DE69721223T2

DE69721223T2 - Membranaffinitätssystem und verfahren zu dessen verwendung

Info

Publication number: DE69721223T2
Application number: DE69721223T
Authority: DE
Inventors: J. Norma OFSTHUN; J. Paul SOLTYS; Kunas A. GRETCHEN
Original assignee: Baxter International Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-16
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2017-06-17
Also published as: IN191816B; ATE238095T1; US5868936A; TW389705B; US5871649A; AU729964B2; CN1196688A; EP0868208A1; KR19990043992A; EP0868208B1; MY132474A; MX9801391A; ID18738A; WO1997048483A1; CA2227550A1; BR9702301A; AR007409A1; AU3490497A; CO4910172A1; DE69721223D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren, die zum Reinigen von Blut bestimmt sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Affinitätsmembranvorrichtungen, die dazu ausgebildet sind, bestimmte gelöste Substanzen aus Blut zu entfernen.
Affinitätstrennverfahren basieren auf der hochspezifischen Bindung zwischen einem in Lösung befindlichen Molekül und einem immobilisierten Liganden, um ein hohes Maß an Ausreinigung zu erzielen. Herkömmlich werden Trennvorgänge an Affinitätssäulen durchgeführt, die mit porösen Kügelchen gepackt sind, in denen der Ligand immobilisiert ist. Ein solcher Ligand liegt tief in den Poren der porösen Kügelchen. Die Affinitätstrennprozesse laufen ab, indem die Proteinlösung durch das die porösen Kügelchen enthaltende gepackte Bett gepumpt wird.
Diese Säulenanordnungen, die derzeit für die Adsorptionsaufbereitung von Plasma verwendet werden, basieren auf Vorrichtungen und einem Adsorptionsmaß, die in vielen Fällen für andere Arten von Trennprozessen wie etwa die industrielle Trennung ausgebildet worden sind. Natürlich können die Zielvorstellungen, die zur Entwicklung eines industriellen Trennprozesses führen, von denjenigen vollkommen verschieden sein, die sich mit einem therapeutischen Prozeß befassen. Dieser Unterschied kann in einer angepaßten Technologie resultieren, die zwar wirkungsvoll, aber keineswegs optimal ist. Siehe Keßler, "Adsorptive Plasma Treatment: Optimization of Extracorporeal Devices and Systems", Blood Purification Vol. 11, S. 150–157 (1993) (nachstehend: Kessler, "Adsorptive Plasma Treatment").
Für die Ausbildung und Optimierung von extrakorporalen Vorrichtungen zur Plasmaaufbereitung sind viele verschiedene Zielvorstellungen postuliert worden.
Eines der wichtigsten Ziele ist die Minimierung der Menge an teurem Liganden, gewöhnlich einem Antikörper, der zum Einfangen des Zielmoleküls eingesetzt wird. Durch Minimierung der Ligandenmenge können die Kosten pro Behandlung erheblich gesenkt werden. Ein weiteres Ziel besteht in der Minimierung des Systemvolumens, wodurch wiederum der Einfluß des Prozesses auf den Patienten minimiert wird. Diese Volumenminimierung kann sowohl Akutreaktionen und chronische Wirkungen als auch Proteinverluste verringern. Siehe Keßler, "Adsorptive Plasma Treatment", S. 150 (1993). Aus der Sicht der Vermarktung sind weitere vorteilhafte Charakteristiken einer Affinitätsvorrichtung, daß sie auf einfache Weise von der Labor- auf die Produktionsebene übertragen und hergestellt werden kann und zum Betrieb nur wenig zusätzliche Hardware benötigt.
Wie oben gesagt wird, bestehen derzeitige therapeutische Vorrichtungen, die zum Entfernen von Zielmolekülen verwendet werden, aus mit porösen Kügelchen gepackten Säulen. Bei diesen Vorrichtungen gibt es eine Reihe von Nachteilen. Beispielsweise ist die Einfangrate in diesen Vorrichtungen durch die langsame Intrapartikeldiffusion insbesondere im Fall von großen gelösten Zielstoffenund durch hohe Druckabfälle bei höheren Durchflußraten eingeschränkt. Siehe Suen & Etrel, "A Mathematical Analysis of Affinity Membrane Bioseparations", Chemical Engineering Science, Vol. 47, Nr. 6, S. 1355–1364 (1992) (nachstehend: Suen & Etzel, "Mathematical Analysis"). Eine solche, diffusionsbeschränkte Adsorption führt zu einer ineffizienten Nutrung von teurem Liganden, da erhebliche Ligandenmengen für die gelösten Zielstoffe unzugänglich sein können.
Abgesehen von den mit der diffusionsbeschränkten Adsorption zusammenhängenden Problemen gibt es noch weitere Nachteile. Zur Begrenzung von Größe und Kosten der Trennvorrichtungen werden gewöhnlich zwei Säulen verwendet, wobei die eine Säule für die Adsorption genutzt wird, während aus der anderen gelöste Zielstoffe eluiert werden. Die Verwendung von zwei Säulen erhöht nicht nur die Kosten des Verfahrens, sondern auch die Behandlungsdauer, die erforderlich ist, um die Trennung und das Entferen von gelöstem Stoff durchzuführen. Ferner resultieren die langsamen DurchfluBraten, die angewandt werden, um einen übermäßigen Druckabfall über das Bett in diesen Säulen zu vermeiden, in verlängerten Beschickungszeiten.
Außerdem macht die Bioinkompatibilität des Substratmaterials in solchen Säulen die Trennung von Plasma von den übrigen Zellkomponenten des Blutes vor dem Einleiten des Plasmas in die gepackte Säule erforderlich. Das Blut wird zuerst durch ein als Plasmapherese bekanntes Verfahren in Zellkomponenten und Plasmakomponenten aufgetrennt. Die Plasmapherese kann entweder durch Filtration oder Zentrifugation erfolgen. Die Membranplasmapherese verwendet Membranen mit Porengrößen, die größer als die Größe der Plasmaproteine, aber kleiner als die Zellkomponenten des Blutes sind, was die Abtrennung des Plasmas ermöglicht. Die Zentrifugation trennt die Komponenten auf der Basis ihrer Dichte entweder in einem Chargen- oder einem kontinuierlichen Verfahren. Als nächstes wird das ßlutplasma durch eine gepackte Säule gefördert, um gelöste Zielsubstanzen wie etwa Toxine zu entfernen. Das aufbereitete Plasma wird mit den Zellkomponenten vereinigt und zum Patienten rückgeführt. Dieses Vielschrittverfahren ist zeitaufwendig und arbeitet mit großen extrakorporalen Volumen. Das Verfahren verlangt außerdem viele Geräte und eine erhebliche Manipulation von Blutprodukten, was zu einem erhöhten Infektionspotential führt.
In den letzten Jahren sind Hohlfasermembranen als attraktive Alternative zu porösen Kügelchen als Affinitätssubstrat vorgeschlagen worden. Die in den Durchflußkanälen der Faserwand vorhandene große Oberfläche beseitigt die Einschränkungen hinsichtlich der Diffusion, die sich durch die Adsorption in Verbindung mit porösen Kügelchen ergeben. Die Verlagerung des Ratenbegrenzungsschritts auf die Adsorptionskinetik zwischen gelöstem Zielstoff und Membran-gebundenem Liganden erlaubt die Anwendung größerer Durchflußraten und die potentiell wirkungsvollere Nutrung des Liganden, da der gesamte Ligand verfügbar ist, um gelöste Zielsubstanz zu binden.
Es wurde versucht, Vorrichtungen vom Affinitätstyp zu formulieren, um das Entfernen von gelösten Zielstoffen aus Blut zu vereinfachen. Beispielsweise betrifft die US-PS 5 211 850 von Shettigar et al ein Hohlfasersystem, bei dem Sorptionskügelchen in einer speziell konstruierten U-förmigen Einrichtung vorgesehen sind. In der Einrichtung werden gelöste Plasmasubstanzen bevorzugt durch die poröse Hohlfasermembran in eine Plasmakammer filtriert, in der unerwünschte Komponenten durch adsorptive Bindungstechniken entfernt werden. Plasma und ungebundene gelöste Stoffe treten dann wieder in die Hohlfaser ein und werden zum Patienten rückgeführt.
Die US-PS 5 258 149 von Parham et al betrifft das Entfernen von LD-Lipoprotein-Cholesterin-Komplex aus Vollblut. Die bei Parham et al angegebene Vorrichtung richtet sich auf die Verwendung einer mikroporösen Plasmapheresemembran, in der ein immobilisiertes Affinitätsmittel mit der Membran integral ist. Eine Blutpumpe wird verwendet, um das Vollblut in die Affinitätsmembran zu fördern. Eine weitere Pumpe, und zwar eine Plasmapumpe, wird dann verwendet, um Plasma durch die Kanäle der mikroporösen Fasern anzusaugen und es von den Zellkomponenten des Blutes zu trennen.
WO-A-90/05018 beschreibt eine Vorrichtung, die eine Membran in Verbindung mit einem Liganden verwendet, um ein Ligat von einem Fluid, das das Ligat enthält, zu trennen.
ZUSAMMENFASSUHG DER ERIDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden eine Affinitätsmembranvorrichtung nach dem Anspruch 1 und ein Verfahren zum selektiven Entfernen von in Plasma vorhandenen Zielmolekülen nach dem Anspruch 15 angegeben.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, daß die in einer Affinitätsmembranvorrichtung verwendeten Fasern besonders ausgebildet sein müssen, damit die Vorrichtung unter den funktionellen Einschränkungen einer extrakorporalen Vorrichtung adäquat arbeitet. Eine Vielzahl von zusammenwirkenden Fasercharakteristiken wie der innere Radius, die Länge, Porengröße und Wandstärke müssen in Betracht gezogen werden, wenn eine solche Affinitätsmembranvorrichtung konstruiert wird. Ebenso müssen sorgfältig gesteuerte Betriebsbedingungen in ßezug auf Blutdurchfluß und Fluidschergeschwindigkeit in dem extrakorporalen Blutkreislauf angewandt werden, um zu große Volumenänderungen im Patienten oder eine zu starke Schädigung von Zellkomponenten in dem Blut zu verhindern.
Die Erfinder gehen davon aus, daß vor der vorliegenden Erfindung niemand untersucht und festgelegt hat, wie man eine Affinitätsmembranvorrichtung erfolgreich ausbildet, die für therapeutische Anwendungen geeignet ist. Hohlfasermembranen werden zwar in Trennvertahren verwendet, und Flachfolien-Affinitätsmembranen stehen zur Verfügung, aber viele therapeutische Anwendungsgebiete stellen strenge Funktionsanforderungen an ein Hohlfaser-Affinitätssystem, die in bisherigen Arbeiten nicht angesprochen wurden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Affinitätsmembranvorrichtung angegeben, die verwendet werden kann, um eine Reihe von Krankheitszuständen zu behandeln, die durch zu hohe Spiegel einer bestimmten gelösten Substanz im Blut charakterisiert sind.
