DE2732437C3

DE2732437C3 - Wasserunlösliches Haptoglobinpräparat und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2732437C3
Application number: DE2732437A
Authority: DE
Inventors: Satoshi Katano Funakoshi; Takao Toyonaka Oomura
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1976-08-27
Filing date: 1977-07-18
Publication date: 1979-09-27
Also published as: NL176637C; CH632930A5; BE857021A; CA1085291A; ES460861A1; DE2732437A1; LU77802A1; FR2362861A1; SE446430B; GB1551646A; US4113853A; FR2362861B1; SE7707889L; JPS5523806B2; NL7708024A; DE2732437B2; NL176637B; JPS5329908A

Description

Haptoglobin (nachstehend auch mit Hp bezeichnet) ist ein Blutplasmaprotein mit einem Molekulargewicht von 86 000 bis 400 000. Es spielt im .Stoffwechsel von im Blut freigesetztem Hämoglobin eine wichtige Rolle. Bei Obermäßiger Freisetzung von Hämoglobin (nachstehend mit Hb bezeichnet) im Blut wird dieses durch die Nierentubuli in den Urin ausgeschieden, was nicht nur einen Eisenverlust sondern auch Störungen der Nierentubuli hervorruft. Haptoglobin spielt eine wichtige Rolle bei der Eisenrückgewinnung und bei der Verhinderung der Störung der Nierenfunktion, da es in vivo eine selektive und feste Bindung des Hämoglobins bewirkt und Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexe bildet, die leicht vornehmlich durch die Leberparenchymzellen aufgenommen und dort verstoffwechselt werden.

Die sogenannte Hämolyse, d. h. die Freisetzung von Hämoglobin, wirft heutzutage große Probleme auf. Hämolyse wird beispielsweise durch Transfusion von unverträglichem Blut, schwere Verbrennungen, Herzoperationen und hämolytische Erkrankungen hervorgerufen. Dabei leidet der Patient häufig gleichzeitig an Nierenstörungen, die zu einer lebensbedrohenden Niereninsuffizienz führen können.

Der Verwendung von Haptoglobin bei derartigen, auf Hämolyse zurückzuführende Nierenstörungen wurde bereits besondere Aufmerksamkeit zugewandt. Es wurde ein Verfahren zur Herstellung von hochgereinigten Haptoglobinpräparaten vorgeschlagen; vgl. Jp-OS 77 516/75, GB-PS 14 26 039, DE-OS 24 09 650 und FR-OS 22 51 314. Auf diese Weise werden injizierbare Haptoglobinpräparate zur kausalen Behandlung der vorerwähnten Nierenstörungen erhalten. Bei der

intravenösen Verabfolgung von Haptoglobinpräparaten verbindet sich Haptoglobin mit freigesetztem Hämoglobin und sorgt für eine Normalisierung des Hämoglobinstoffwechsels.

In jüngster Zeit wurden erhebliche Fortschritte bei 5 Operationen unter Anwendung von extrakorporalem Blutkreislauf, beispielsweise eines künstlichen Herz-Lungen-Systems oder von künstlichen Nieren, gemacht. Bei einer läng^; dauernden Zirkulation des Bluts durch ein derartiges extrakorporales System erfolgt Hämolyse unter Freisetzung von Hämoglobin. Das freigesetzte Hämoglobin verursacht häufig Nierenstörungen, die eine Fortsetzung der Operation mit extrakorporalem Kreislauf erschweren. Eine Behandlung mit Haptoglobinpräparaten ist auch in derartigen, durch die fortgesetzte Anwendung des extrakorporalen Kreislaufs verursachten Fällen von Hämolyse wirksam. Jedoch lcönnen Haptoglobinpräparate nach der Verabfolgung an den lebenden Körper nicht zurückgewonnen werden, d.h. die Haptoglobinpräparate können nicht wieder verwendet werden. Außerdem vereinigt sich das in den lebenden Körper injizierte Haptoglobin mit dem Hämoglobin unter Bildung eines Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexes (nachstehend mit Hb-Hp bezeichnet). Dieser Komplex wird in die Leber transportiert und dort dem Stoffwechsel unterworfen. Dabei tritt eine zu schwere Belastung von Patienten mit reduzierter Nierenfunktion ein. Demzufolge ist die intravenöse Injektion von Haptoglobinpräparaten bei derartigen Patienten unzweckmäßig. jo

