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Verfahren und Vorrichtung zur selektiven Veränderung der BlutflUssigkeit
des strömenden Blutes von lebenden Organismen Die Erfindung betrifft ein Verfahren
und eine Vorrichtung zur selektiven Veränderung der Zusammensetzung der Blutflüssigkeit
des strömenden Blutes von lebenden Organismen, d.h. das Verfahren und die Vorrichtung
gestatten die Durchführung der Immunadsorption in einem extrakorporalen Kreislauf
an einem lebenden Organismus.
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Die Entfernung, Gewinnung und Modifizierung von Substanzen der Blutflüssigkeit
von Menschen und Tieren hat ein weites Anwendungsgebiet, sei es zur Gewinnung menschlicher
oder tierischer Serumprodukte,wie Gerinnungsfaktoren, Antikörper, Albuminpräparationen,
Enzyme und dergleichen, die in der Therapie und Diagnostik sowie als Hilfssubstanzen
bei biologischen Präparationen und Reaktionen eingesetzt werden, sei es zur Entfernung
von Schadstoffen, die sich in der Blutflüssigkeit ansammeln und zu Funktionsstörungen
oder Krankheiten führen können. Derartige Maßnahmen werden bisher nach drei Verfahren
vorgenommen, der Dialyse, der Plasmapherese und der Austauschtransfusion.
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Bei der Dialyse werden kleinmolekulare Stoffe durch eine semipermeable
Membran, an der das Blut in einem extrakorporalen
Kreislauf vorbeigeleitet
wird, in eine umgeberde Flüssigkeit abgegeben. Diese Methode wird regelmäßig als
Ersatz für eine unzureichende Nierenfunktion angewandt.
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Die Methode hat folgende Nachteile: a) Sie arbeitet nicht selektiv,d.h.
alle Substanzen, die die Poren passieren können und für die ein Konzentrationsgefällezwischen
dem Blut und der umgebenden Flüssigkeit besteht, verlassen den Blutstrom. So hat
der Verlust von Wachstumshormonen bei dialysierten Kindern schwere Wachstumsstörungen
zur Folge.
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b) Der extrakorporale Kreislauf nimmt ein so großes Volumen in Anspruch,
daß Fremdblut eingesetzt werden muß, was neben einer Verteuerung des Verfahrens
zu einer erheblichen Infektionsgefährdung für den Patienten führt.
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Eine durch Fremdblut induzierte Immunisierung gegen Gewebsantigene
kann ferner ein erhebliches Hindernis für eine später vorzunehmende Organtransplantation
sein.
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c) Zusätzlich zu der künstlich durch gerinnungshemmende Mittel gesetzten
Gerinnungsstörung kommt es zu einem Verlust an Blutplättchen und damit zu einer
Blutungsgefährdung.
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Bei der Plasmapherese wird einem Probanden oder Patienten eine größere
Blutmenge entzogen, die Blutflüssigkeit wird von den festen Blutbestandteilen getrennt,
und die festen Bestandteile werden reinfundiert. Auch diese Methode hat erhebliche
Nachteile: a) Sie ist ebenfalls nicht selektiv, d.h. es wird die gesamte Blutflüssigkeit
entfernt. Für die Gewinnung der gewünschten Komponenten ist in der Regel eine weitere
Aufarbeitung erforderlich.
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b) Da einem Spendertier, das weiterleben soll, oder einem Menschen
keinesfalls mehr als 20 % des Blutvolumens entzogen werden können, ist die Ausbeute
relativ gering.
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c) Auch hier kommt es zum Verlust von funktionsfähigen Blutplättohen.
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d) Die Infusion oder Reinfusion eines größeren Volumens in den venösen
Schenkel des Blutkreislaufes bedeutet eine Mehrbelastung des Herzens, die nur von
gesunden Individuen er-bracht werden kann. Blutarmen Individuen ist ferner der Entzug
eines Teiles ihres Blutes, wenn auch nur vor-übergehend, nicht zuzumuten.
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Die Austauschtransfusion wird zur Entfernung von Giftstoffen bei
unzureichender Leberfunktion angewandt. Sie ist aufwendig, durch den hohen Blutbedarf
teuer und bringt die obengenannte Gefährdung durch Infektion und Immunisierung für
den Patienten mit sich, sie ist nicht selektiv und beim Erwachsenen wenig effektiv.