Die Affinitätsmembranvorrichtung der vorliegenden Endung kann für das selektive Entfernen von in Blutplasma enthaltenen Zielmolekülen verwendet werden. Die vereinfachte, jedoch wirkungsvolle Affinitätsmembranvorrichtung der vorliegenden Erfindung hat ein langgestrecktes Gehäuse, das eine Einlaßöffnung und eine Auslaßöffnung zum Eintritt und Austritt von Blut in sie bzw. aus ihr hat. Außerdem weist die Membranvorrichtung Hohlfasern auf, die im Inneren des Gehäuses umschlossen sind. Die Hohlfasern haben Poren mit geeigneter Porengröße zum Auftrennen von Blut in Plasma und seine Zellkomponenten. Die Poren haben ferner einen Liganden, der an einer inneren Oberfläche der Poren immobilisiert ist; der Ligand hat eine Affinität für die Zielmoleküle in dem Plasma und bindet bei einer Ausführungsform die in dem Plasma vorhandenen Zielmoleküle, die in die Poren der Hohlfasern transportiert werden. Bei einer anderen Ausführungsform kann der Ligand ein Enzym sein, das das Zielmolekül modifizieren und freisetren kann. Es ist zu beachten, daß die Zellkomponenten des Bluts nicht in die Poren der Hohlfasern eintreten; dagegen wird das Plasma durch positive und Umkehrfiltration in die Poren transportiert, wobei keine äußere Pumpe zum Erzeugen eines Plasmastroms über die Hohlfasern vorhanden ist.
Bei einer Ausführungsform liegt die Porengröße im Bereich von ungefähr 0,2 bis 0,6 μm.
Bei einer Ausführungsform haben die Hohlfasern Wandstärken mit einer adäquaten Oberfläche für die Anhaftung der Liganden, um die hinreichende Bindung des Zielmoleküls zuzulassen. Dazu liegt die Wandstärke der Hohlfasern im Bereich von ungefähr 300 bis 3500 μm.
Die Hohlfasern haben Innendurchmesser von ungefähr 70 bis 140 μm.
Die vorliegende Erfindung sieht außerdem ein Verfahren zum selektiven Entfernen von in Blutplasma vorhandenen Zielmolekülen vor. Das Verfahren umfaßt zuerst das Vorsehen einer Affinitätsmembranvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung. Dann wird Blut in vitro in die Einlaßöffnung des Gehäuses gepumpt. Das Blutplasma wird dann in die Poren der Hohlfasern mittels positiver und Umkehrfiltration transportiert, während gleichzeitig nicht zugelassen wird, daß die Zellkomponenten in die Hohlfaserwand eintreten. Die Zielmoleküle in dem Plasma werden veranlaßt, für einen klinisch signifikanten Zeitraum in enge Nähe mit den Liganden zu gelangen, um die Bindung oder Modifikation der Zielmoleküle zu ermöglichen. SchlieBlich werden bei einer Ausführungsform die Nicht-Zielmoleküle des Plasmas durch positive und Umkehrfiltration durch die Poren der Hohlfasern transportiert, um sich erneut mit den Zellkomponenten des Blutes zu vereinigen, und verlassen die Vorrichtung durch die Auslaßöffnung. Bei einer anderen Ausführungsform werden die Nicht-Zielmoleküle des Plasmas mit den Zellkomponenten durch eine ^{Plasmaleitung
mit Hilfe eines bestehenden Druckgradienten vereinigt.}
Außerdem wird durch die vorliegende Erfindung eine Hohlfasereinrichtung mit bestimmten Dimensionen und Transporteigenschaften angegeben. Die Hohlfasereinrichtung enthält eine Vielzahl von langgestreckten Hohlfasern. Jede Hohlfaser hat eine ein Lumen umgebende Umfangswand. Die Umfangswand hat eine Vielzahl von sie durchsetrenden Poren. Die Anzahl und die dimensionsmäßigen Konfigurationen der Poren sind wirksam, um Plut in Plasma und Zellkomponenten aufzutrennen. Die Poren haben einen an ihre innere Oberfläche gebundenen Liganden. Die Umfangswand hat eine solche Wandstärke (eine ausreichende Porenlängendimension), daß für die Anhaftung des Liganden eine adäquate Oberfläche verfügbar ist, um sicherzustellen, daß der Ligand eine adäquate Menge des Zielmoleküls einfängt.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Notwendigkeit für einen gesonderten Plasmaphereseschritt aufgrund der sorgfältigen Wahl der Hohlfasermembran entfällt. Wie bereits erwähnt, war bei früheren Ausführungsformen den Kontakt mit Plasma anstatt Vollblut erforderlich, und infolgedessen war gleichzeitig mit der Verwendung der Trennmembran eine Plasmapherese notwendig.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Kontaktoberflächen der Membranvorrichtung besser biokompatibel als Affinitätssäulen sind, die bisher auf dem Gebiet verwendet wurden. Eine verbesserte Biokompatibilität resultiert in einer geringeren Komplementaktivierung während der Behandlung.
Außerdem besteht ein Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, daß eine der angewandten chemischen Immobilisierungs-Techniken eine größere Ligandennutrung gegenüber früheren Versuchen zeigt, wenn der gelöste Zielstoff viel größer als der immobilisierte Ligand ist.
Außerdem besteht ein Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, daß sich erhebliche Kosteneinsparungen gegenüber verfügbaren Affinitätssäulen einstellen. Kosteneinsparungen ergeben sich durch einfache Herstellung, eine Verminderung der notwendigen Liganden und die Einfachheit der Instrumente im Gebrauch.
Noch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung Ist, daß sie erheblich einfacher als eine vergleichbare Affinitätssäule zu gebrauchen ist. Die Erfindung benötigt weniger unterstütrende Geräte und weniger Aufsicht durch professionelles medizinisches Personal.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß sie verbesserte Massentransporteigenschaften hat, die in kürzerer Behandlungsdauer, erhöhter Nutrung des teuren Liganden oder einer Kombination beider Faktoren resultieren.
Ferner besteht ein Vorteil der vorliegenden Endung darin, daß eine Membranvorrichtung angegeben wird, die vereinfacht und doch gegenüber im Stand der Technik vorgeschlagenen Membranvorrichtungen wirkungsvoller ist. Dabei ist es ein spezielles Merkmal, daß die Membranvorrichtung der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer äußeren Pumpe zum Erzeugen eines Plasmastroms über die Hohlfasern der Vorrichtung nicht benötigt. Außerdem wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein langgestrecktes Gehäuse verwendet, um die Hohlfasern zu umschließen und die positive und Umkehrfiltration innerhalb der Vorrichtung zu fördern. Im Gegensatr zu bekannten Vorrichtungen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckt, daß eine U-förmige Konstruktion nicht erforderlich ist, um eine positive und Umkehrfiltration zu fördern.
Zusätzliche Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der genauen Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen sowie aus den Zeichnungen.
KURZBESCHRBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Draufsicht auf eine Ausführungsform der Affinitätsmembranvorrichtung der vorliegenden Erfindung;
2 ist eine Draufsicht auf eine andere Ausführungsform der Affinitätsmembranvorrichtung der vorliegenden Erfindung;
3 ist eine vergrößerte schematische Darstellung einer einzelnen Hohlfaser, wobei der Plasmadurchfluß durch die Faserwand mittels positiver und Umkehrfiltration gezeigt ist, der in dem Innenhohlraum der Affinitätsvorrichtung stattfindet;
4 ist eine vergrößerte schematische Darstellung einer Einzelfaserwand einer Hohlfaser, wobei der Plasmadurchfluß durch die Poren in der Faserwand und die Bindung von Zielmolekülen an immobilisierte Liganden gezeigt ist;
5 zeigt allgemein das Biotin-Avidin-Immobilisierungsmodell der vorliegenden Erfindung.
GENAUE BESCHREIBUNG DER DERZEIT BEVORZUGTEN AlSFIHRÜNGSFORMEN
Die vorliegende Endung stellt eine Afflnitätmembranvorrichtung bereit, die so ausgebildet ist, daß sie bestimmte schädliche gelöste Substanzen (gelöste Zielsubstanzen) aus Blut entfernt. Die Affinitätsmembranvorrichtung ist zum Gebrauch in einem extrakorporalen Blutkreislauf ausgebildet und kann gleichzeitig mit anderen therapeutischen Prozessen für die Reinigung von Blut wie etwa die Hämodialyse angewandt werden. Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung besteht aus Hohlfasermembranen mit bestimmten Dimensionen und Transporteigenschaften, Liganden, die an der Porenoberfläche der Membranen immobilisiert sind, und einem Gehäuse zum Umschließen der Hohlfasern und zum Zulassen eines geeigneten Ein- und Austritts von Blut und Filtrat. Bei einer bevorzugten Ausführungsform haftet der Ligand an der Membran mittels einer bestimmten Immobilisierungschemie, um eine optimale Funktion zu erzielen.
Im Gebrauch bindet oder modifiziert der immobilisierte Ligand eine bestimmte gelöste Zielsubstanz, wodurch ein Entfernen dieser gelösten Substanz aus dem Blut bewirkt wird, das durch das Lumen der Hohlfasern fließt. Die Positionierung der Liganden sowie die spezielle Immobilisierungschemie, die bei der Erfindung angewandt werden, resultieren in einer Affinitätsmembranvorrichtung mit verbesserter Beibehaltung der Ligandenwirksamkeit, Systemflexibilität, Standardisierung der Membranfertigung und einem Potential für einen insgesamt erhöhten Wirkungsgrad. Insbesondere kann die Affinitätsmembranvorrichtung der vorliegenden Erfindung eingesetrt werden, um eine Reihe von medizinischen Zuständen zu behandeln, die durch zu hohe Spiegel einer bestimmten gelösten Substanz im Blut charakterisiert sind.
1 zeigt eine Ausführungsform der Affinitätsmembranvorrichtung der vorliegenden Erfindung. Die Affinitätsmembranvorrichtung kann für das selektive Entfernen von verschiedenen gelösten Zielsubstanzen aus Blut verwendet werden. Beispielsweise könnte die Vorrichtung verwendet werden, um LD-Lipoprotein (LDL), Beta-2-Mikroglobulin, Immunglobuline, Autoantikörper und dergleichen zu entfernen.
Die Membranvorrichtung 10 hat ein langgestrecktes Gehäuse 12, das einen inneren Hohlraum 13 definiert. Die EinlaBöffnung 14 ist mit einer Einlaßleitung 18 verbunden und erlaubt den Eintritt von Blut in die Affinitätmembranvorrichtung 10. Nachdem die Affinitätsmembranvorrichtung 10 auf das Blut eingewirkt hat, tritt das behandelte Blut aus der Vorrichtung durch eine AuslaBöffnung 16 aus, die mit einer AuslaBleitung 20 verbunden ist.