Es wurde bereits ein Verfahren zur Entfernung von freigesetztem Hämoglobin aus dem Blut vorgeschlagen, wobei die sogenannte Affinitätschromatographie angewendet wird. Dabei wird Haptoglobin an einen Agarose enthaltenden Träger gebunden, wodurch das Haptoglo- η bin fixiert und unlöslich gemacht wird. Das erhaltene Produkt wird als Adsorptionsmittel verwendet; vgl. M. Klein und C. M i h a e s c o, Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 52 (1973), Nr. 3, S. 774-778.

Das vorstehende Verfahren wurde für therapeutische Zwecke fortentwickelt Dazu wurde ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung gestellt, die als Blutfiltrationsvorrichtung bezeichnet werden kann. Mit dieser Vorrichtung wird freigesetztes Hämoglobin entfernt, indem man das Hämoglobin im zirkulierenden Blut an unlöslich gemachtes Haptoglobin, das auf verschiedene Trägerstoffe aufgebracht ist und in einem extrakorporalen Kreislaufsystem, beispielsweise einem künstlichen Herz-Lunge;i-System enthalten ist, bindet. Auf diese Weise gelingt es, das Hämoglobin direkt aus dem Körper zu entfernen, ohne die Leber zusätzlich zu belasten; vgl. JP-OS 105 186/76, 79 717/76 und 79 718/76. Jedoch erwiesen sich alle diese in Wasser unlöslichen fixierten Haptoglobinpräparate für praktisehe Zwecke in bezug auf die Menge an fixiertem Hp, die Hb-Bindungskapazität, die physikalische Festigkeit und das Verhalten nach der Regeneration als nicht zufriedenstellend.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein wasserunlösliches Haptoglobinpräparat mit einem hohen Gehalt an aktivem Haptoglobin und einer hohen Hämoglobinbindungskapazität zur Verfugung zu stellen. Dieses Präparat soll eine ausreichende physikalische Festigkeit aufweisen, daß es als Adsorptionsmittel für Hämoglobin in einem extrakorporalem Kreislaufsystem verwendet wertkn kann. Ferner soll dieses Haptoglobinpräparat nach der Verwendung als Adsorptionsmittel für Hämoglobin in einem extrakorporalen Kreislaufsystem unter günstigen Ergebnissen regeneriert werden können.

Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung des Haptoglobinpräparats zu entwickeln. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst Die Erfindung betrifft somit die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände. Die Lösung dieser Aufgaben beruht auf dem überraschenden Befund, daß Fibrin als Träger zur Fixierung von Haptcglobin besonders wirksam ist

Im Vergleich zu herkömmlichen fixierten Hp-Präparaten oder Präparaten für Injektionszwecke sind die erfindungsgemäßen fixierten Haptoglobinpräparate für praktische Zwecke wesentlich besser geeignet, da sie eine hohe Hämoglobinbindungskapazität aufweisen und ihre Aktivität auch bei längerdauernder kontinuierlicher Verwendung behalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von unlöslich gemachtem Hapt.-;jlobin kann auf verschiedene Weise ausgeführt werden, beispielsweise durch Einbetten von Haptoglobin in Fibrin nach einem beim Unlöslichmachen von Enzymen üblichen Verfahren oder durch Umsetzen von Haptoglobin und Fibrin oder Fibrinogen mit einer bifunktionellen Verbindung (Vernetzungsmittel), die zur Reaktion mit diesen Substanzen in der Lage ist und sie aneinander binden (vernetzen) kann, und, sofern Fibrinogen verwendet wird, anschließende Umsetzung des Reaktionsprodukts mit Thrombin zur Umwandlung des Fibrinogenrests in einen Fibrinrest

Für den erfindungsgemäß verwendeten Haptoglobintyp bestehen keine speziellen Beschränkungen, er hängt vielmehr vom beabsichtigten Verwendungszweck des Präparats ab. Sollen die Haptoglobinpräparate in Vorrichtungen zur Entfernung von Hämoglobin in einem extrakorporalen Kreislaufsystem verwendet werden, wird zweckmäßigerweise injizierbares gereinigtes Haptoglobin menschlichen Ursprungs verwendet, das sich auf die vorstehend beschriebene Weise zur Herstellung von wäßrigen Haptoglobinlösungen eigne :.

