DE2532883C2

DE2532883C2 - Verfahren und Vorrichtung zur selektiven Gewinnung eines Reaktionspartners einer Immunreaktion aus dem strömenden Blut von lebenden Organismen

Info

Publication number: DE2532883C2
Application number: DE2532883A
Authority: DE
Inventors: Hans-Peter Dr. 6906 Leimen Geisen; Herbert Dr. 6900 Heidelberg Jungfer; Eckhard Dr. Kownatzki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-07-23
Filing date: 1975-07-23
Publication date: 1983-03-24
Also published as: DE2532883A1

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs. Ein derartiges Verfahren ist aus der US-PS 38 57 393 insoweit bekannt, als der zellfreie Lymphflüssigkeit behandelt wird.

Die Entfernung, Gewinnung und Modifizierung von Substanzen der Blutflüssigkeit von Menschen und Tieren hat ein weites Anwendungsgebiet, sei es zur Gewinnung menschlicher oder tierischer Serumprodukte, wie Gerinnungsfaktoren, Antikörper, Albuminpräparation und Enzyme, die in der Therapie und Diagnostik sowie als Hilfssubstanzen bei biologischen Präparationen und Reaktionen eingesetzt werden, sei es zur Entfernung von Schadstoffen, die sich in der Blutflüssigkeit ansammeln und zu Funktionsstörungen oder Krankheiten führen können.

In der modernen Biologie, Biochemie und Medizin läßt man zahlreiche Verfahren in Systemen ablaufen, in denen einer der Reaktionspartner löslich, der andere durch Kupplung an einen unlöslichen Träger unlöslich ist. Das hat den Vorteil, daß sich die Reaktionsprodukte sehr rasch und einfach von der Lösung, in der sich die Reaktion abspielt, trennen lassen. Als Beispiele seien genannt die Peptidsynthese aus einzelnen Aminosäuren, die Wirkung von Enzymen auf Substrate und die Immunadsorption, bei der Antigene mit insolubilisierten Antikörpern oder Antikörper mit insolubilisierten Antigenen reagieren.

Antikörper sind bekanntlich Eiweißstoffe, die von einem Wirbeltierorganismus bei der Abwehr von Fremdstoffen (Antigenen) gebildet werden. Antikörper zeichnen sich durch ihre Spezifität aus, das ist die Fähigkeit ausschließlich mit dem Antigen, das ihre Bildung ausgelöst hat, zu reagieren. Bei einem Aufeinandertreffen von Antigenen und spezifisch gegen sie gerichteten Antikörpern gehen beide eine enge Verbindung über nichtkovalente Wechselwirkungen ein.

Bei der fmmunadsorption wird einer der beiden Reaktionspartner (A) kovalent an einen unlöslichen Träger (T) gekuppelt Kommt dieser Komplex T-A in intensiven Kontakt mit einer Lösung, die den anderen Reaktionspartner (B) enthält so wird sich dieser selektiv an den Komplex T-A binden und es entsteht der Komplex T-A-B. Ein Filtriervorgang erlaubt die Trennung des Komplexes T-A-B von der übrigen Lösung.

Mit diesem Vorgang läßt sich die Lösung selektiv von der Substanz B befreien. Durch geeignete Verfahren, die nichtkovalente Bindungen unterbrechen, läßt sich B von T-A wiederum ablösen und auf diese Weise als reine Substanz gewinnen. Bei der Immunadsorption ist es gleichgültig, ob Antigene oder Antikörper insolubilisiert werden. Sie läßt sich im Prinzip auch auf andere Systeme anwenden, bei denen zwei Reaktionspartner über nichtkovalente Wechselwirkungen selektiv miteinander in Beziehung treten, wie z. B. Enzym und Substrat. Aus mehreren Gründen war es bislang nicht möglich, derartige Verfahren auf den Kreislauf eines Lebewesens anzuwenden. Während für die Diffusion kleinmolekularer Substanzen, wie sie bei der künstlichen Niere ausgenutzt wird, eine Austauschfläche von ca. 2 m² ausreicht, benötigt man für die Kupplung großer Moleküle wie der Antikörper oder Enzyme aus räumlichen Gründen sehr viel größere Oberflächen. Da ein Antikörpermolekül einen Durchmesser von ca. 10 nm besitzt kann man auf einer Fläche von 1 m² maximal 3 mg Antikörper kuppeln. Für eine effiziente Immunadsorption bei einem Lebewesen müßte diese Menge auf das Hundert- bis Tausendfache erhöht werden. Da man in einem extrakorporalen Kreislauf das Volumen nicht ins Riesenhafte steigern kann, gibt es nur eine gangbare Lösung, um bei kleinem Volumen eine relativ große Oberfläche zu erzielen: die Verwendung eines porösen Trägers.