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In der modernen Biologie, Biochemie und Medizin läßt man zahlreiche
Verfahren in Systemen ablaufen, in denen einer der Reaktionspartner löslich, der
andere durch Kupplung an einen unlöslichen. Partner unlöslich ist. Das hat den Vorteil,
daß sich die Reaktionsprodukte sehr rasch und einfach von der Lösung, in der sich
die Reaktion abspielt, trennen lassen. Als Beispiele seien genannt die Peptidsynthese
aus einzelnen Aminosäuren, die Wirkung von Enzymen auf Substrate und die Immunadsorption,
bei der Antigene mit Insolubiliserten Antikörpern oder Antikörper mit insolubilisierten
Antigenen reagieren. Es war jedoch bisher nicht möglich, derartige Verfahren auf
den Kreislauf eines Lebewesens anzuwenden, da sofort bei Kontakt des Blutes mit
Fremdsubstanzen eine Gerinnung einsetzte, die eine weitere Durchströmung unmöglich
machte.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vorgenannten Nachteile
auszuschließen und ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, die es erlauben,
das Blut eines Lebewesens in einem extrakorporalen Kreislauf durch eine Reaktbnskammer
zu leiten, in der einzelne Serumbestandteile
selektiv entfernt,
gewonnen oder modifiziert werden können, ohne daß eine Gerinnung des zu behandelnden
Blutes einsetzt.
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Gelöst wird die Aufgabe erfindungsgemä dadurch, daß man das zu behandelnde
Blut aus dem Kreislauf deslebenden Organismus ableitet und durch einen extrakorporalen
Kreislauf einer Reaktionskammer leitet, in der die Reaktion zwischen einer an einen
unlöslichen Träger gekuppelten Substanz und ihrem in der Blutflüssigkeit befindlichen
Reaktionspartner stattfindet, und anschließend das so behandelte Blut dem Kreislauf
des Lebewesens wieder zuführt.
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Antikörper sind bekanntlich Eiweißstoffe, die von einem Wirbeltierorganimus
bei der Abwehr von Fremdstoffen (Antigenen) gebildet werden. Antikörper zeichnen
sich durch ihre Spezifität aus, das ist die Fähigkeit, ausschließlich mit dem Antigen,
das ihre Bildung ausgelöst hat, zu reagieren. Bei einem Aufeinandertreffen von Antigenen
und spezifisch gegen sie gerichteten Antikörpern gehen beide eine enge Verbindung
über nichtkovalente Wechselwirkungen ein.
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Bei der Immunadsorption wird einer der beiden1#eaktionspartner (A)
kovalent an einen unlöslichen Träger (T) gekuppelt. Kommt dieser Komplex T-A in
intensiven Kontakt mit einer Lösung, die den anderen Reaktionspartner (B) enthält,
so wird sich dieser selektiv an den Komplex T-A binden und es entsteht der Komplex
T-A-B. Ein Filtriervorgang erlaubt die Trennung des Komplexes T-A-B von der übrigen
Lösung.
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Mit diesem Vorgang läßt sich die Lösung selektiv von der Substanz
B befreien. Durch geeignete Verfahren, die nichtkovalente Bindungen unterbrechen,
läßt sich B von T-A wiederum ablösen und auf diese Weise als reine Substanz gewinnen.
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Bei der Immunadsorption ist es gleichgültig, ob Antigene oder Antikörper
bsolubilisiert werden. Sie läßt sich im Prinzip auch auf andere Systeme anwenden,
bei denen zwei Reaktionspartner über nichtkovalente Wechselwirkungen selektiv miteinander
in Beziehung treten, wie z.B. Enzym und Substrat.
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Die zur Durchftihrung des Verfahrens beanspruchte Vorrichtung besteht
im Prinzip aus einem Schlauchsystem zum Ableiten und wieder Zuleiten des Blutes
aus dem Kreislauf des Lebewesens,einer den Blutstrom im System aufrechterhaltenden
Schlauchpumpe und einer den insolubilisierten Reaktionspartner enthaltenden Kammer.
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Durch ein Schlauchsystem wird Blut aus dem Kreislauf eines Lebewesens
abgeleitet und an anderer Stelle wieder zugeleitet. Die Strömung in diesem extrakorporalen
Kreislauf wird aufrecht erhalten durch eine Schlauchpumpe. Das ableitende Schlauchsystem
mündet in eine Kammer, die den insolubiliserten Reaktionspartner enthält und in
der die Modifikation der Blutflüssigkeit stattfindet. Aus dieser Kammer wird das
durchströmende Blut über einen zuführenden Schlauch dem Gefäßsystem des Lebewesens
wieder zugeleitet.