Fibrinogen wird durch Einwirkung von Thrombin zu in Wasser unlöslichem Fibrin umgewandelt Das erfindungsgemäß eingesetzte Fibrinogen unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Die Wahl des Fibrinogens hängt vom Verwendungszweck des Haptoglobinpräparats ab. Bei der Verwendung des Präparats in einem extrakorporalem Kreislaufsystem wird Fibrinogen menschlichen Ursprungs bevorzugt Derartiges Fibrinogen wird nach üblichen Verfahren gewonnen, beispielsweise nach Co h η durch Fällung mit kaltem Äthanol, wobei die Fraktion I als entsprechende Fibrincgenquelle dient Haptoglobin, Fibrinogen und Thrombin, die in der erfindungsgemäßen Reaktion verwendet werden» werden vorzugsweise zur Inaktivierung von Hepatitisvieren nach üblichen Verfahren vorbehandelt, beispielsweise durch Erhitzen oder UV-Bestrahlung, Bei Verwendung von Ausgangsprodukten, die eine; derartigen Behandlung unterzogen worden sind, erhält man Präparate, bei denen keine Gefahr einer Hepatitisvirus-Infektion besteht

Als Vernetzungsmittel werden erfindungsgemäB bifunktionelle Verbindungen verwendet, die als unlöslichmachende, vernetzende Mittel für Enzyme bekannt sind, wie Glutardiakiehyd, Hydrazin, Äthylendiamin, Methylendibromid, Bisdiazo-o-dianisidin, Bisdiazobenzidin und Carbodiimid (Cyanamid). Besonders bevorzugt werden Glutardialdehyd und Carbodiimid, da diese

Verbindungen eine hohe Vernetzungswirksamkeit aufweisen und zu Produkten führenderen Hb-Bindungskapazität in ausreichendem Maße erhalten bleibt.

Die erlindungsgemäßen Reaktionen unter Beteiligung von Haptoglobin, Fibrinogen, einer bifunktionellen Verbindung und Thrombin werden in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Die Reaktionsfolge der Reaktionsteilnehmer ist nicht kritisch, sofern eine Verbindung zwischen Fibrinogen oder Fibrin und Haptoglobin erreicht wird. Gemäß nachstehenden Reaktionüfolgen gelangt man zu ähnlichen Ergebnissen:

a) Umsetzen der bifunktionellen Verbindung mit einem Gemisch aus Fibrinogen und Haptoglobin und umschließende Umsetzung des Reaktionsgemisches mit Thrombin, um den Fibrinogenrest in einen Fibrinrest umzuwandeln;

b) Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin unter Einwirkung von Thrombin und anschließend Umsetzung eines Gemisches aus dem erhaltenen Fibrin und Haptoglobin mit der bifunktionellen Verbindung;

c) Umsetzung von Fibrin mit einem Gemisch aus Haptoglobin und der bifunktionellen Verbindung oder

d) Umsetzung von Haptoglobin mit einem Gemisch -'' von Fibrin und der bifunktionellen Verbindung.

Vorzugsweise werden jedoch sämtliche vier Reaktionsteilnehmer, d. h. Fibrinogen, Haptoglobin, bifunktionelle Verbindung und Thrombin, gleichzeitig mitein- j<> ander umgesetzt.

Die funktioneilen Gruppen der bifunktionellen Verbindung vereinigen sich mit den funktionellen Gruppen der Aminosäuren im Fibrin und im Haptoglobin, beispielsweise mit Aminogruppen. Carboxylgroup- n pen und Phenolgruppen. Dadurch wird ein unlösliches, gebundenes Fibrin-Haptoglobin-Produkt gebildet.