Damit ergibt sich ein weiteres Problem: das der Blutgerinnung und Thrombusbildung. Im Blut befindet sich ein Gerinnungssystem, das bei einer Verletzung der Blutbahn wie auch bei jedem Kontakt des Blutes mit fremden Materialien aktiviert wird und zu einer Umwandlung des löslichen Fibrinogens in das unlösliche Fibrin und damit zu einem Gerinnsel führt. Gleichzeitig kommt es zu einer Ablagerung und Aggregation von Blutplättchen und damit zu einer Thrombusbildung. Dieser Vorgang ist für die ständige Abdichtung der

Gefäßwandungen lebensnotwendig. Er kann zwar durch Medikamente wie z. B. Heparin gehemmt darf aber nie vollständig unterdrückt werden, da dies den sofortigen Verblutungstod des Lebewesens zur Folge hätte.

Eine mit dem Leben vereinbare Unterdrückung der Gerinnselbildung durch injiziertes Heparin ist ausreichend, um einen extrakorporalen Kreislauf aufrecht zu erhalten, sofern das Blut dabei, wie in einer künstlichen Niere der Fall, in einer laminaren Strömung fließt Injiziertes Heparin reicht jedoch nicht aus, um eine Thrombusbi'dung an dem Fremdmaterial zu unterdrükken. Die Thrombusbildung steigert sich um ein Vielfaches, wenn man es nicht mehr mit einer laminaren Strömung an Membranen oder Platten, sondern mit einer turbulenten Strömung, wie sie bei porösen Trägern vorkommt, zu tun hat. Sie würde innerhalb weniger Augenblicke zu einer Verstopfung der Poren und damit zu einem Erliegen des extrakorporalen Kreislaufs führen. Selbst exzessiv injizierte Heparinmengen, die mit dem Leben nicht mehr vereinbar sind, könnten diesen Vorgang nicht verhindern. Aus diesem Grund ist ein extrakorporaler Kreislauf durch einen porösen Träger bisher niemandem gelungen.

Aus der DE-OS 24 30 171 ist eine Vorrichtung zur Dialyse von Blut bekannt, bei der eine der Oberflächen der porösen Dailysiermembran mit mindestens einer selektiv-chemisch-aktiven Substanz zur Entfernung von nichtwünschenswerten Proteinen aus den Blut belegt ist und bei der alle mit dem Blut in Berührung kommenden Flächen mittels an diesen Flächen gebundenen Heparins nicht-thrombogen gemacht sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, die es erlauben, das Blut eines Lebewesens in einem extrakorporalen Kreislauf durch eine Reaktionskammer mit einem an einen porösen Träger gekuppelten großmolekularen Reaktionspartner zu leiten, wobei einzelne Serumbestandteile selektiv gewonnen werden können, ohne daß eine Gerinnung des zu behandelnden Blutes und eine Thrombusbildung einsetzen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch das in den Ansprüchen definierte Verfahren und durch die in den Ansprüchen definierte Vorrichtung.

Die zur Durchführung des Verfahrens beanspruchte Vorrichtung besteht im Prinzip aus einem Schlauchsystern zum Ableiten des Blutes aus dem Kreislauf und dem wieder Zuleiten des Blutes in den Kreislauf des Lebewesens, einer den Blutstrom im System aufrechterhaltenden Schlauchpumpe und einer den insolubilisierten Reaktionspartner, nämlich das mit dem Reaktionspartner versehene poröse Glasgranulat, enthaltenden Kammer.

Durch ein Schlauchsystem wird Blut aus dem Kreislauf eines Lebewesens abgeleitet und an anderer Stelle wieder zugeleitet. Die Strömung in diesem extrakorporalen Kreislauf wird aufrechterhalten durch eine Schlauchpumpe. Das ableitende Schlauchsystem mündet in eine Kammer, die den insolubilisierten Reaktionspartner enthält und in der die Modifikation der Blutflüssigkeit stattfindet. Aus dieser Kammer wird so das durchströmende Blut über einen zuführenden Schlauch dem Gefäßsystem des Lebewesens wieder zugeleitet. Bei Anwendung am Menschen wird am ableitenden Schlauch ein Strömungs- und Druckmonitor angebracht, der die Pumpe bei Unterschreiten des &⁵ normalen Venendrucks abschaltet. Am zuführenden Schlauch ist eine Gasfalle angebracht.