Die Membranvorrichtung 10 weist außerdem eine Vielzahl von Hohlfasermembranen 22 auf, die tatsächlich ein Bündel von Membranen sind, die einen Hohlfasermembranfilter bilden und in dem inneren Hohlraum 13 des langgestreckten Gehäuses 12 umschlossen sind. Wie noch im einzelnen erläutert wird, haben die Hohlfasermembranen 22 geeignete Porengrößen, um das Blut, das durch die Membranen 22 fließt, in Plasma und seine Zellkomponenten aufzutrennen. Das Plasma trennt sich von den Zellkomponenten des Bluts und fließt, wie grafisch dargestellt ist, durch die Poren in den Wänden der Hohlfasermembranen 22 hinaus.
Infolge des Transmembrandrucks im Inneren der Membranvorrichtung 10 fließt das Plasma schließlich durch die Poren in den Wänden der Hohlfasermembranen 22 zurück und vereinigt sich erneut mit den Zellkomponenten des Bluts. Dabei ist infolge des axialen Druckabfalls innerhalb der Fasern der Transmembrandruck entlang der Länge der Vorrichtung 10 veränderlich. Nach der Einlaßöffnung 14 ist der Transmembrandruck positiv, so daß das Plasma veranlaßt wird, aus dem Lumen zu dem Mantelraum des langgestreckten Gehäuses 12 zu fließen. Nach der AuslaBöffnung 16 ist der Transmembrandruck negativ, wodurch das Plasma veranlagt wird, dann aus dem Mantelraum zurück zu dem Lumen zu fließen.
Eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die auch den wirksamen Transport des Plasmas durch die Poren ermöglicht, ist in 2 gezeigt. 2, in der die mit 1 gleichen Merkmale mit den gleichen Ziffern bezeichnet sind, zeigt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer Plasmaauslaßöffnung 23. Anders als bei der in 1 gezeigten Ausführungsform tritt bei dieser Vorrichtung das Plasma durch die Auslaßöffnung 23 aus. Ähnlich wie bei der Ausführungsform von 1 erzeugt jedoch der axiale Druckgradient innerhalb der Affinitätsmembranvorrichtung den Filtratstrom (Plasmastrom) über die Hohlfasern. Infolge der Konstruktion der Vorrichtung 10 ist der Transmembrandruck in der gesamten Vorrichtung positiv. Die Auslaßöffnung 23 ist mit der Auslaßleitung 20 über eine Plasmaleitung 25 verbunden, so daß die Nicht-Zielmoleküle des Plasmas mit den Zellkomponenten des Bluts aufgrund eines vorhandenen Druckgradienten wieder vereinigt werden können.
Die 3 und 4 zeigen insbesondere das Prinzip der Plasmaabtrennung und des Entfernens von gelöster Substanz entsprechend der Anwendung bei der vorliegenden Erfindung. 3 zeigt eine einzige Hohlfaser 24 der Affinitätsvorrichtung. Sie zeigt insbesondere die Abtrennung von Plasma von den Zellkomponenten des Bluts in der Affinitätsmembranvorrichtung der vorliegenden Erfindung.
Die Hohlfaser 24, die nur eine des hier gezeigten Bündels ist, hat ein zentrales Lumen 28. Vollblut, das von einem Patienten entfernt wurde, fließt aus der Einlaßöffnung der Vorrichtung durch dieses Lumen 28 zur Auslaßöffnung der Vorrichtung. Die Wand 26 der Faser 24 hat eine Serie von Öffnungen oder Poren 30, durch die Plasma, Toxine, Arzneistoffe oder andere gelöste Substanzen, deren Durchmesser kleiner als die Poren 30 sind, in die Wand 26 der Faser 24 gelangen können. Andere Zellkomponenten wie etwa Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten haben eine solche Größe, daß sie die Poren 30 nicht passieren, und verbleiben in dem Lumen 28 der Faser 24.
Die Plasmakomponenten fließen in die und aus der Hohlfaser 24 durch positive und Umkehrfiltration. Zu Beginn, während das zu behandelnde Blut in die Membranvorrichtung transportiert wird, bewirkt der Druck des Bluts im Inneren der Hohlfaser 24, daß Plasma aus dem Lumen 28 durch Konvektion zu der Wand des inneren Hohlraums oder, mit anderen Worten, in Richtung zu dem Mantel des langgestreckten Gehäuses geleitet wird. Dann ist nahe der Auslaßöffnung der Vorrichtung der Druck im Inneren der Hohlfasermembran 24 niedriger als der Plasmadruck an der Außenseite der Faser (der Druck an der Wand des inneren Hohlraums). Infolgedessen fließt das Plasma dann zurück in das Lumen 28.
Das Plasma, das durch die Wand 26 der Faser 24 zurückfließt, ist mit den Liganden behandelt oder modifiziert worden, die an der Oberfläche der Poren 30 der Faser 24 immobilisiert sind. Daher wird das behandelte Plasma sicher mit den Zellkomponenten in dem Lumen wieder vereinigt und tritt durch die Auslaßöffnung aus. Man läßt das Blut eines Patienten durch die Vorrichtung rezirkulieren, bis die Konzentration der gelösten Zielsubstanz ausreichend verringert ist.
Liganden, die an die Oberfläche von Poren 30 gebunden sind, wirken auf das Plasma zum Entfernen von gelösten Zielsubstanzen aus dem Plasma oder bei einer anderen Ausführungsform zur Modifikation von solchen gelösten Zielsubstanzen. Die Art und Weise, wie der Ligand an der Porenoberfläche der Affinitätsmembran immobilisiert ist, ist von der Art des Liganden (z. ß. Antikörper, Antigen) sowie von dem verwendeten Membranmaterial abhängig. Ein selektives Immobilisierungsmodeil sollte so angewandt werden, daß die größte Menge an gelöster Zielsubstanz von der Membran mit einer kleinsten Ligandenmenge eingefangen werden kann. Wie für den Fachmann auf dem Gebiet ersichtlich ist, sind einige allgemeine Gesichtspunkte, die zu beachten sind, die Anwendung von sanften Reaktionsbedingungen für die Immobilisierung, die Bindungsstabilität bei den physiologischen und Elutionsbedingungen sowie die ortsgerichteten chemischen Methoden, um die Integrität einer aktiven Stelle aufrechtruerhalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung könnten viele verschiedene Immobilisierungstechniken angewandt werden, um die Liganden an die Oberfläche der Poren in den Hohlfasermembranen zu koppeln. Außer den in der vorliegenden Erfindung im einzelnen angegebenen verbesserten Immobilisierungsmethoden könnten Immobilisierungsmethoden für aktivierte Membranen zum Gebrauch in der Affinitätsvorrichtung der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Beispielsweise sind einige aktivierte Membranen für die direkte Immobilisierung von Proteinliganden im Handel erhältlich. Es ist jedoch zu beachten, daß alle diese Membranen nur in Flachfolienform verfügbar sind. Beispiele umfassen die folgenden: Immobilon^TM (zu erhalten von AV Millipore Corporation, Bedford, MA); Immunodyne^TM (zu erhalten von Pall Biosupport Corporation, Glen Cove, NY); und UItraBind^TM (zu erhalten von Gelman Sciences, Ann Arbor, MI).
Wie nachstehend mehr im einzelnen erläutert wird, gibt die vorliegende Erfindung verbesserte Immobilisierungstechniken an, die gegenüber bekannten Vorgehensweisen deutliche Vorteile aufweisen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Avidin/Biotin-Komplex zur Immobilisierung des Liganden an der Porenoberfläche angewandt. Alternativ kann eine Polyethylenglykol-Immobilisierungstechnik entweder eigenständig oder in Verbindung mit einem Avidin/Biotin-Komplex angewandt werden.
Anders als andere Vorrichtungen, die in einer Plasmakammer befindliches Sorptionsmittel verwenden, verwendet die vorliegende Erfindung ganz speziell Liganden, die direkt an der Oberfläche der Poren 30 immobilisiert sind, um gelöste Zielsubstanzen aus dem Plasma zu entfernen. Der in einem Kreis liegende Bereich in 3 zeigt allgemein, wo die Liganden an der Oberfläche der Poren 30 immobilisiert sind. Diese Vorgehensweise beseitigt nicht nur die Notwendigkeit für ein in der äußeren Plasmakammer angeordnetes Sorptionsmaterial, sondern erhöht auch den Wirkungsgrad des Vorgangs des Entfernens der gelösten Substanz und verkürzt außerdem die Behandlungsdauer. Wenn Liganden an den Poren vorhanden sind, durch die das Plasma und Plasmakomponenten direkt transportiert werden, besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, daß Liganden mit den gelösten Zielsubstanzen in Wechselwirkung treten, was in einer erhöhten Nutrung der teuren Liganden resultiert.
Das Prinzip des Entfernens von gelösten Substanzen, das bei der vorliegenden Erfindung angewandt wird, ist in 4 gezeigt. 4 ist eine vergrößerte Darstellung einer einzelnen Pore 32 in der Faserwand 34 einer Hohlfasermembran. Wenn das Plasma durch die Wand 34 der Fasermembran geht, gelangen bestimmte Zielmoleküle 36 in Kontakt mit dem Liganden 38, der an der Oberfläche der Pore 32 immobilisiert ist. Der Ligand 38 bindet die gelöste Substanz 36 wirkungsvoll, so daß die gelöste Zielsubstanz 36 aus dem Plasma entfernt wird. Man läßt das Plasma über einen klinisch signifikanten Zeitraum durch die Faserwand 34 passieren, um im wesentlichen die gesamte gelöste Zielsubstanz 36 aus dem Plasma zu entfernen.
Die Hohlfasermembran der vorliegenden Erfindung ist vorteilhaft aus mit Blut kompatiblem Material hergestellt, was in einer geringeren Komplementaktivierung während der Behandlung resultiert. Geeignete Fasermaterialien sind Cellzulosetriacetat, Polysulfon, Polyacrylnitril, Ethylen-Vinylalkohol-Copolymer, Polymethylmethacrylat, Polyamid, Polypropylen, Celluloseacetat, Regeneratcellulose, Polycarbonat, Polyethylen, Polyvinylalkohol, Polyvinylchlorid und dergleichen. Die Hohlfasern müssen eine geeignete Porengröße haben, um den Durchtritt von Plasmakomponenten einschließlich der gelösten Zielsubstanzen durch die Wandungen der Hohlfasern zuzulassen. Gleichzeitig muß diese Porengröße auch imstande sein, den Eintritt von Blutrellen und Plättchen in die Poren der Wandungen zu verhindern. Geeignete Porengrößen (Durchmesser) in den Hohlfasern können zwischen ungefähr 0,2 und 0,6 μm liegen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Affinitätsmembranvorrichtung angegeben, die Hohlfasermembranen enthält, die bestimmte Dimensionen und Transporteigenschaften haben. Wie oben gesagt wird, müssen die verschiedensten Faktoren bei der Konstruktion einer Hohlfaservorrichtung berücksichtigt werden, die zum Gebrauch in therapeutischen Anwendungen geeignet ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, daß die in einer Affinitätsmembranvorrichtung verwendeten Fasern speziell ausgebildet sein müssen, damit die Vorrichtung unter den Funktionsbeschränkungen einer extrakorporalen Vorrichtung adäquat funktioniert. Die in Wechselwirkung tretenden Fasereigenschaften, die den inneren Radius, die Länge, Porengröße und Wandstärke umfassen, müssen untersucht werden, um geeignete Hohlfasermembranen festzulegen.