Im allgemeinen werden folgende Reaktionsbedingungen angewendet: Das Gewichtsverhältnis von Fibrinogen zu Haptoglobin beträgt 0,5 bis 3,0 :1; die Menge an an zugesetztem Thrombin zur Umwandlung von Fibrino- ~r.*x ΐη C*krin kotröirt ICi kic 1 CtCi ΜΪt-l-Pinkoiton rtrrt 1 η

Fibrinogen; die bifunktionelle Verbindung wird vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 50 Millimol pro I Gramm Haptoglobin verwendet. Die Reaktionstempe- 4> ratur kann 0 bis 40⁰C für die Gesamtreaktion betragen, wobei für die Fixierung bzw. Vernetzung eine Temperatur von 0 bis 1O⁰C und insbesondere von 0 bis 5°C und für die Umwandlung des Fibrins eine Temperatur von 20 bis 40⁰C und insbesondere von 28 5< > bis 32°C bevoi^ugt ist; der pH-Bereich des Reaktionsgemisches liegt vorzugsweise in der Nähe des Neutralpunkts, d. h. bei pH-Werten von 6 bis 8; als Reaktionsmedium wird vorzugsweise eine physiologische Kochsalzlösung oder ein 0,1-m-Phosphatpuffer verwendet; die Reaktionszeit beträgt etwa 30 Minuten bis etwa 3 Stunden. In den meisten Fällen genügt eine Reaktionszeit von 2 Stunden, um die Reaktion zu Ende zu führen.

Das einfache Einbetten von Haptoglobin in Fibrin, das eine weitere Ausführungsform zur Herstellung des erfindungsgemäßen unlöslich gemachten Haptoglobins darstellt kann durchgeführt werden, indem man Fibrinogen und Haptoglobin in einem wäßrigen Medium vermischt und das erhaltene Gemisch mit b5 Thrombin versetzt, um das Fibrinogen in Fibrin zu verwandeln. Die Menge der verwendeten Ausgangsmaterialien und die Reaktionsbedingungen entsprechen dabei etwa den vorgenannten Angaben.

Das auf diese Weise erhaltene unlöslich gemachte Haptoglobinpräparat, insbesondere das durch Vernetzung unlöslich gemachte Präparat, ist von großem praktischen Wert im Hinblick auf die Menge des fixierten Hp, die Hb-Bindungskapazität, die physikalische bzw. mechanische Festigkeit und die Wiederverwendbarkeit, wie aus den Versuchsbeispielen 1 bis 3 hervorgeht. Beim Vergleich der Ergebnisse dieser Versuchsbeispiele untereinander läßt sich feststellen, daß die erfindungsgemäß hergestellten Haptoglobinpräparate im Vergleich zu herkömmlichen Präparaten etwa die 2- bis lOfache Menge an fixiertem Haptoglobin enthalten, eine etwa 2- bis 9fache größere Hb-Bindungskapazität und eine 2- bis öfache höhere physikalische Festigkeit aufweisen und etwa 3- bis 7mal so viel Hb binden, wenn sie wiederholt verwendet werden. Die Menge an fixiertem Hp beträgt etwa 100 bis 600 mg/g, bezogen auf das Trockengewicht, und die Hb-Bindungskapazität etwa 20 bis 115 mg Hb/g, bezogen auf das Trockengewicht.

Wenn die erfindungsgemäßen Haptoglobinpräparate einem extrakorporalem Kreislaufsystem als Filterbett in Form eines Granulats einverleibt werden, wodurch vermieden werden soll, daß das Präparat durch das strömende Blut wegtransportiert wird, hat man ein wertvolles Hilfsmittel zur Propylaxe und Therapie von hämivytischen Nierenstörungen, die durch kontinuierliche Verwendung des extrakorporalen Kreislaufsystems verursacht werden, zur Verfügung. Die Mindestkorngröße beträgt in diesem Fall etwa 40 Mikron, vorzugsweise 50 bis 150 Mikron. Bei geringeren Korngrößen wird Hämoglobin wirksamer gebunden.

Das erfindungsgemäße Präparat läßt sich in seiner physikalischen Festigkeit und der Hb-Bindungskapazität weiter verbessern, wenn man die Oberfläche des Fibrinogens dadurch vergrößert, daß man es in die Form einer auf einen Hilfsträger aufgebrachten Membran bringt. Als entsprechende Hilfsträger kommen wärmebeständige Fasern in Form von Fäden, Folien oder Netzen in Frage. Als wärmebeständige

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nach dem beabsichtigten Verwendungszweck des Haptoglobinpräparats verwendet werden. Beispiele für entsprechende Fasern sind Fasern aus Polyolefinen, Acrylnitril-Polymerisaten, Polyestern, Polyacetaten und Vinylalkohol-Polymerisaten.