Zur ^solubilisierung des in der Reaktionskammer befindlichen Reaktionspartners wird ein Glasgranulat verwendet, das den gelösten Bestandteilen eine große Oberfläche im Verhältnis zu einem kleinen Volumen bietet, das selbst keine unerwünschten Nebeneffekte auf die Blutbestandteile ausübt und das in ausreichender Zahl reaktionsfähige Gruppen aufweist, über welche die zu insolubilisierenden Substanzen kovalent gebunden werden können. Eine Gerinnung und Blutplättchenadhäsion wird dadurch verhindert, daß zusätzlich zu einer Heparinbehandlung alle mit dem Blut in Kontakt tretenden Teile einschließlich der Schlauchsysteme, der Kammerteile, des Granulats und des Reaktionspartners sehr dicht mit einer gerinnungshemmenden und antithrombogen wirkenden Substanz, wie z. B. Heparin, über kovalente Bindungen dauerhaft beschichtet werden. Für die Bindung von Heparin eignet sich die Verknüpfung einer oder mehrerer Carboxylgruppen des Heparins mit Aminogruppen der obengenannten Teile durch ein wasserlösliches Carbodiimid.

Alle mit dem Blut in Kontakt tretenden Teile sind zu sterilisieren oder steril und pyrogenfrei zu gewinnen und zu verarbeiten.

Die Erfindung wird anhand des Beispiels erläutert.

Beispiel

Immunperfusion:

Gewinnung von Antikörpern gegen menschliches Immunglobulin G (IgG) aus dem strömenden Blut eines aktiv immunisierten Schafes.

1. Herstellung des Immunadsorbens

140 ml eines porösen Glasgranulats mit einer Oberfläche von 128 m² werden durch Behandlung mit Ultraschall und Salpetersäure gereinigt und mit 3-i(Triäthoxsilyi)-propylaminsilanisiert.

In einer zweistufigen Reaktion werden 2,7 g menschliches IgG mittels Pentandial (Glutardialdehyd) kovalent an die Glasoberfläche gebunden. Aldehydgruppen, die nicht mit dem Frotein reagiert haben, werden mit einem Überschuß an Tetramethylendiamin blockiert.

16 g Heparin werden mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids über die freien Aminogruppen des Tetramethylendiamins und des IgG an die Glasoberfläche copolymerisiert.

2. Hämoperfusionsystem

Das Hämoperfusionsystem setzt sich zusammen (vgl. Vorrichtung Abb. 2) aus

einer zylinderförmigen Reaktionskammer 7 aus Polyamid, deren innerer Durchmesser 5,64 cm beträgt und deren Netze 5,6 cm voneinander entfernt sind,

einem blutableitenden Schlauch 8 und einem blutzurückführenden Schlauch 9 aus Silikongummi. In den Schlauch 8 ist ein T-Stück 10 eingefügt, das eine Verbindung zu dem Gefäß 11, gefüllt mit physiologischer Kochsalzlösung, herstellt,
zwei Venenkathetern 12 und 13 aus Polyamid,
einer peristaltisch wirkenden Schlauchpumpe 14 und zwei Schlauchklemmen 15 und 16.

Alle dem Hohlraum des Perfusionsystems einschließlich der Reaktionskammer zugewandten Flächen werJin antithrombogen gemacht, indem Heparin mittels eines Carbodiimids an oberflächengebundene Aminogruppen kovalent gebunden wird. Die Aminogruppen werden folgendermaßen erzeugt:

Auf die innere Oberfläche aller Teile, die aus Polyamid gefertigt sind, wirkt eine 3 η Salzsäurelösung 10 Stunden lang ein, die anschließend für eine Stunde durch eine 30%ige Tetramethylendiamin-Lösung ersetzt wird. Abschließend werden die Flächen ausgiebig mit destilliertem Wasser gewaschen.

Auf die innere aller Teile, die aus Silikongummi gefertigt sind, wirkt eine 10%ige Lösung von 3-(Triäthoxysilyil)-propylamin in Aceton über 24 Stunden ein. Anschließend werden die Flächen ausgiebig mit destilliertem Wasser gewaschen.

3. Zusammensetzen des Immunperfusionssystems

Die Reaktionskammer wird mit einer Stativklemme an einem Stativ so befestigt, daß die Kammerachse senkrecht steht.

Der obere Kammerdeckel 5 und das obere Netz 3 sind zunächst noch entfernt, der untere Kammerdeckel und das untere Netz 3 mit den zugehörigen Dichtungsringen 4 sind mittels des unteren Teils der Haltevorrichtung wasser- und luftdicht an den Mantel montiert.