Die Erfinder haben die geeigneten Dimensionen für eine Hohlfasermembranvorrichtung auf der Basis eines Computermodells bestimmt. Es wurde ein Computermodell entwickelt, um das Betriebsverhalten der Affinitätsmembranvorrichtung zu beschreiben. Dabei löste das Computermodell bestimmte Erhaltungsgleichungen in Differenzenschemaform für radiale und Längssegmente von Blut in den Hohlfasermembranen. Im Unterschied zu anderen vorgeschlagenen Systemen haben die Erfinder ermittelt, wie die verschiedenen in Wechselwirkung tretenden Charakteristiken von Hohlfasern formuliert sein müssen, um eine geeignete Hohlfasermembranvorrichtung herstellen zu können.
Die Dimensionen einer Hohlfaser-Affinitätsmembranvorrichtung sind weitgehend durch die Menge an gelöster Zielsubstanz bestimmt, die vom Patienten entfernt werden muß. Die Entwicklung einer Vorrichtung, die diesen Kriterien genügt, führt zu einer Membran mit Dimensionen (Länge, innerer Radius, Faserwandstärke), die ganz speziell für die Therapie mit Affinitätsmembranvorrichtungen geeignet ist. Membranen, die für die Therapie auf Affinitätsbasis verwendet werden, bewirken zwar auch die Trennung von Plasma von Zeltkomponenten des Blutes, aber ihre Hauptfunktion ist die Teilnahme am Entfernen von Zielsubstanzen durch Bereitstellen eines Substrats mit maximaler Oberfläche, an die Liganden gebunden sein können. Diese Funktion bestimmt weitgehend die optimalen Dimensionen solcher Membranen und unterscheidet ihre Ausbildung von derjenigen von Membranen, die ausschließlich für Trennzwecke ausgebildet sind.
Typischerweise werden Membranen verwendet, um die Trennung von Zielsubstanzen aus einer Lösung auf der Basis ihrer Molekülgröße zu erreichen. Zur Beseitigung des Widerstands gegen einen Massentransfer, der durch die Membran bewirkt ist, sind diese Membranen im allgemeinen so ausgebildet, daß sie möglichst dünn sind (bis zu 8 μm für Dialysemembranen und bis zu einigen hundert Mikrometer für Ultrafiltrationsmembranen).
Dagegen sind dickere Membranwände für Membranen in Affinitätsvorrichtungen vorteilhaft, weil die Membran selber das Substrat für die Ankopplung von Liganden bildet, die gelöste Zielsubstanzen binden. Da die Membranfläche, die für die Ankopplung von Liganden zur Verfügung steht, eine Funktion des inneren Radius der Faser, ihrer Dicke und Länge ist, ist es wichtig, eine ausreichende Oberfläche für die Immobilisierung von Liganden in der Vorrichtung dadurch bereitrustellen, daß die Wandstärke der Membran größer gemacht wird. Eine solche Vergrößerung der Wandstärke erlaubt die maximale Bindung oder Modifikation der gelösten Zielsubstanz und minimiert gleichzeitig das Volumen der Blutkammer der Vorrichtung. Ausgedrückt als die Assoziationskinetik zwischen der gelösten Zielsubstanz und dem Liganden für jede gegebene Filtratdurchflußrate (durch die Pfeile in 3 angedeutet), ergeben dicke Membranen maximale Verweildauern für die gelöste Zielsubstanz in den Poren oder der "schwammartigen Matrix" der Membran. Infolgedessen wird dadurch die Wahrscheinlichkeit erhöht, daß die Zielsubstanz mit immobilisiertem Liganden in Kontakt gelangt und davon eingefangen wird.
Die Dimensionen einer Hohlfaser-Affinitätsmembranvorrichtung werden auch durch den Filtratfluß bestimmt, der erforderlich ist, um therapeutische Veränderungen der Plasmakonzentration zu bewirken. Der spezifische Filtratfluß, der für eine gegebene Therapie notwendig ist, ist durch das Verteilungsvolumen und die Plasmakonzentration der gelösten Zielsubstanz sowie die Behandlungsdauer für die Therapie bestimmt. Die Beziehung für den FIuB von gelöster Substanz durch eine Membran, wobei der Filtratfluß durch die Konzentrationspolarisation von Erythrozyten an der Membranoberfläche bestimmt ist, ist bereits beschrieben worden. Siehe Zydney et al, "A concentration polarization model for the filtrate flux in cross-flow microfiltration of particulate suspensions", Chemical Engineering Communication Vol. 47, S. 1–21 (1986) (nachstehend: Zydney et al, "Concentration Polarization Model"). Der FIuB ist abhängig von der Scherungsrate des Blutes durch die Vorrichtung, der Länge der Vorrichtung und dem Polarisationsgrad der Zellen.
Eine Hohlfaser-Affinitätsmembranvorrichtung, die so ausgelegt ist, daß sie eine ausreichende Zielsubstanzkapazität und adäquaten Filtratfluß zur klinischen Wirksamkeit bietet, muß gleichzeitig einer Reihe von Systembegrenzungen genügen, die auf physikalischen Überlegungen beruhen.
In einer Hohlfasermembranvorrichtung darf die Scherungsrate für das fließende Fluid nicht so hoch sein, daß Komponenten des fließgenden Fluids, insbesondere Erythrozyten, die für Scherungseffekte empfindlich sind, geschädigt werden. Da die Scherungsrate in einer Hohlfaservorrichtung durch die Blutdurchflußrate, den Innenradius der Faser und die Zahl der Fasern bestimmt ist, können diese Parameter durch die Beschränkung der Systemscherungsrate begrenzt sein.
Blut, das durch das Lumen in einer Hohlfasermembranvorrichtung fließt, erfährt eine Druckabnahme entlang der Lumenachse. In der Praxis ist die Größe dieses axialen Druckabfalls durch Material- und Geräteüberlegungen beschränkt. Diese Beschränkung kann annehmbare Werte für den Faserinnenradius, die Faserlänge und die Zahl der Fasern begrenzen.
Außerdem wird der durch Konvektion bestimmte Transport gegenüber dem durch Diffusion bestimmten Transport in einer Hohlfasermembranvorrichtung bevorzugt. Der konvektive Transport vereinfacht das gleichmäßige Fördern vo gelöster Zielsubstanz durch die gesamte schwammige Matrix der Membran auf solche Weise, daß die Wechselwirkung zwischen nichtbesetzten Bindungsstellen und gelöster Zielsubstanz optimiert wird. Insbesondere resultiert eine Konstruktion von Affinitätsmembranen, bei denen der Transport durch Konvektion bestimmt ist, in einer wirkungsvolleren Vorrichtung (d. h. die Therapie kann in der kürzest möglichen Zeit durchgeführt werden). Der relative Beitrag von Konvektion und Diffusion kann durch die Pecletsche Zahl des Systems ausgedrückt werden, bei der Werte über 40 bedeuten, daß der Transport durch Konvektion vorherrscht. Siehe Suen & Etzel, "Mathematical Analysis".
Außerdem können bei einer Hohlfaser-Affinitätsmembranvorrichtung Überlegungen in ßezug auf die Herstellung die physische Größe der Vorrichtung begrenzen und können später Beschränkungen bestimmter Parameter zur Folge haben. Beispielsweise kann es Einschränkungen von Parametern wie Faserwanddicke, Faserinnenradius, Faserlänge und Faserzahl geben.
Bei einer Hohlfaser-Membranvorrichtung, die für die exrakorporale Therapie verwendet wird, ist aus Gründen der Sicherheit des Patienten das extrakorporale Gesamtblutvolumen strikt begrenzt. Infolgedessen können die Faserwandstärke, der Faserinnenradius, die Faserlänge und die Faserzahl durch diese Einschränkung begrenzt sein.
Zusätrlich zu der Konstruktion einer optimalen Fasermembran muß die Bindungschemie sorgfältig gewählt und optimiert werden (wie anderswo beschrieben wird), um die höchstmögliche Bindungskapazität zu erzielen. Das führt zu der effektivsten Nutrung der Membran und der Liganden.
Wenn die Vorrichtung gemäß 1 konfiguriert ist, muß eine ausreichende Länge der Fasern zusätzlich zu derjenigen, die für ein adäquates Einfangen von gelöster Zielsubstanz in der Vorwärtsrichtung (Plasma vom Lumen zur Mantelseite) erforderlich ist, vorgesehen sein, so daß das Plasma zu dem Lumen der Fasern zurückkehren und aus der Vorrichtung austreten kann. Die Faserlänge, die hinzugefügt werden muß, ist von der Permeabilität und Dicke des verwendeten Membranpolymers abhängig.
Es ist für ein bestimmtes Set von Therapieanforderungen möglich, daß die Konstruktionsparameter einer einzigen Vorrichtung, die im Einmaldurchlaufmodus arbeitet, den Therapieanforderungen aufgrund der oben angedeuteten Systemeinschränkungen nicht genügt. In diesen Fällen kann ein Verfahren zum Regenerieren der Membranvorrichtung durch periodisches Eluieren der gelösten Zielsubstanz während der Therapie der Vorrichtung ermöglichen, den Therapieanforderungen innerhalb der Systembeschränkungen zu genügen. Um eine Unterbrechung der Therapie während der Regenerierung zu vermeiden, können zwei Vorrichtungen während der Behandlung verwendet werden, so daß die eine gelöste Substanzen binden oder modifizieren kann, während die andere der Regenerierung unterzogen wird.
Als nicht-einschränkendes Beispiel haben die Erfinder geeignete Hohlfaserdimensionen für verschiedene gelöste Zielsubstanzen unter Anwendung der nachstehenden Gleichungen errechnet, die die oben beschriebenen Anforderungen und Einschränkungen darstellen.
BEISPIEL GEEIGNETER DIMENSIONEN
Die Menge der zu entfernenden gelösten Zielsubstanz ist durch die therapeutische Anforderung bestimmt:
zu entfernende Menge = V(C0 – Cf)
wobei V = Verteilungsvolumen der gelösten Zielsubstanz,
C₀ = Anfangskonzentration der gelösten Zielsubstanz,
C_f = Endkonzentration der gelösten Zielsubstanz.
Die Gesamtkapazität der Affinitätsmembranvorrichtung ist gleich der spezifischen Kapazität (C_p) multipliziert mit dem Membranvolumen:
Gesamtkapazität•[(r + d)2 – r2]ΠLNCP
wobei: r = Hohlfaserradius
d = Dicke der Hohlfaserwand
L = Hohlfaserlänge
N = Zahl der Hohlfasern
Die erste Forderung für Affinitätsmembranvorrichtungs-Dimensionen ist, daß die Gesamtkapazität der Affinitätsmembranvorrichtung größer als die zu entfernend^e Menge ist:
[(r + d)2 – r2]ΠLNCp > V(C0 – Cf) (1)
Die volumetrische Durchflußrate (Q_f), die erforderlich ist, um die Endkonzentration der Zielsubstanz innerhalb einer Behandlungsdauer (t) zu erreichen, wird aus einer Massenbilanz an der gelösten Zielsubstanz errechnet.