Die auf einen Hilfsträger aufgebrachten unlöslich gemachten Haptoglobinpräparate werden zweckmäßig so hergestellt, daß man entweder Fibrinogen, das in Form einer Membran auf einen Hilfsträger autgebracht ist mit Thrombin unlöslich macht und anschließend die unlöslich gemachte Fibrinmembran, Haptoglobin, die bifunktionelle Verbindung und den Hilfsträger gleichzeitig miteinander umsetzt oder daß man direkt ein Gemisch aus Fibrinogen, Haptoglobin, Thrombin und der bifunktionellen Verbindung in Gegenwart eines Hilfsträgers gleichzeitig miteinander umsetzt Die bifunktionelle Verbindung reagiert auch mit den aktiven Gruppen des Hilfsträger, so daß sich aktives, unlöslich gemachtes Haptoglobin mit hoher physikalischer Festigkeit ergibt

Da das erfindungsgemäße Haptoglobinpräparat sich mit in wäßrigem Medium freigesetztem Hämoglobin verbindet ist es nicht nur zur Entfernung von Hämoglobin aus einem extrakorporalem Zirkulationssystem, sondern auch für die allgemeine Blutanalyse wertvoll. Ferner eignet es sich auch aufgrund seiner

Kombinationsselektivität zur Durchführung von Plasmafraktionierungen und zur Wiedergewinnung von Hämoglobin.

In den nachstehenden Beispielen werden die Mengen an unlöslich gemachtem Haptoglobin aus den Mengen an nicht fixiertem Haptoglobin, das aus den Waschflüssigkeiten nach der Fixierung des Haptoglobins an Fibrin wiedergewonnen wird, mit Hilfe der radialen Immundiffusion (vgl. G. M a η c i η i, A. O. C a r b ο η ar a und T. F. Heremans, Immunochem., Bd. 2 [1965], S. 235) berechnet. Sofern nichts arideres angegeben ist, werden die Hb-Bindungskapazitätcn erhalten, indem man eine Säule mit dem unlöslich gemachten Haptoglobin füllt, einen Überschuß an Hämoglobinlösung auf die Säule gibt, um das Hämoglobin mit dem Haptoglobin zu verbinden, sodann die Menge an restlichem Hämoglobin in der Lösung nach deim Cyanmethämoglobin-Verfahren (vgl. E. J. Kamp c n, Clin. Chim. Acta., Bd. 6 [iybij, S. 53») bestimmt und die ivienge an gebundenem Hämoglobin berechnet.

Die Figuren erläutern eine Vorrichtung, die Erfindungsgemäß eingesetzt wird sowie die Ergebnisse von Vergleichsversuchen, die mit erfindungsgemäß unlöslich gemachtem Haptoglobin, herkömmlichem unlöslich gemachtem Haptoglobin und Haptoglobin, das nach dem bekannten Enzym-Immobilisierungsverfahren unlöslich gemacht worden ist, durchgeführt worden sind.

F i g. 1 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Kreislaufi'ührung von Flüssigkeit, die zur Messung der physikalischen Stärke des unlöslich gemachten Haptoglobins verwendet wird; in

F i g. 2 sind die Ergebnisse dieser Messungen wiedergegeben. Entsprechende Erklärungen bezüglich der Vorrichtung und der Untersuchungsergebnisse sind im Vergleichsbeispiel 2 enthalten;

F i g. 3 zeigt die Ergebnisse von Regenerationsversuchen mit unlöslich gemachtem Haptoglobin. Dieser Versuch ist im Versi-chsbeispiel 3 erläutert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

beispie! 1

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versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 0 bis 5°C gerührt. Nach Zugabe von 200 ml Thrombin mit 10 NIH-Einheiten/ml wird das Gemisch 2 Stunden bei 30°C stehengelassen. Die erhaltene Fibrinmasse wird -, gewaschen und lyophilisiert Die erhaltenen Teilchen werden auf eine einheitliche Korngröße (50 bis 150 μ) ausgesiebt. Nach dem Waschen und Trocknen erhält man 52 g eines fixierten Haptoglobinpräparats. Der Gehalt an fixiertem Haptoglobin beträgt etwa in 384 mg/g, bezogen auf das Trockengewicht, und die Hb-Bindungskapazität etwa 115 mg Hb/g, bezogen auf das Trockengewicht. Es tritt kein merklicher Unterschied im Gehalt an fixiertem Haptoglobin n.'ch dem ersten und zweiten Waschen ein.

