoll

Claims

Vorrichtung zur Reduktion von Virionen und freien viralen Nukleinsäuren im Blut oder Plasma eines Individuums, das mit einem Virus infiziert ist, wobei die Vorrichtung eine Hohlfaser-Membran mit einer porösen Außenoberfläche umfasst, innerhalb welcher Affinitätsmoleküle immobilisiert sind, wobei die Affinitätsmoleküle solche Affinitätsmoleküle umfassen, die eine spezifische Affinität für ein virales Protein aufweisen, und solche Affinitätsmoleküle, die eine spezifische Affinität für eine virale Nukleinsäure aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Affinitätsmoleküle, die eine spezifische Affinität für ein virales Protein aufweisen, Antikörper gegen ein Epitop eines viralen Hüllproteins („coat Protein") sind, wobei das Epitop für die Bindung der Antikörper an das Virus zugänglich ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Affinitätsmoleküle, die eine spezifische Affinität für eine virale Nukleinsäure aufweisen, Polynukleotide sind, welche mit der viralen Nukleinsäure hybridisierbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Affinitätsmoleküle, die eine spezifische Affinität für ein virales Protein aufweisen, Antikörper gegen ein Epitop eines viralen Hüllproteins („coat Protein") sind, wobei das Epitop für die Bindung der Antikörper an das Virus zugänglich ist, und wobei die Affinitätsmoleküle, die eine spezifische Affinität für eine virale Nukleinsäure aufweisen, Polynukleotide sind, die mit der viralen Nukleinsäure hybridisierbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 4, wobei die Antikörper gegen die Schleife ("Loop") V3 des gp120 Proteins gerichtet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Polynukleotide die Sequenz SEQ ID NO: 1 umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Polynukleotide die Sequenz SEQ ID NO: 2 umfassen.
Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Virus HIV-1 ist.
Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Virus HCV ist.
Vorrichtung nach irgendeinem vorangegangenen Anspruch, wobei die Affinitätsmoleküle an eine feste Matrix innerhalb der porösen Außenoberfläche der Membran angehängt sind.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die feste Matrix Sepharose ist.
Verwendung einer Hohlfaser-Membran zur Herstellung einer Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 zur Reduktion der viralen Last im Blut oder Plasma eines Individuums, das mit dem Virus infiziert ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Vorrichtung für die Verwendung zur Reduktion der viralen Last im Blut des Individuums geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Vorrichtung für die Verwendung zur Reduktion der viralen Last im Plasma des Individuums geeignet ist.
Ex vivo-Verfahren zur Reduktion der viralen Last im Blut oder Plasma, das mit dem Virus infiziert ist, wobei das Verfahren die Passage des Bluts oder Plasmas durch eine Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 umfasst.