Wenn man eine vollständige Adsorption von gelöster Substanz in einem einzigen Durchgang (d. h. eine perfekt konstruierte Membran) annimmt, ist diese Forderung gegeben durch:
Angenommen, daß der Durchfluß durch die Membran durch die Konzentrationspolarisation begrenzt ist, kann die gewünschte Filtratdurchflußrate aus der folgenden Beziehung vorhergesagt werden (siehe Zydney et al, "Concentration Polarization Model"):
und: Q_b = EinlaBbIutdurchflußrate
H = EinlaBblut-Hämatokrit
(Einheiten von ß sind mit L und r, ausgedrückt in cm, konsistent.)
Die spezifische Kapazität (C_P) für eine gegebene gelöste Zielsubstanz wird durch geeignete Wahl des Liganden, der die Zielsubstanz bindet, das Membranmate^rial und die zur Kopplung des Liganden an die Membran verwendete Chemie maximiert.
Die übrigen Konstruktionsparameter, die in den Gleichungen (1) bis (3) erscheinen, sind die Vorrichtungsdimensionen r, d und L und die Faserzahl (N). Wie bereits erörtert, unterliegen diese Konstruktionsparameter einer Reihe ^von Einschränkungen.
Eine Einschränkung in bezug auf r ist die maximal zulässige Wandscherungsrate, die gegeben ist durch:
Eine weitere Einschränkung in bezug auf r ist der maximal zulässige axiale Druckabfall
wobei μ_b = Viskosität des Blutes.
L ist durch die vorstehend erwähnte Begrenzung des Druckabfalls sowie die folgende praktische Beschränkung der physischen Gesamtgröße der Vorrichtung eingeschränkt:
NΠ(r·d)2 < 78,5 cm2 (5)
Die Dicke (d) ist durch die obige Einschränkung sowie durch die durch die Pecletsche Zahl gegebene Einschränkung und die durch den Transmembrandruck gegebene Einschränkung eingeschränkt:
Dabei ist D das Diffusionsvermögen der gelösten Zielsubstanz, und die Filtratgeschwindigkeit v ist gegeben durch:
Der Abfall des Transmembrandrucks kann unter Anwendung der Blade-Kozeny-Gleichung für Füllkörperbetten bestimmt werden. ( Siehe Bird, Stewart, Lightfoot, "Transport Phenomena" (1960)). Diese Gleichung wird wie folgt geschrieben:
wobei: μ_f = die Filtratviskosität
D_P = der Porendurchmesser der Membran = 0,25 μm
ε = Membranporosität = 0,7
Unter Anwendung der vorstehenden Gleichungen für die Anforderungen und Einschränkungen der Konstruktion legten die Erfinder fest, daß die Hohlfasern einer Affinitätsmembranvorrichtung Wandstärken von ungefähr 300 bis 3500 μm und Innendurchmesser von ungefähr 70 bis 140 μm haben sollten.
Zusätzlich zu der Festlegung des optimalen Konstruktionsverfahrens für ^die Ausbildung von geeigneten Hohlfasermembranen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung auch ein verbessertes Verfahren zur Kopplung von Liganden an die Oberfläche von Poren in einer Affinitätsmembranvorrichtung festgelegt. Das verbesserte Verfahren resultiert in einem erhöhten Wirkungsgrad der Vorrichtung, einer verstärkten Nutrung der Liganden, einer Standardisierung der Membran, einer Vereinfachung, Flexibilität bei der Vermarktung sowie Flexibilität der Vorrichtung. Standardisierung der Membran bezieht sich auf die Fähigkeit der Standardisierung des Immobilisierungsvorgangs zum Gebrauch mit vielen verschiedenen verfügbaren Liganden.
Wie oben gesagt wird, hat die frühere Entwicklung von Vorrichtungen zum Entfernen von gelösten Substanzen entweder in Form von Membranen oder Säulen mit Kügelchen die Aufmerksamkeit auf das Entfernen einer einzigen gelösten Zielsubstanz gerichtet. Mit diesem Fokus haben die Entwickler im allgemeinen ihre Entfernungsvorrichtung für ein bestimmtes interessierendes Ligand-Zielsubstanz-Paar optimiert und Fragen der Anwendbarkeit mit anderen Ligand-Zielsubstanz-Paaren außer acht gelassen. Die Immobilisierungschemie zur Kopplung von Liganden an eine Trägermatrix war sehr spezifisch und nicht ohne weiteres auf den Gebrauch mit anderen Liganden übertragbar.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bei einer Ausführungsform ein Immobilisierungsverfahren angewandt, das Avidin und Biotin aufweist. Eine spezifische Immobilisierungschemie wird angewandt, um Avidin an die Membranoberfläche zu koppeln. Dieses Verfahren kann zum Gebrauch mit einer großen Zahl von verfügbaren Liganden standardisiert werden. Die Systemflexibilität bleibt bei der Kopplungschemie dadurch erhalten, daß Biotinmoleküle an den Liganden gekoppelt werden.
Die besondere Avidin/Biotin-Immobilisierungschemie der vorliegenden Erfindung läuft wie folgt ab. Ein oder mehr Biotinmoleküle werden kovalent an einen Liganden gekoppelt. Avidin wird kovalent an die Membranporenoberfläche gekoppelt. Die jeweilige Kopplung von Avidin und Biotin kann unter Anwendung von bekannten Techniken erfolgen. Dann wird der biotinylierte Ligand zur Reaktion mit einer immobilisiertes Avidin enthaltenden Membran gebracht, was in der Immobilisierung des biotinylierten Liganden an dir Membran resultiert.
5 zeigt schematisch den Einsatz eines Avidin/Biotin-Komplexes zur Immobilisierung eines Liganden und zum Einfangen von gelöster Zielsubstanz. Biotinylierter Ligand 40 wird an das Avidin 42 gebunden, das an der Porenoberfläche 44 der Membran immobilisiert ist. Wie hier gezeigt wird, ist der biotinylierte Ligand 40 dann frei, um ein Zielmolekül 46 aus einer Plasmalösung einzufangen.
Dabei zeigt der resultierende Avidin-Biotin-Komplex eine signifikante Stabilität. Die Wechselwirkung zwischen Avidin und Biotin ist die stärkste bekannte nichtkovalente biologische Wechselwirkung (K_a = 10¹⁵M^–1) zwischen Protein und Ligand. Ferner geht die Ausbildung der Bindung zwischen Biotin und Avidin sehr rasch vonstatten und bleibt, nachdem sie gebildet ist, unbeeinflußt durch große Extremwerte von pH, Temperatur, organischen Lösungsmitteln und anderen Denaturierungsmitteln. Beispielsweise kann der Biotin-Avidin-Komplex Temperaturen bis zu 80°C und einem pH zwischen 2 und 13 standhalten.
Was die Kopplung von Biotin an einen Liganden betrifft, so erlauben viele Biotinderivate, die handelsüblich sind, die kovalente Kopplung von Biotin an einen Liganden durch eine Reihe von funktionellen Gruppen. Beispielsweise kann Biotin an spezifische Stellen innerhalb eines Proteinliganden gekoppelt werden, was die folgenden einschließt: bestimmte Aminosäurereste, die ein endständiges Amin (Lysin), eine Imidazolgruppe (Histidin), eine Phenolgruppe (Tyrosin) oder eine Sulfhydrylgruppe (Cystein) enthalten. Außerdem sind Biotinderivate zur Kopplung an Kohlenhydratgruppen verfügbar, die entweder in Zuckern oder Säugerproteinen anwesend sind. Eine solche Chemie ist wirksam, um Biotin beispielsweise an Immunglobulin G (IgG) an einer Stelle zu koppeln, die die Antigenbindung nicht stört. Diese chemische Flexibilität ermöglicht eine Reihe von potentiellen Verfahren zur Kopplung von Biotin an einen Liganden und erhöht die Chancen, daß für interessierende Liganden ein geeignetes Verfahren verfügbar ist.
Die Ankopplung von Avidin aufgrund seiner Molekülstruktur an eine Membranoberfläche gewährleistet die wirkungsvolle Nutrung des Liganden. Avidin ist ein tetrameres Protein, und jedes Molekül kann an bis zu vier Moleküle von Biotin mit gleicher Affinität binden. Diese Vielfach-Funktionalität, die in jedem Avidinmolekül vorhanden ist, gewährleistet, daß immobilisiertes Avidin eine Fähigkeit zum Binden von Biotin beibehält. Im allgemeinen resultiert die unspezifische Immobilisierung von Proteinen an Feststoffmatrizen in der Inaktivierung eines Anteils des Proteins an der Oberfläche, und zwar entweder durch Reaktion mit der aktiven Stelle des Proteins oder durch sterische Abschirmung der aktiven Stelle gegenüber in Lösung befindlichen Zielmolekülen. Bei gegebener Symmetrie des Avidinmoleküls inaktiviert die Immobilisierung an einer festen Oberfläche eine oder mehrere potentielle Biotinbindungsstellen; es ist jedoch auch garantiert, daß eine oder mehrere ßindungsstellen aktiv und frei bleiben, um Biotin oder einen biotinylierten Liganden zu binden.
Der letzte Schritt zur Bildung einer aktiven Affinitätsmembran ist die Bildung des Avidln-Biotin-Komplexes. Bevorzugt erfolgt diese Bildung durch Umsetzen einer immobilisiertes Avidin enthaltenden Membran mit einer Lösung, die biotinylierten Liganden enthält. Diese Reaktion läuft sehr rasch ab und kann unter milden Bedingungen wie etwa in Dialysatpuffer bei Raumtemperatur erfolgen. Da dieser Reaktionsschritt einfach und unkompliziert ist, ist das Spezielle dabei, daß die Erfinder davon ausgehen, daß ein Endbenutzer eine Avidinmembran mit dem biotinylierten Liganden seiner Wahl aktivieren könnte.
Die Möglichkeit, Endbenutrern die Aktivierung der Membranen einer Affinitätsvorichtung zu gestatten, bietet erhebliche Vorteile gegenüber bekannten Vorrichtungen. Abgesehen von der Einfachheit des Verfahrens ermöglicht dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung eine erhöhte Flexibilität der Vorrichtung und eine Standardisierung der Membran, was wiederum in Flexibilität bei der Vermarktung resultiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung könnten dem Endbenutzer eine einzelne Avidinmembran und verschiedene Lösungen geliefert werden, die verschiedene biotinylierte Liganden enthalten. Dann kann der Benutzer in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Zustand die Avidinmembran mit dem geeigneten Liganden aktivieren und überschüssigen Liganden mit physiologischer Kochsalzlösung oder Dialysat auswaschen.