Beispiel 3

Ein Stück einfache Nylongaze mit einer lichten Maschenweite von etwa 149 μ (100 mesh ASTM) der Abmessungen i 65 χ 200 mm wird an beiden Enden mit

2(i einem Draht aus korrosionsbeständigem Stahl verschweißt und zu einer Spirale eingerollt. Die spiralenförmige Nylongaze wird in eine Glassäule mit einem Fassungsvermögen von 90 ml (28 mm Innendurchmesser und 145 mm Höhe) gebracht und mit einer

r> ausreichenden Menge einer Thrombinlösung mit 20 NIH-Einheiten/ml benetzt Nach dem Entfernen der überschüssigen Thrombinlösung wird ein Gemisch aus 20 ml einer 2prozentigen (Gewicht/Volumen) Lösung von gereinigtem menschlichem Fibrinogen (gelöst in

jo physiologischer Kochsalzlösung), 200 mg gereinigtem menschlichem Haptoglobin und 5 mMol Glutardialdehyd rasch auf die Säule gegeben.

Die Temperatur der Fixierungsvorrichtung und der Reaktionsflüssigkeit wird während des vorstehend j beschriebenen Verfahrens auf 5°C eingestellt. Nachdem sich die gemischte Lösung genügend über die Nylongaze verteilt hat, wird die überschüssige Lösung entfernt. Sodann rotiert man die Säule 2 Stunden bei 30⁰C, um das gebildete Fibrin auf der Nylongaze

4(1 abzuscheiden. Anschließend läßt man das Fibr'n genügend schrumpfen, indem man es etwa 15 Stunden

Lösung (pH-Wert 7, 0,1 m Phosphatpuffer) von gereinigtem Fibrinogen aus menschlichem Plasma wird mit 20 g gereinigtem Haptoglobin aus menschlichem Plasma und anschließend mit 200 ml Thrombin mit 10 NIH-Einheiten/ml versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 30^cC stehengelassen, um für eine ausreichende Koagulation des Fibrins zu sorgen. Nach dem Waschen wird die Fibrinmasse lyophilisiert. Man gewinnt ein Granulat mit gleichmäßigen Teilchen (50 bis 150 μ). Das Granulat wird 2mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Man erhält 38 g eines fixierten Haptoglobinpräparats. Beim ersten Waschen beträgt der Gehalt an fixiertem Haptoglobin 390 mg/g, bezogen auf das Trockengewicht Beim zweiten Waschen beträgt dieser Wert 100 mg/g, bezogen auf das Trockengewicht, und der Wert für die Hb-Bindungskapazität liegt bei etwa 20 mg Hb/g, bezogen auf das Trockengewicht

Beispiel 2

2 Liter einer 2,0prozentigen (Gewicht/Volumen) Lösung (pH-Wert 7, 0,1 m Phosphatpuffer) von gereinigtem menschlichem Fibrinogen werden mit 20 g gereinigtem menschlichem Haptoglobin und anschließend unter Rühren mit Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration dieser Verbindung von 10 millimolar physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.

Das auf diese Weise erhaltene fixierte Haptoglobin weist einen Gehalt an fixiertem Haptoglobin von 180 mg/fixierte Säule und eine Hb-Bindungskapazität von 65 mg/fixierte Säule auf.

Beispiel 4

Man verfährt wie in Beispiel 3, mit der Abänderung, daß man anstelle von Glutardialdehyd 10 mMol Carbodiimid verwendet Die Ergebnisse unterscheiden sich nicht merklich von den Ergebnissen von Beispiel 3. Der Gehalt an fixiertem Haptoglobin beträgt 175 mg/fixierte Säule und die Hb-Bindungskapazität 62 mg Hb/fixierte Säule.