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Bei Anwendung am Menschen wird am ableitenden Schlauch ein Strömungs-
und Druckmonitor angebracht, der die Pumpe bei Unterschreiten des normalen Venendrucks
abschaltet.
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Am zuführenden Schlauch ist eine Gasfalle angebracht.
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Zur Insolubilisierung des in der Reaktionskammer befindlichen Reaktionspartners
eignet sich jede Form von porösem Träger, der den gelösten Bestandteilen eine große
Oberfläche im Verhältnis zu einem kleinen Volumen bietet, der selbst keine unerwünschten
Nebeneffekte auf die Blutbestandteile ausübt und derreaktionsfähige Gruppen besitzt,
über welche die zu insolubilisierenden Substanzen kovalent gebunden werden können.
Eine Gerinnung und Blutplättchenadhäsion wird dadurch verhindert, daß alle mit dem
Blut in Kontakt tretenden Teile einschließlich der Schlauchsysteme, der Kammerteile,
des Trägers und des Reaktionspartners sehr dichtmit einer gerinnungshemmenden und
antithrombogen wirkenden Substanz, wie z.B. Heparin, über kovalente Bindungen dauerhaft
beschichtet werden. Für die Bindung von Heparin eignet sich die Verknüpfung einer
oder mehrerer Carboxylgruppen des Heparins mit Aminogruppen der obengenannten Teile
durch ein wasserlösliches Carbodiimid.
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Alle mit dem Blut in Kontakt tretenden Teile sind zu sterilisieren
oder steril und pyrogenfrei zu gewinnen und zu verarbeiten.
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Das Adsorbens besteht aus dem porösen Träger (aus Glas, Kunststoff
oder anderen Materialien). An den Träger wird mittels geeigneter chemischer Methoden
der Reaktionspartner kovalent gebunden. Anschließend erfolgt eine Kupplung von Heparin
an Träger und Reaktionspartner. An die innere Oberfläche des gesamten Schlauch-
und Kammersystems ist Heparin kovalent gebunden.
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Die Erfindung wird anhand einiger Beispiele erläutert.
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Von den zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten sollen folgende Beispiele
erwähnt werden: a) Immunperfusion b) Enzymoperfusion.
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Beispiele a) Immunperfusion: Gewinnung von Antikörpern gegen menschliches
Immunglobulin G (IgG) aus dem strömenden Blut eines aktiv immunisierten Schafes.
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1. Herstelluns des Immunadsorbens: 140 ml eines porösen Glasgranulats
mit einer Oberfläche von 128 m2 werden durch Behandlung mit Ultraschall und Salpetersäure
gereinigt und mit 5-(Triäthoxsilyl) propylamin silanisiert.
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In einer zweistufigen Reaktion werden 2,7 g menschliches IgG mittels
Pentandial (Glutardialdehyd) kovalent an die Glasoberfläche gebunden. Aldehydgruppen,
die nicht mit dem Protein reagiert haben, werden mit einem Überschuß an Tetramethylendiamin
blockiert.
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n g Heparin werden mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids über
die freien Aminogruppen des Tetramethylendiamins und des IgG an die Glasoberfläche
copoiymerisiert.
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2. Hämoperfusionsystem: Das Hämoperfusionssystem setzt sich zusammen
(vgl.
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Vorrichtung Abb. 2) aus einer zylinderförmigen Reaktionskammer 7
aus Polyamid, deren innerer Durchmesser 5,64crnbstra# und deren Netze 5,6 cm voneinander
entfernt sind, einem blutableitenden Schlauch 8 und einem blutzurückführenden Schlauch
9 aus Silikongummi. In den Schlauch 8 ist ein T-Stück 10 eingefügt, das eine Verbindung
zu dem Gefäß 11, gefüllt mit physiologischer Kochsalzlösung, herstellt, zwei Venenkathetern
12 und 13 aus Polyamid, einer peristaltisch wirkenden Schlauchpumpe 14 und zwei
Schlauchklemmen 15 und 16.
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Alle dem Hohlraum des Perfusionsystems einschließlich der Reaktionskammer
zugewandten Flächen werden antithrombogen ge-macht, indem Heparin mittels eines
Carbodiimids an oberflächen-gebundene Aminogruppen kovalent gekuppelt wird. Die
Aminogruppen werden folgendermaßen erzeugt: Auf die innere Oberfläche aller Teile,
die aus Polyamid gefertigt sind wirkt eine 3 n Salzsäurelösung 10 Stunden lang ein,
die anschließend für eine Stunde durch eine 30 %ige Tetramethylendiamin-Lösung ersetzt
wird.