Zusätzlich zu seiner Rolle in der Chemie der Immobilisierung wirkt Avidin auch als ein hydrophiler Spacer zwischen der Membranoberfläche und dem immobilisierten Liganden. Der Einsatz eines molekularen Spacers zur physischen Trennung der festen Matrixoberfläche von der aktiven Stelle des Liganden ist in der Immobilisierungschemie bekannt. Dabei sind molekulare Spacer relativ kurze aliphatische Ketten (mit einer Länge von 4 bis 10 Kohlenstoffatomen), die ausreichen können, um Oberflächen-Wechselwirkungen oder Wechselwirkungen mit kleinen Liganden oder gelösten Zielsubstanzen zu erleichtern. Diese kurzen Ketten sind aber relativ unwirksam, wenn bei der Wechselwirkung ein oder mehr Makromoleküle betroffen sind. Andererseits wird durch den Einsatr von längeren aliphatischen Ketten das Hydrophobierungsvermögen der Membranoberfläche nachteilig verändert. Die Anwendung von Avidin bei der vorliegenden Erfindung führt also nicht nur zu einem verbesserten Immobilisierungsverfahren, sondern es hat auch eine Doppelrolle als Spacer-Molekül, das nicht die Nachteile von bekannten Spacern aufweist.
In den meisten Fällen dient Avidin als ein geeignetes Spacer-Molekül, aber ein potentieller Nachteil der Verwendung von Avidin ist die durch Avidin gegebene Einschränkung der Dichte, wenn sowohl Ligand als auch Zielsubstanz relativ klein sind. In diesen Fällen kann eine gesättigte Einzelschicht von Avidin der Begrenzungsfaktor in ßezug auf die spezifische Kapazität der Membran zum Binden von gelösten Stoffen sein. In den meisten Fällen sind jedoch entweder der Ligand, sein Zielmolekül oder beide ausreichend groß, so daß die Sättigungsgrenze von Avidin nicht der Begrenzungsfaktor der Membrankapazität ist.
Bei der vorliegenden Erfindung geben die Erfinder ein zweites verbessertes Verfahren zum Ankoppeln von Liganden an die Oberfläche von Poren in einer Affinitätsmembranvorrichtung an. Das verbesserte Verfahren resultiert in einem erhöhten Wirkungsgrad der Vorrichtung, einer stärkeren Nutrung der Liganden und einer gesteigerten Kapazität der Vorrichtung.
Wie oben gesagt wird, erleichtert die Verwendung eines Molekülspacers die molekularen Wechselwirkungen zwischen immobilisierten Liganden und gelösten Zielsubstanzen. Relativ kurze aliphatische Ketten (mit einer Länge von 4 bis 10 Kohlenstoffatomen) sind für Wechselwirkungen, bei denen ein oder mehr Makromoleküle betroffen sind, unwirksam, aber längere aliphatische Keten ändern auf nachteilige Weise das Hydrophobierungsvermögen der Membranoberfläche.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bei einer Ausführungsform ein Immobilisierungsverfahren angewandt, das Polyethylenglykol (PEG, auch als Polyethylenoxid bekannt) umfaßt. Polyethylenglykol einer geeigneten Kettenlänge, im allgemeinen zwischen 50 und 250 Kohlenstoffatome, wird unter Anwendung einer bestimmten Immobilisierungschemie an der Membranoberfläche kovalent immobilisiert. Nach der Blockierung von verbleibenden aktiven Stellen wird der interessierende Ligand anschließend unter Anwendung einer geeigneten Chemie kovalent an das Polyethylenglykol gekoppelt. Die besonderen Vorteile von Polyethylenglykol als Molekülspacer umfassen seine hydrophile Beschaffenheit und seine biologische Inaktivität, die beide bei einer Vorrichtung, die mit Blut oder Plasma in Kontakt gelangt, sehr vorteilhaft sind.
Als Beispiel und ohne einschränkende Wirkung wird nun ein einfaches Immobilisierungsverfahren eines heterofunktionellen PEG beschrieben. Das heterofunktionelle PEG kann von einem gewerblichen Vertrieb bezogen werden und hat am einen Ende einen Amino-Endpunkt und am anderen einen Carboxy-Endpunkt. Das heterofunktionelle PEG kann an der Oberfläche durch seinen Amino-Endpunkt immobilisiert werden, wobei eine von einer Reihe von geeigneten Immobilisierungschemien angewandt wird, die mit Aminogruppen ⁱⁿ Reaktion treten. Wie oben beschrieben wird, umfassen diese Verfahren solche, die Cyanogenbromid, N,N'-Carbonyldümidazol und dergleichen verwenden. Nach Blockierung von verbleibenden reaktiven Gruppen wird der interessierende Ligand unter Anwendung einer geeigneten Chemie kovalent an den Carboxy-Endpunkt des heterofunktionellen PEG gekoppelt. Ein derartiges Reagens, das die Bildung von Amidbindungen zwischen einer Carboxylgruppe und einem Amin vereinfacht, ist 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodümid.
Das Immobilisierungsverfahren unter Anwendung von PEG bietet mehrere Vorteile. Erstens reduziert die Verwendung einer extrem langen Molekülkette die sterische Störung an der Oberfläche und erlaubt eine Vielfachschichtung großer Makromoleküle an der Oberfläche. Nach unserer Erfahrung mit der Avidin-Biotin-Chemie hat beispielsweise die Anwesenheit von Avidin die Antikörper-LDL-Wechselwirkung von der Membranoberfläche weg projiziert, aber die Gesamtkapazität der Membran war immer noch durch die verfügbare Oberfläche begrenzt, an die LDL-Partikel gebunden waren. Indem man lange, flexible Molekülketten von der Membranoberfläche verlaufen läßt, wurde der Antikörper von der Membran auf solche Weise weg projiziert, daß eine Stapelung von makromolekularen Zielsubstanzen zugelassen wird. Benachbarte Ketten können die gleiche Länge haben, aber durch Erstreckung in unterschiedlichem Maß kann eine teilweise aufgewickelte Kette, die an LDL gebunden ist, keine Störung mit LDL bewirken, das an eine nahe Kette gebunden ist, die vollständig verlängert ist.
Avidin projiziert den Antikörper zwar auch von der Membranoberfläche weg, aber ein langer flexibler Spacer kann den Antikörper wirkungsvoller in die fließende Flüssigkeit hinein projizieren und die Bindungskinetik ebenso wie die Kapazität steigern.
Es ist zu beachten, daß zwar die Vorgehensweise mit PEG anscheinend viele Vorteile besitzt, die chemische Vorgehensweise des Einsatres von PEG aber inhärent eventuell nicht die chemische Flexibilität des Avidin-Biotin-Modells hat. Insofern kann der gemeinsame Einsatz sowohl von PEG als auch eines Avidin-Biotin-Komplexes günstig sein. Bei einer solchen Vorgehensweise würde Avidin mit PEG gekoppelt, das an der Membranoberfläche immobilisiert worden ist. Die Avidin-Biotin-Chemie wird dann wie oben beschrieben zur Immobilisierung des Liganden angewandt.
Nachstehend folgen beispielhaft und nicht-einschränkend Ergebnisse von Experimenten, die einige beispielhafte Immobilisierungstechniken zeigen. Diese Beispiele zeigen verschiedene Immobilisierungen, die an Flachfolienmembranen im Gegensatz zu Hohlfasermembranen durchgeführt wurden. Diese Beispiele werden hier eingeführt, um die gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelten verbesserten Immobilisierungsmodelle aufzuzeigen. Die nachstehenden Beispiele unterscheiden sich hauptsächlich in ßezug auf das Material, das bei der Kopplungschemie eingesetzt wurde: (1) Avidin; (2) Streptavidin; und (3) Polyethylenglykol.
EXPERIMENTELLES BEIEPIEL 1
Gegen Human-Apolipoprotein B (apoB) gerichtetes Schaf-Immunglobulin G (IgG), das mittels Affinitätschromatographie isoliert worden war, wurde mit Natriummetaperiodat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oxidiert. Die Reaktion wurde mit Glycerin abgeschreckt, und die Reaktionsteilnehmer wurden von oxidiertem IgG mittels Gel-Permeationschromatographie getrennt. Oxidiertes IgG wurde biotinyliert durch Umsetzung mit Biotin-LC-Hydrazid (Pierce, Rockford, IL).
Avidin (Pierce) wurde an Immobilon AV Membranen (Millipore) durch Befolgen des Diffusions-Immobilisierungsverfahrens gemäß den Anweisungen des Herstellers immobilisiert. Nichtumgesetrte Stellen wurden mit fettfreier Trockenmilchlösung (1% w/w) abgeschlossen. Membranen, die immobilisiertes Avidin enthielten, wurden in eine Lösung getaucht, die biotinyliertes IgG enthielt. Die Menge an IgG, die an der Membran immobilisiert war, wurde aus der Änderung des Absorptionsvermögens der Lösung bei 280 nm bestimmt. Die Dichte von IgG war 143 μg/ml Membranvolumen.
Die statische Membrankapazität wurde bestimmt durch Inkubation der Membranen in einer Lösung aus Humanplasma, die einen Überschuß von apoB enthielt. Nach ausgiebigem Spülen mit Pufferlösung (phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4) wurde apoB aus der Membran mit 0,04 M Citratpuffer mit pH 2,9 eluiert. Die Menge von apoB, die in dem Elutionspuffer anwesend war, wurde durch einen Gesamtproteinassay (von BioRad im Handel erhältlich) bestimmt.
Die Kapazität der resultierenden Membran war 31 μg apoB pro ml Membranvolumen.
EXPERIMENTELLES BEISPIEL 2
Die Herstellung von oxidiertem IgG erfolgte auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1. Streptavidin (Pierce) wurde an Immobilon AV Membranen (Millipore Corporation, Bedford, MA) unter Befolgung des Diffusions-Immobilisierungsverfahrens entsprechend den Anweisungen des Herstellers immobilisiert. Nichtumgesetzte Stellen wurden mit fettfreier Trockenmilchlösung (1% w/w) abgeschlossen. Membranen, die immobilisiertes Streptavidin enthielten, wurden in eine Lösung getaucht, die biotinyliertes IgG enthielt. Die Menge an IgG, die an der Membran immobilisiert war, wurde aus der Änderung des Absorptionsvermögens der Lösung bei 280 nm bestimmt. Die Dichte des IgG war 1,39 mg/ml Membranvolumen.
Die Bestimmung der statischen Membrankapazität erfolgte gemäß der Beschreibung in Beispiel 1. Die Kapazität der resultierenden Membran war 30 μg apoB je ml Membranvolumen.