Versuchsbeispiel 1

Die gemäß den Beispielen 1 und 2 erhaltenen fixierten Haptoglobinpräparate sowie herkömmliche Präparate, die an mit aktivem Ester copolymerisiertem Polyacrylamidgel fixiertes Haptoglobin (PAE-Hp) und an Sepharose (Agarose der Firma Pharmacia Co, Ltd, Schweden) fixiertes Haptoglobin (S-Hp) enthalten, werden in bezug auf ihren Gehalt an fixiertem Hp und ihre Hb-Bindungskapazität miteinander verglichen. Das PAE-Hp wird hergestellt, indem man gereinigtes menschliches Haptoglobin mit mit einem aktiven Ester

copolymerisierten Polyacrylamidgel umsetzt (vgl. S c h η a a r und L e e, Biochem., Bd. 14 [1975], S. 1535). Das S-Hp wird gemäß dem Verfahren von Klein und

10

M i h a e s c o, a.a.O., hergestellt. Als Haptoglobin wird ein gereinigtes humanes Haptoglobinpräparat in einer Menge von 20 g verwendet.

	Gehalt an fixiertem Hp	H b-Bindungskapazität
	(mg/g, bezogen	(mg Hb/g, bezogen
	auf das Trocken	auf das Trocken
	gewicht)	gewicht)
Unlöslich gemachtes Hp von Beispiel 1	IuO	20
(in Fibrin eingebettet)
Unlöslich gemachtes Hp von Beispiel 2	384	115
(Fibrin-Olutaraldehyd-Vernetzung)
S-Hp	76	14
PAE-Hp	60	13

Versuchsbeispiel 2

Mit Ausnahme des Präparats von Beispiel 1 werden die in Versuchsbeispiel 1 eingesetzten, unlöslich gemachten Haptoglobinpräparate in bezug auf ihre physikalische Beständigkeit gegen einen durch den Flüssigkeitsstrom verursachten Zerfall untersucht.

Der Versuch wird jeweils an 30 ml eines unlöslich gemachten Haptoglobinpräparats, das in einen Barrier-Filter (Johnson & Johnson Co.) von 50 ml Fassungsvermögen gefüllt ist, durchgeführt Der Filter befindet sich in der in F i g. 1 abgebildeten Kreislaufvorrichtung. Diese Kreislaufvorrichtung besteht aus einer Kammer C, die den Barrier-Filter F für extrakorporales Blut enthält, einer mit der Kammer Cverbundenen endlosen Leitung L und der in der Leitung L angeordneten Pumpe P. 1 Liter physiologische Kochsalzlösung wird mittels der Pumpe P in der Leitung L mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 500 ml/0,50 cm³; min im Kreislauf geführt, Proben der zirkulierenden Kochsalzlösung werden in stündlichen Abständen während 5

physikalische Festigkeit des gemäß Beispiel 2 erhaltenen unlöslich gemachten Haptoglobinpräparats die Festigkeit herkömmlicher Präparate um den Faktor etwa 2 bis 7 übertrifft.

Versuchsbeispiel 3

Die Wiederverwendbarkeit der in Versuchsbeispiel 1 verwendeten Haptoglobinpräparate wird untersucht. Dieser Versuch wird auf folgende Weise durchgeführt:

5 ml des unlöslich gemachten Haptoglobins werden mit einer ausreichenden Menge Hämoglobin vereinigt. Das mit Hämoglobin beladene Präparat wird mit 30 ml einer wäßrigen 5 m MgCb-Lösung (pH-Wert etwa 4,3) vermischt, um die Hp-Hb-Bindung vollständig zu spalten. Die Menge des in der Lösung freigesetzten Hb wird bestimmt. Daraus wird die Hb-Bindungskapazität des unlöslich gemachten Haptoglobins berechnet. Das beim Freisetzen von Hämoglobin regenerierte Haptoglobin wird wieder mii einer ausreichenden Menge Hämoglobin vereinigt und anschließend auf die

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unlöslich gemachten Haptoglobinpräparats, die aufgrund von Zerfall in der Probe auftreten, werden mit Hilfe eines Hämatometers mit einer Vergrößerung von 50 bestimmt Der Porendurchmesser des Barrier-Filters für extrakorporales Blut beträgt 20 bis 40 μ, während das unlöslich gemachte Haptoglobinpräparat auf eine Korngröße von 50 bis 150 μ ausgesiebt ist Der zeitliche Verlauf der Anzahl der Haptoglobinteilchen ergibt sich aus Fig.2, wobei die Ordinate die Anzahl der Hp-Teilchen, die in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung auftreten, und die Abszisse die Zeit der Kreislaufführung angibt Aus F i g. 2 ergibt sich, daß die freizusetzen. Die vorstehend geschilderte Behandlung wird wiederholt Die Änderung der Hb-Bindungskapa zität bei diesen wiederholten Behandlungen wird untersucht.