Am Anschlußstutzen des unteren Kammerdeckels wird der Silikonschlauch 8 befestigt, der durch eine Peristaltikpumpe 14 geführt ist und durch das T-Stück 10 mit dem Gefäß 11 verbunden ist. Das freie Schlauchende von 8 ist durch die Klemme 15 verschlossen. Das Schlauchsystem 8 ist vollständig, die Kammer 7 so weit mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllt, daß der Flüssigkeitsspiegel etwa 0,5 cm oberhalb des unteren Netzes steht.

Das als Immunadsorbens wirkende bchandendelte Glasgranulat wird in ca. 160 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und in drei Teilmengen in die Kammer eingegossen. Durch Übertragung einer hochfrequenten Vibration auf die Kammer wird eine gleichmäßige und dichte Packung der sedimentierenden Immunadsorbens-Parttkel erreicht. Wenn die gesamte Immunadsorbensmenge in die Kammer gepackt worden ist, wird das obere aNetz 3 mit Dichtungsringen 4 und der obere Kammerdeckel 5 montiert und wasser- und luftdicht mit dem Mantel verbunden. Der Silikonschlauch 9 wird am Ansatzstutzen des oberen Kammerdeckels 5 befestigt Unter fortgesetzer Vibration der Kammer durch Einschalten der Pumpe 14 bei geschlossener Klemme 12 und geöffneter Klemme 16 wird physiologische Kochsalzlösung in die Kammer und in den Schlauch 9 gepumpt. Nach vollständigem Auffüllen mit Kochsalzlösung ist das Perfusionssystem gebrauchsfertig.

Das Zusammensetzen des Perfusionssystems geschieht unter Einhaltung keimfreier Bedingungen in einer Steril-Werkbank.

4. Irr.munperfusion

Ein Schaf, das drei Monate vor Perfusionsbeginn durch wiederholte Impfungen mit den menschlichen Serumproteinen Immunglobulin G (IgG) und der 3. Komplementkomponente (C 3) immunisiert worden ist, erhält eine intravenöse Injektion von 20 mg Promethazin und 5000 E Heparin. In die rechte Vena jugularis und in die linke Vena jugularis werden je ein Katheter eingeführt, die mit den freien Enden der Schläuche 8 und verbunden werden. Mit Einschalten der Schlauchpumpe 14 wird die Schiauchklemme 15 geöffnet und gleichzeitig die Schlauchklemme 16 verschlossen. Mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 50 ml pro Minute

wird Blut aus der rechten Vena jugularis durch die Reaktionskammer und zurück in die linke Vena jugularis geleitet. Während der Perfusion wird die rechte Vena jugularis durch Anlegen eines Kompressionsverbandes proximal von der Punktionsstelle gestaut.

Nach einer Perfusionsdauer von 2,5 Stunden wird die Klemme 15 geschlossen und gleichzeitig die Klemme 16 geöffnet. Durch diese Maßnahme wird das im Perfusionssystem befindliche Blut durch die aus dem Gefäß 11 nachströmende physiologische Kochsalzlösung ersetzt und in die linke Vena jugularis zurückgeführt. Sobald das System frei von Blut ist, werden beide Katheder 12,13 aus den Venen entfernt.

5. Elution des spezifisch gebundenen Antikörpereiweißes (Regeneration des Perfusionssystems)

Um das System zunächst von unspezifisch gebundenem Schafsserum-Proteinen zu befreien, werden die Schläuche und die Reaktionskammer mit einem Liter physiologischer Kochsalzlösung und anschließend mit einer 4 M NaCl-Lösung, die 0,02 M Äthylendiamintetraessigsäure enthält, gespült. Zur Kontrolle des Eiweißgehaltes der Spülfiüssigkeit wird das freie Ende des Schlauches 9 mit der Meßküvette eines Durchflußphotometers verbunden und die Absorptionsrate von Licht der Wellenlänge 280 nm durch die Spülflüssigkeit gemessen. Wenn die Absorptionsrate auf Werte unter 0,01 abgesunken ist, wird das Schlauchsystem und die Reaktionskammer mit 350 ml einer 1 η Propionsäure-Lösung gespült. Unter dem Einfluß der Propionsäure löst sich der.spezifische Schafsantikörper vom menschlichen IgG des Immunadsorbens und kann mit der Propionsäurelösung aus dem System gespült und so in reiner Form gewonnen werden.