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Abschließend werden die Flächen ausgiebig mit destilliertem Wasser
gewaschen.
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Auf die innere Oberfläche aller Teile, die aus Silikongummi gefertigt
sind, wirkt eine 10 %ige Lösung von
3-(Triäthoxysilyl)propylamin
in Aceton über 24 Stunden ein. Anschließend werden die Flächen ausgiebig mit destilliertem
Wasser gewaschen.
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3. Zusammensetzen des Immunperfusionssystems: Die Reaktionskammer
wird mit einer Stativklemme an einem Stativ so befestigt, daß die Kammerachse senkrecht
steht.
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Der obere Kainnierdeckelund das obere Netz sind zunächst noch entfernt,
der untere Kammerdeekel und das untere Netz mit den zugehörigen Dichtungsringen
sind mittels des unteren Teils der Haltevorrichtung wasser- und luftdicht an den
Mantel montiert.
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Am Anschlußstutzen des unteren Kammerdeckels wird der Silikonschlauch
8 befestigt, der durch eine Peristaltikpumpe 14 geführt ist und durch das T-Stück
10 mit dem Gefäß 11 verbunden ist. Das freie Schlauchende von 8 ist durch die Klemme
15 verschlossen. Das Schlauchsystem 8 ist vollständig, die Kammer 7 soweit mit physiologischer
Kochsalzlösung gefüllt, daß der Flüssigkeitsspiegel etwa 0,5 cm oberhalb des unteren
Netzes steht.
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Das Immunadsorbens wird in ca. 160 ml physiologischer Kochsalzlösung
suspendiert und in drei Teilmengen in die Kammer eingegossen. Durch Ubertragung
einer hochfrequenten Vibration auf die Kammer wird eine gleichmäßige und dichte
Packung der sedimentierenden Immunadsorbens-Partikel erreicht. Wenn die gesamte
Immunadsorbensmenge in die Kammer gepackt worden ist, wird das obere Netz mit Dichtungsringen
und der obere Kammerdeckel montiert und wasser-und luftdicht mit dem Mantel verbunden.
Der Silikonschlauch 9 wird am Ansatzstutzen des oberen Kammerdeckels befestigt.
Unter fortgesetzter Vibration der Kammer durch Einschalten der Pumpe 14 bei geschlossener
Klemme 12 und geöffneter Klemme 16 wird physiologische Kochsalzlösung in die
Kammer
und in den Schlauch 9 gepumpt. Nach vollständigem Auffüllen mit Kochsalzlösung ist
das Perfuslonssystem gebrauchsfertig.
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Das Zusammensetzen des Perfusionssystems geschieht unter Einhaltung
keimfreier Bedingungen in einer Sterii-Werkbank.
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4. Immuncerfusion Ein Schaf, das drei Monate vor Perfusionsbeginn
durch wiederholte Impfungen mit den menschlichen Serumproteinen Immunglobulin G
(IgG) und der 3. Komplementkomponente (C)) immunisiert worden ist, erhält eine intravenöse
Injektion von 20 mg Promethazin und 5.000 E Heparin. In die rechte Vena jugularis
und in die linke Vena jugularis werden je ein Katheter eingeführt, die mit den freien
Enden der Schläuche 8 und 9 verbunden werden. Mit Einschalten der Schlauchpumpe
14 wird die Schlauchklemme 15 geöffnet und gleichzeitig die Schlauchklemme 16 verschlossen.
Mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 50 ml pro Minute wird Blut aus der rechten
Vena jugularis durch die Reaktionskammer und zurück in die linke Vena jugularis
geleitet. Während der Perfusion wird die rechte Vena jugularis durch Anlegen eines
Kompressionsverbandes proximal von der Punktionsstelle gestaut.
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Nach einer Perfusionsdauer von 2,5 Stunden wird die Klemme 15 geschlossen
und gleichzeitig die Klemme 16 geöffnet. Durch diese Maßnahme wird das im Perfusionssystem
befindliche Blut durch die aus dem Gefäß 11 nachströmende physiologische Kochsalziösung
ersetzt und in die linke Vena jugularis zririlckgeriihrt. Sobald das System frei
von Blut ist, werden beide Katheter 12, 13 aus den Venen entfernt.