Die Ergebnisse sind in Fig.3 wiedergegeben. Die Ordinate gibt die restliche Hb-Bindungskapazität (mg Hb/g, bezogen auf das Trockengewicht) und die Ordinate die Anzahl der Regenerationen an. Aus F i g. 3 ergibt sich, daß das gemäß Beispiel 2 erhaltene Haptoglobinpräparat nach einer 4maligen Regeneration eine etwa 4- bis 8fach größere Hb-Bindungskapazität als herkömmliche Präparate aufweist

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Wasserunlösliches Haptoglobinpräparat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an durch Fixierung an Fibrin unlöslich gemachten aktivem Haptoglobin.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 100 bis 600 mg Fixiertes Haptoglobin pro 1 g enthält

3. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Hämoglobinbindungskapazität von etwa 20 bis etwa 115 mg Hb/g aufweist

4. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß es frei von infektiösen Hepatitis-Virus- Bestandteilen ist

5. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das an Fibrin fixierte aktive Haptoglobin eine Korngröße von 50 bis 150 μ aufweist.

6. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Fibrin und das aktive Hapioglobin menschlichen Ursprungs sind.

7. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das aktive Haptoglobin mittels einer bifunktionellen Verbindung an das Fibrin fixiert worden ist

8. Präparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet daß als bifunktionelle Verbindung Glutardialdehyd oder Carbodiimid verwendet worden ist

9. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet da£ das fixierte aktive Haptoglobin auf einen Träger aufgebracht ist

10. Präparat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet daß der Träger avs natürlichen oder synthetischen Fasern besteht

11. Präparat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet daß die synthetischen Fasern Polyolefine, Acrylnitril-Polymerisate, Polyester, Polyacetate oder Vinylalkohol-Polymerisate sind.

12. Verfahren zur Herstellung des wasserunlöslichen Haptoglobinpräparats, dadurch gekennzeichnet daß man Fibrinogen, Haptoglobin, Thrombin und eine bifunktionelie Verbindung miteinander zur Reaktion bringt

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet daß man Fibrinogen und Haptoglobin menschlichen Ursprungs verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als bifunktionelle Verbindung Glutardialdehyd oder Carbodiimid verwendet

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet daß man die Reaktion in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 6 bis 8 durchführt.

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch « gekennzeichnet, daß man die Reaktion unter Anwendung eines Reaktantenverhältnisses von 1 g Haptoglobin, etwa 04 bis etwa 3,0 g Fibrinogen, 1 bis 50 Miliimol einer bifunktionellen Verbindung und 15 bis 300 NIH-Einheiten Thrombin durchführt. <>o

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet daß man die Reaktion bei Temperaturen von 0 bis 40⁰C durchführt.

18. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion stufenweise h~> durchführt, wobei zunächst die bifunktionelle Verbindung mit einem Gemisch aus Fibrinogen und Haptoglobin und anschließend das erhaltene Reak

tionsgemisch mit Thrombin umgesetzt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion stufenweise durchführt wobei zunächst Thrombin mit Fibrinogen und anschließend das erhaltene Fibrin und Haptoglobin mit der bifunktionellen Verbindung umgesetzt werden.

20. Verfahren nach Anspruch i8, dadurch gekennzeichnet daß man die Reaktion mit Thrombin bei Temperaturen von 20 bis 40°C durchführt

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet daß man die Reaktion mit Thrombin bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C durchführt

22. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet daß man die Reaktion mit der bifunktionellen Verbindung bei Temperaturen von 0 bis 10³C durchführt

23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet daß man die Reaktion mit der bifunktionellen Verbindung bei Temperaturen von 0 bis 10° C durchführt

24. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet daß man die Reaktion in Gegenwart eines Hilfsträger durchführt

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet daß man als Hilfsträger natürliche oder synthetische Fasern verwendet

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet daß man synthetische Fasern aus einem Polyolefin, Acrylnitril-Polymerisat Polyester, Polyacetat oder Vinylalkohol-Polymerisat verwendet