EXPERIMENTELLES BEISPIEL 3
Die Herstellung von oxidiertem IgG wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt. Heterofunktionelles Poly(ethylenglykol) (NH₂-PEG-COOH, erhältlich von Shearwater Polymers, Huntsville, AL) wurde an Immobilon AV Membranen immobilisiert unter Befolgung des Punktimmobilisierungsverfahrens in den Anweisungen des Herstellers. Nichtumgesetzte Stellen wurden mit Ethanolamin (7% v/v) abgeschlossen. Das immobilisierte Poly(ethylenglykol) ("PEG") wurde mit Adipinsäuredihydrazid in Anwesenheit von 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodümid ("EDC") umgesetzt zur Bildung einer funktionellen Stelle für die Ankopplung von oxidiertem IgG. Oxidiertes IgG wurde an den PEG-Hydrazid-Spacer gekoppelt, und die resultierende Schiffsche Base wurde mit Natriumcyanoborhydrid reduziert. Die Membranen wurden vor dem Gebrauch mit destilliertem Wasser und 1 M NaCl-Lösung gespült.
Die dynamische Membrankapazität wurde bestimmt, indem man eine Lösung aus Humanplasma durch einen Membranscheibenhalter (erhältlich von Amicon) fließen lieB, der einen Stapel Membranscheiben enthielt. Das Volumen des den Membranscheiben zugeführten Humanplasmas enthielt einen Überschuß von apoB. Die Zahl der Membranscheiben in dem Stapel lag zwischen 5 und 20. Die Menge von apoB, die an die Membran gebunden war, wurde aus der Differenz der Plasma-apoB-Konzentration zwischen dem Probenablauf aus dem Halter und der ursprünglichen Probe bestimmt. Die apoB-Konzentration in Plasma wurde mit einem handelsüblichen Assayset (erhältlich von Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) bestimmt.
Die Kapazität der resultierenden Membranen lag zwischen 0,39 und 2,03 mg apoB je ml Membranvolumen.
Die vorliegende Erfindung gibt auch ein Verfahren zum Behandeln bestimmter Krankheitszustände an, die durch zu hohe Spiegel einer gelösten Substanz im Blut gekennzeichnet sind. Wie bereits ausgeführt, ist die Aftinitätsmembranvorrichtung der vorliegenden Erfindung zum Gebrauch in einem extrakorporalen Blutkreislauf ausgebildet und kann gleichzeitig mit anderen therapeutischen Vorgängen zum Reinigen von Blut wie etwa Hämodialyse angewandt werden. Die immunadsorptive Therapie, die durch den Gebrauch der vorliegenden Erfindung verfügbar ist, kann als gesundheitsförderndes Behandlungsschema für bestimmte Krankheitszustände dienen. Insbesondere kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um Krankheitszustände zu behandeln, die mit der Anwesenheit einer bestimmten molekularen Einheit in Plasma zusammenhängen, wobei deren Entfernung den Zustand entweder vorübergehend oder auf permanenter Basis verbessert. Zusätzlich zu der Erkennung eines Zielmoleküls in Plasma beruht der Gebrauch der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von solchen Zuständen auf der Fähigkeit zur Identifizierung eines geeigneten Liganden, der imstande ist, ein solches Zielmolekül zu binden und aus dem Plasma zu entfernen.
Nur beispielhaft und nicht-einschränkend sind Beispiele für Krankheitszustände, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, etwa Hypercholesterinämie, Transplantatabstoßungen im Zusammenhang mit IgG oder IgM, Goodpasture-Syndrom, systemische GefäBentründung und systemischer Lupus erythematosus. Jede dieser Erkrankungen ist durch zu hohe Spiegel einer bestimmten gelösten Substanz in Blut charakterisiert. Beispielsweise sind Patienten, die an primärer Hypercholesterinämie leiden, dadurch charakterisiert, daß sie erhöhte Spiegel von Lipoprotein niedriger Dichte bzw. LDL haben, dessen Entfernung als wirksame Behandlung für den Krankheitszustand dient.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Affinitätsmembranvorrichtung nicht nur dazu dienen, eine gelöste Zielsubstanz von einem zu behandelnden Patienten zu entfernen, sondern kann gleichzeitig mit anderen Trennverfahren (z. B. Hämodialyse) angewandt werden. Dabei können bestimmte therapeutische Anwendungen vorteilhaft bei Patienten angewandt werden, die aktuell eine Hämodialysetherapie bei terminaler Niereninsuffizienz erhalten. Solche therapeutischen Anwendungen umfassen beispielsweise die extrakorporale Entfernung von LDL, Beta-2-Mikroglobulin und IgG bei Empfängern von Allotransplantaten. Diese Patienten sind für die extrakorporale Therapie ideal geeignet, da viele von ihnen sich bereits dreimal wöchentlich während drei bis vier Stunden der extrakorporalen Hämodialyse unterziehen. Außerdem sind viele dieser Patienten bereits operiert worden, um einen Zugang zu ihrem Gefäßsystem zu schaffen, was die Anwendung von hohen Blutdurchflußraten (>200 ml/min) gestattet.
Die Fähigkeit, die vorliegende Erfindung gleichzeitig mit einem Hämodialysevorgang anzuwenden, bietet natürlich Vorteile. Im allgemeinen erfordern extrakorporale Therapien ganz bestimmte zeitliche Verpflichtungen von Seiten des Patienten, es ist medizinisches Personal notwendig, um den Zugang zum Gefäß herzustellen und die Geräte zu bedienen, und es gibt medizinische Risiken, die mit diesem Gefäßzugang verbunden sind. Dadurch, daß das Entfernen der gelösten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung mit der Hämodialyse integriert wird, ergeben sich weder eine verlängerte Gesamtbehandlungsdauer noch zusätzliche Anforderungen oder Gefahren über diejenigen hinaus, die mit einer Hämodialysebehandlung selber verbunden sind.
Da die Implementierung der Affinitätsmembrantherapie einen Zugang zum Blutstrom erfordert, kann die Therapie besonders für Patienten geeignet sein, die regelmäßig eine extrakorporale Blutbehandlung wie etwa eine Hämodialyse durchführen. Wie nachstehend erörtert wird, leiden Dialysepatienten an verschiedenen Krankheitszuständen, die durch die Behandlung mit Affinitätsmembranvorrichtungen gemildert werden können. Bei Patienten, bei denen ein Zugang zum Blut nicht ohne weiteres verfügbar ist, ist die Anwendung der Affinitätsmembrantherapie auf diejenigen Krankheitszustände beschränkt, bei denen die Vorteile der Behandlung größer als die Gefahr eines Zugangs zum Blut sind. Beispiele von solchen Nicht-Dialyseanwendungen werden nachstehend im einzelnen erläutert.
Nur beispielhaft und nicht-einschränkend folgt nun ein ßeispiel eines Verfahrens, das die Anwendung der Affinitätsmembranvorrichtung der vorliegenden Erfindung verdeutlicht.
Vor der Einleitung der Dialyse erfolgt ein Eingriff zur Schaffung einer permanenten Blutzugangsstelle (entweder eines synthetischen arteriovenösen Transplantats oder einer Anastomose, d. h. einer chirurgischen Verbindung einer Arterie und einer Vene). Die Dialyse wird typischerweise unter Anwendung eines Doppelnadelverfahrens durchgeführt mit zwei separaten Leitungen zur Entnahme und Rückführung von Blut. Die Affinitätsvorrichtung wird in Reihe mit dem Dialysegerät angeordnet und gemeinsam mit dem übrigen Dialysekreislauf mit Kochsalzlösung vorbereitet. Das Blut wird in Übereinstimmung mit dem normalen Gerinnungshemmungs-Regime des Patienten gerinnungsgehemmt. Während der Dialyse wird Blut in den Dialysator mit einer Durchflußrate von 200–500 ml/min unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe gefördert. Da sich die Affinitätsmembranvorrichtung in Reihe mit dem Dialysator befindet, ist ihre Blutdurchflußrate gleich derjenigen der vorgeschriebenen Blutdurchflußrate des Patienten für die Dialyse. Zur Minimierung von Abweichungen von dem normalen Dialyseverfahren wird die Affinitätsvorrichtung während der üblichen Dialysebehandlungszeit des Patienten betrieben, die typischerweise dreimal wöchentlich drei bis vier Stunden beträgt. In Abhängigkeit von der Menge des zu entfernenden Zielliganden kann die Affinitätsvorrichtung während einigen oder sämtlichen Dialysevorgängen eingesetrt werden.
Beispielhaft und nicht-einschränkend sind Beispiele von Krankheitszuständen von Dialysepatienten, die durch Affinitätsmembranen verbessert werden können, Amyloidose, Hypercholesterinämie und Transplantatabstoßung.
Langzeit-Dialysepatienten leiden an Gelenkschmerzen und anderen Symptomen von Amyloidose, von denen angenommen wird, daß sie durch die Langzeitansammlung von Beta-2-Mikroglobulin in Gelenken und anderem Gewebe verursacht werden. Beta-2-Mikroglobulin ist ein niedermolekulares Protein, das normalerweise von den Zellmembranen aller kernhaltigen Zellen im Körper abgegeben wird. Normalerweise spielt die Niere eine kritische Rolle bei der Entfernung von überschüssigem Beta-2-Mikroglobulin aus dem Plasma. Bei nicht vorhandener Nierenfunktion erhöht sich die Konzentration von Beta-2-Mikroblobulin im Plasma allmählich auf das bis zu 50fache ihres Normalwerts. Eine hohe Plasmakonzentration bewirkt den Transport von Beta-2-Mikroglobulin in verschiedene Gewebe. Bei Dialysepatienten würde das periodische Entfernen von Beta-2-Mikroglobulin durch Behandlung mit einer Affinitätsmembran die Konzentration von Beta-2-Mikroblogulin im Plasma reduzieren. Eine niedrigere mittlere Plasmakonzentration würde den Transport von Plasma zum Gewebe. verringern und eventuell zu einem Entfernen aus dem Gewebe führen.
Die Hauptursache für den Tod von Dialysepatienten ist nicht die Nierenerkrankung, sondern eine Herz-Kreislauf-Erkrankung. In der Bevölkerung allgemein ist eine hohe LDL-Konzentration als Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen bekannt. Da ein erheblicher Anteil von Dialysepatienten hohe LDL-Werte hat, glauben die Erfinder, daß das hohe Risiko der cardiovaskulären Krankheitshäufigkeit und Sterblichkeit von Dialysepatienten teilweise ihren hohen LDL-Werten zuzuschreiben ist. Bei Patienten mit hohen LDL-Werten verringert das periodische Entfernen von LDL durch Behandlung mit einer Affinitätsmembran während der Dialyse die LDL-Konzentration, wodurch das Risiko der Krankheitshäufigkeit und Sterblichkeit verringert wird.
Der typische Empfänger eines Nierentransplantats bleibt während mehrerer Monate in Dialysebehandlung, während er darauf wartet, daß ein Spenderorgan verfügbar wird. Bei Allotransplantaten (d. h. menschlichen Organen für menschliche Empfänger) kann das Entfernen von Immunglobulin G (IgG) das Auftreten und/oder die Schwere einer akuten Organabstoßung verringern, wodurch die Transplantat-Überlebensraten insgesamt verbessert werden. Die Anwendung einer Affinitätsmembran, die IgG unmittelbar vor der Transplantation entfernt, verringert also den IgG-Spiegel zum Zeitpunkt der Transplantation, wodurch die Gefahr einer Transplantat-Abstoßung verringert wird.