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5. Elution des spezifisch gebundenen Antikörpereiweiß## (Regeneration
des Perfusionssystems): ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Um das System zunächst
>eA von unspezifisch gebundenem Schafsserum-Proteinen zu befreien, werden die
Schläuche und die Reaktionskammer mit einem Liter physiologischer Kochsalzlösung
und anschließend mit einer 4 M Naal-Lösung, die 0,02 M A'#thylendiamintetraessigsäure
enthält, gespült. Zur Kontrolle des Eiweißgehaltes der Spülflüssigkeit wird das
freie Ende des Schlauches 9 mit der Meßküvette eines Durchflußphotometers verbunden
und die Absorptionsrate von Licht der Wellenlänge 280 nm durch die Spülflüssigkeit
gemessen. Wenn die Absorptionsrate auf Werte unter 0,01 abgesunken ist, wird das
Schlauchsystem und die Reaktionskammer mit 350 ml einer 1 n Propionsäure-Lösung
gespült. Unter dem Einfluß der Propionsäure löst sibh der spezifische Schafsantikörper
vom menschlichen IgG des Immunadsorbens und kann mit der Propionsäurelösung aus
dem System gespült und so in reiner Form gewonnen werden.
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Abschließend wird das System mit physiologischer Kochsalzlösung solange
gewaschen bis alle Propionsäurereste entfernt sind. Das Immunperfusionssystem ist
damit regeneriert und steht für eine Wiederverwendung zur Verfügung.
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6. Analyse des Perfusionsergebnisses: Die immunpräzipitierenden Eigenschaften
des Blutserums des Schafes vor und nach der Immunperfusion werden mit Hilfe der
quantitativen radialen Immundiffusionsmethode miteinander verglichen: a) vor der
Immunperfusion präzipitierten 1 ml Schafsserum 5.16 mg menschliches IgG und 1.21
mg menschliches C3.
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b) nach der Immunperfusion präzipitierte 1 ml Schafsserum 0,25 mg
menschliches IgG und 1,19 ing menschliches 03.
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c) Im Propionsäure-Eluat sind 2.580 mg spezifischer Schafsantikörper
gegen menschliches IgG enthalten.
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Ant#körper gegen menschliches C3 sind im Eluat nicht nachweisbar.
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Damit sind durch die 2,5 stündige Immun-perfusion über 95 % des Antikörpers
gegen menschliches IgG aus dem strömenden Blut des Schafes selektiv entfernt worden.
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b) Enzymoperfusion: Glucuronierung von "indirektem" zu "direktem"
Bilirubin.
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Anordnung wie im Beispiel a. Statt menschlichem IgG ist das Enzym
UDP-Glucuronyltransferase auf den Träger gekuppelt. In einem Nebenschluß wird durch
eine weitere Pumpe UDP-Glucuronat in einem zweifachen molaren Verhältnis zum durchströmenden
Bilirubin dem in der Reaktionskammer strömenden Blut beigemischt. Es kommt in der
Kammer zu einer fllucuronierung des Bilirubins, das damit von der Niere des Lebewesens
ausgeschieden werden kann.
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Durch Hintereinanderschaltung zweier Reaktionskammern ist in diesem
Fall gleichzeitig die selektive Entfernung von antierythrozytären Antikörpern aus
dem Kreislauf eines Kindes möglich, das an einem Morbus hämolyticus neonatorum leidet.
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Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt gegenüber herkömmlichen Verfahren
eine Reihe wesentlicher Vorteile: 1. Es können selektiv ein, zwei oder mehr Blutbestandteile
gleichzeitig entfernt oder modifiziert werden.
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2. Das Verfahren eignet sich für großmolekulare ebenso wie für kleinmolekulare
Substanzen.
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3. Die Ausbeute ist wesentlich höher als etwa bei der Plasmapherese,
nämlich je nach Wahl desdespnrfundierten Blutvolumens
nahe 100
%.
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4. Das gesamte System ist nach Regeneration wiederverwendbar. Das
führt bei dem ohnehin preisgünstigen Verfahren zu einer weiteren Senkung der Kosten.
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5. Bei der Gewinnung von Serumbestandteilen ist außer der Elution
von dem insolubilisierten Reaktionspartner kein zusätzliches Reinigungs- oder Isolierungsverfahren
notwendig.
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6. Ein Verlust von Erythrozyten, Lymphozyten und Thrombozyten tritt
nicht ein oder ist sehr gering.
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7. Das Volumen des extrakorporalen Kreislaufes ist so klein, daß ein
Blutersatz durch Fremdblut nicht erforderlich ist.
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8. Da das Kreislaufvolumen des Probanden nicht verändert wird, und
der extrakorporale Kreislauf in das venöse Kreislaufsystem eingeschaltet ist, tritt
eine zusätzliche Herzbelastung nicht auf. Das Verfahren kann daher bei Herzkranken
und Geschwächten durchgeführt werden.