Abschließend wird das System mit physiologischer Kochsalzlösung so lange gewaschen, bis alle Propionsäurereste entfernt sind. Das Immunperfusionssystem ist damit regeneriert und steht für eine Wiederverwendung zur Verfügung.

6. Analyse des Perfusionsergebnisses

Die immunpräzipitierenden Eigenschaften des Blutserums des Schafes vor und nach der Immunperfusion
werden mit Hilfe der quantitativen radialen Immundiffusionsmethode miteinander verglichen:

a) vor der Immunperfusion präzipitierten 1 ml Schafsserum

5,16 mg menschliches IgG und
1,21 mg menschliches C 3,

b) nach der immunperfusion präzipitierte i m! SchaiV
serum

0,25 mg menschliches IgG und
1,19 mg menschliches C 3,

c) im Propionsäure-Eluat sind 2380 mg spezifischer
Schafsantikörper gegen menschliches IgG enthalten. Antikörper gegen menschliches C 3 sind im
Eluat nicht nachweisbar.

Damit sind durch die 2,5stündige Immunperfusion
über 95% des Antikörpers gegen menschliches IgG aus
dem strömenden Blut des Schafes selektiv entfernt
worden.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber
herkömmlichen Verfahren eine Reihe wesentlicher
Vorteile auf:

Es können selektiv ein, zwei oder mehr Blutbestandteile gleichzeitig entfernt oder modifiziert werden. Das Verfahren eignet sich ebenso für großmolekulare wie für kleinmolekulare Substanzen. Die Ausbeute ist wesentlich höher als etwa bei der Plasmapherese nämlich, je nach Wahl des perfundierten Biutvolumens nahe 100%. Das gesamte System ist nach Regeneration wiederverwendbar Das führt bei dem ohnehin preisgünstigen Verfahren zu einer weiteren Sen- ίο kung der Kosten.
Bei der Gewinnung von Serumbestandteilen ist

außer der Elution von dem insolubilisierten Reaktionspartner kein zusätzliches Reinigungsoder Isolierungsverfahren notwendig.
Ein Verlust von Erythrozyten, Lymphozyten und Thrombozyten tritt nicht ein oder ist sehr gering.
Das Volumen des extrakorporalen Kreislaufes ist so klein, daß ein Blutersatz durch Fremdblut nicht erforderlich ist.

Da das Kreislaufvolumen des Probanden nicht verändert wird, und der extrakorporale Kreislauf in das venöse Kreislaufsystem eingeschaltet ist, tritt eine zusätzliche Herzbelastung nicht auf.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur selektiven Gewinnung eines Reaktionspartners einer Immunreaktion aus dem strömenden Blut von lebenden Organismen, wobei das Blut aus dem Kreislauf des lebenden, mit Heparin vorbehandelten Organismus abgeleitet, in einem extrakorporalen Kreislauf mit einem an einen porösen unlöslichen Träger gekuppelten anderen Reaktionspartner der Immunreaktion in Berührung gebracht und dann das Blut dem Kreislauf des Lebewesens wieder zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet,

daß man den Reaktionspartner mit einem als Träger dienenden porösen Glasgranulat, welches eine im Verhältnis zu seinem Volumen große Oberfläche aufweist, kovalent bindet,

das Glasgranulat, den Reaktionspartner und alle Innenwandungen der Apparatur mit einem kovalent gebundenen dichten Überzug einer gerinnungshemmenden antithrombogenen Substanz versieht und
das Blut durch ein Bett aus dem als Träger dienenden überzogenen Glasgranulat leitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Pentandial (Glutardialdehyd) an reaktionsfähige Gruppen auf dem Träger gebunden wird, daß der Reaktionspartner mit seinen Aminogruppen an die freien Aldehydgruppen des Glutaraldehyds gebunden wird, daß übrigbleibende Aldehydgruppen mit Tetramethylendiamin abgesättigt werden und daß an die nicht abgebundenen freien Aminogruppen des Tetramethyldiamins und an die übrig gebliebenen freien Aminogruppen des Reaktionspartners die gerinnungshemmende Substanz wie z. B. Heparin über wasserlösliches Carbodiimid gekuppelt wird.

3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Kammer mit einem zylinderförmigen Mantel (1), zwei ringförmigen Netzträgern (2), zwei Netzen (3), die mit je einem Netzträger (2) fest verschweißt sind, vier Dichtungsringen (4), zwei Deckeln (5) mit zentraler Bohrung und Anschlußstutzen für das zu- und abführende Schlauchsystem und einer Haltevorrichtung (6) besteht, die den Träger enthält.