ßei Patienten, bei denen ein dauerhafter Blutzugang nicht verfügbar ist, wird ein vorübergehender Zugang zum Blutstrom an einer geeigneten Stelle geschaffen (z. B. durch Einführen eines Doppellumenkatheters in die Subklavia). Die Lumenseite der Affinitätsvorrichtung wird mit einer peristaltischen Pumpe verbunden und mit Kochsalzlösung vorbereitet. Nach dem Vorbereiten der Lumenseite wird der Filtratanschluß geöffnet, um das Vorbereiten der Gehäuseseite zu ermöglichen. Dann wird die Filtratleitung abgeklemmt, während die Vorrichtung mit Blut vorbereitet wird. Um eine Blutgerinnung zu verhindern, kann Antikoagulans als Bolus (mittels Injektionsspritze oder Pumpe) zu Beginn des Verfahrens und/oder kontinuierlich während des gesamten Verfahrens (mittels einer Pumpe) zugegeben werden. Da die Blutdurchflußrate durch die Kapazität des vorübergehenden Zugangs begrenzt ist, liegt die maximale Blutdurchfluß rate zwischen 100 und 300 ml/min. Zum Gebrauch der in 2 gezeigten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Filtratanschluß geöffnet, nachdem das Blut die Lumenseite ausfüllt. Plasma- und Blutkonzentrationen der Zielsubstanz werden wie oben beschrieben verringert. Die Verfahrensdauer und die Häufigkeit des Gebrauchs sind von der zu entfernenden Menge des Zielliganden abhängig.
Nur beispielhaft und nicht-einschränkend sind Beispiele für drei Krankheitszustände von Patienten, die nicht dialysiert werden und bei denen Affinitätsmembranen angewandt werden können, schwere Hypercholesterinämie, Transplantatabstoßung und Autoimmunerkrankung.
Die schwerste Form der Hypercholesterinämie ist die reinerbige primäre Hypercholesterinämie. Wenn sie nicht behandelt wird, führt diese Krankheit normalerweise spätestens mit 20 Jahren zum Tod. Mildere Formen der Hypercholesterinämie brauchen eventuell keine invasive extrakorporale Blutbehandlung, aber Patienten mit reinerbiger primärer Hypercholesterinämie sind bisher mit komplexen und teuren Affinitätssäulenvorrichtungen behandelt worden. Im Vergleich mit Affinitätssäulen bieten Affinitätsmembranen die potentiellen Vorteile eines einfachen ßetriebs und verringerter Kosten. Bei Verwendung der Affinitätsvorrichtung erwarten die Erfinder, daß herabgesetrte LDL-Werte zu einer höheren Lebenserwartung führen.
Ebenso wie Dialysepatienten können andere Organtransplantat-Empfänger aus dem Entfernen von Immunglobulinen vor der Transplantation Nutren ziehen. Wie oben erörtert wurde, kann das Entfernen von Immunglobulin G (IgG) vor Allogentransplantationen das Auftreten und/oder die Schwere der akuten Organabstoßung verringern und dadurch die Gesamtraten des Überlebens von Transplantaten verbessern. Angesichts des ungeheuren Mangels an menschlichen Organen für die Transplantation wird derzeit die Xenotransplantation (z. B. die Verwendung von Schweineorganen für menschliche Empfänger) untersucht. Das Entfernen der für die hyperakute Abstoßung verantwortlichen Unterklasse von Immunglobulin M (xenoreaktives IgM) kann ein Schlüsselaspekt für den Erfolg einer Xenotransplantation sein.
Bei Autoimmunkrankheiten wie systemischem Lupus erythematosus entwickelt ein Patient Antikörper für seine eigenen Zellen. Die Vielzahl von Symptomen einer Autoimmunerkrankung kann den Wirkungen von Autoantikörpern auf bestimmte Gewebe oder der Ansammlung von Immunkomplexen, die aus solchen Autoantikörpern gebildet werden, zuzuschreiben sein. Daher würde das Entfernen von Autoantikörpern und/oder Immunkomplexen durch Anwendung einer Affinitätsmembran die Symptome und Komplikationen von Autoimmunerkrankungen verringern. Bei Autoimmunkrankheiten, die letztlich die Nieren angreifen, wie beispielsweise die Goodpasture-Krankheit und systemische Gefäßentründung, würde das Entfernen von Autoantikörpern das Fortschreiten der Nierenerkrankung verlangsamen und damit die Notwendigkeit einer Dialyse hinausschieben oder vermeiden.

Claims

Affinitätsmembranvorrichtung zum Gebrauch bei der selektiven Entfernung von Zielmolekülen, die in Blutplasma enthalten sind, wobei die Vorrichtung folgendes aufweist: ein langgestrecktes Gehäuse, das eine Einlaßöffnung und eine Auslaßöffnung zum Eintritt und Austritt von Blut daraus hat; Hohlfasern, die in einem inneren Hohlraum des langgestreckten Gehäuses umschlossen sind, wobei die Hohlfasern eine Wanddicke von ungefähr 300 bis 3500 μm, Innendurchmesser von ungefähr 70 bis 140 μm haben und Poren einer Größe aufweisen, die zum Auftrennen von Blut in Plasma und Zellkomponenten geeignet ist, wobei die Poren Liganden haben, die an einer inneren Oberfläche der Poren immobilisiert sind, und die Liganden eine Affinität für die Zielmoleküle in dem Plasma haben, wobei im Gebrauch die Zellkomponenten des Bluts nicht in die Poren der Hohlfasern fließen und das Plasma mittels positiver Filtration, die durch den Transmembrandruck innerhalb der Hohlfasern erzeugt wird, in die Poren transportiert wird, wobei die positive Filtration in Abwesenheit einer externen Pumpe zum Erzeugen eines Plasmastroms über die Hohlfasern stattfindet.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Porengröße zwischen ungefähr 0,2 und 0,6 μm liegt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Hohlfasern Wandstärken mit einer adäquaten Oberfläche für die Anhaftung der Liganden haben, um die hinreichende Bindung der Zielmoleküle zuzulassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Liganden Enzyme sind, die die Zielmoleküle modifizieren und die Zielmoleküle freisetzen, nachdem sie modifiziert sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das langgestreckte Gehäuse eine einzige Auslaßöffnung und eine einzige Einlaßöffnung hat.
Vorrichtung nach Anspruch 1, die ferner eine Plasmaleitung aufweist, die an dem langgestreckten Gehäuse angebracht ist und die erneute Vereinigung von Nicht-Zielmolekülen des Plasmas mit den Zellkomponenten mittels eines bestehenden Druckgradienten zuläßt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die folgendes aufweist: eine Vielzahl von langgestreckten Hohlfasern, wobei jede Faser eine ein Lumen umgebende Umfangswand hat, die Umfangswand eine Vielzahl von sie durchsetzenden Poren hat, Anzahl und Konfiguration der Poren wirksam sind, um Blut in Plasma und Zellkomponenten aufzutrennen, jede Pore eine solche Längendimension hat, daß eine ausreichende Oberfläche für die Anhaftung des Liganden bereitgestellt ist, um sicherzustellen, daß die Liganden im wesentlichen sämtliche Zielmoleküle einfangen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hohlfasern aus Material bestehen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: Cellulosetriacetat; Polysulfon; Polyacrylnitril; Ethlen-Vinylalkohol-Copolymer; Polymethylmethacrylat; Polyamid, Polypropylen; Celluloseacetat; Regeneratcellulose; Polycarbonat, Polyethylen; Polyvinylalkohol; und Polyvinylchlorid.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Ligand an der Oberfläche der Poren mit einem Avidin-/Biotin-Molekularkomplex immobilisiert ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Liganden an der Oberfläche der Poren mit Polyethylenglykol immobilisiert sind.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei das Polyethylenglykol eine Kettenlänge von 50 bis 250 Kohlenstoffatomen hat.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Ligand ein polyklonaler Antikörper ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Ligand ein Autoantigen ist, das imstande ist, Autoantikörper zu binden.
Vorrichtung nach Anspruch 1, die ferner ein einziges Bündel der Hohlfasern aufweist, die in dem Innenhohlraum des langgestreckten Gehäuses umschlossen sind.
Verfahren zum selektiven Entfernen von in Plasma vorhandenen Zielmolekülen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Vorsehen einer Hohlfasermembranvorrichtung, die folgendes hat: (a) ein langgestrecktes Gehäuse mit einer einzigen Einlaßöffnung und einer einzigen Auslaßöffnung zum Eintritt und Austritt von Blut daraus; und (b) Hohlfasern, die im Inneren des Gehäuses umschlossen sind, wobei die Hohlfasern Wandstärken von ungefähr 300 bis 3500 μm, Innendurchmesser von ungefähr 70 bis 140 μm haben und Poren geeigneter Größe aufweisen, um Blut in Plasma und Zeltkomponenten aufzutrennen, wobei die Poren an eine innere Oberfläche der Poren gebundene Liganden haben und die Liganden eine Affinität für die Zielmoleküle in Plasma haben; Transportieren von Blut in vitro in die Einlaßöffnung des Gehäuses; Bewirken, daß das Plasma des Bluts in die Poren der Hohlfasern durch positive Filtration fließt, die durch einen positiven Transmembrandruck nahe der Einlaßöffnung erzeugt wird, während gleichzeitig nicht zugelassen wird, daß die Zeltkomponenten in diese fließen; In-Kontakt-Bringen der Zielmoleküle in dem Plasma mit den Liganden über einen klinisch signifikanten Zeitraum, um die Bindung der Zielmoleküle an die Liganden zuzulassen; und Bewirken, daß Nicht-Zielmoleküle des Plasmas durch die Poren der Hohlfasern mittels Umkehrfiltration, die durch einen negativen Transmembrandruck nahe der Auslaßöffnung erzeugt wird, zurückfließen, um sich erneut mit den Zellkomponenten des Bluts zu vereinigen.
Verfahren nach Anspruch 15, das ferner den Schritt aufweist: Bewirken, daß sich die Nicht-Zielmoleküle mit den Zellkomponenten durch eine Plasmaleitung mittels eines bestehenden Druckgradienten erneut vereinigen.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Porengrößen in den Hohlfasern zwischen ungefähr 0,2 und 0,6 μm liegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Hohlfasern aus Material bestehen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: Cellulosetriacetat; Polysulfon; Polyacrylnitril; Ethlen-Vinylalkohol-Copolymer; Polymethylmethacrylat; Polyamid, Polypropylen; Celluloseacetat; Regeneratcellulose; Polycarbonat, Polyethylen; Polyvinylalkohol; und Polyvinylchlorid.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die Liganden an die innere Oberfläche der Poren mit Polyethylenglykol gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Polyethylenglykol eine Kettenlänge von 50 bis 250 Kohlenstoffatomen hat.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Membranvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7 ist.