CH638401A5 - Process for the preparation of haemoglobin preparations having an increased oxygen delivery - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparaten mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten und Hämoglobinlösungen. The invention relates to a method for producing hemoglobin preparations suitable for intravenous injection with increased oxygen release compared to erythrocytes and hemoglobin solutions.
Der Sauerstoff-Halbsättigungsdruck des Hämoglobins (Hb), P50-Wert genannt, beträgt im intakten Erythrozyten bekanntlich 36 mbar. Neben dem intraerythrozytären pH-Wert von 7,25 ist für jenes Mass der Sauerstoff-Abgabebe-reitschaft vor allem der Gehalt an 2,3-Diphosphoglycerat (DPG) verantwortlich. Für alle Infusionspräparate auf der Basis von frei gelöstem Hämoglobin, beziehungsweise Derivaten davon, ist der pH-Wert des Blutplasmas von etwa 7,4 massgebend, da sie zwangsläufig unter diesen Bedingungen den Sauerstoff transportieren müssen. Bereits diese Tatsache führt zu einer Linksverschiebung der Sauerstoffverbindungskurve entsprechend einer Erniedrigung des P50-Wertes auf günstigenfalls etwa 32 mbar. Ist eine solche Hämoglobinlösung aber erst infundiert, dann wird sofort im Dissoziationsgleichgewicht ungebundenes 2,3-Diphosphoglycerat aufgrund seiner geringen Molekülgrösse durch die Nieren ausgeschieden. Das DPG ist am Hb salzartig gebunden und dissoziiert entsprechend rasch nach, so dass in kurzer Zeit alles in der Blutbahn frei gelöste Hb von DPG entblösst ist. Infolgedessen sinkt der P50-Wert auf 20-22 mbar ab. Ein höherer P50-Wert weist auf eine erhöhte Sauerstoffabgabebereitschaft eines Präparates hin. The oxygen semi-saturation pressure of hemoglobin (Hb), called the P50 value, is known to be 36 mbar in intact erythrocytes. In addition to the intraerythrocytic pH value of 7.25, the level of 2,3-diphosphoglycerate (DPG) is responsible for the level of willingness to release oxygen. For all infusion preparations based on freely dissolved hemoglobin, or derivatives thereof, the pH value of the blood plasma of about 7.4 is decisive, since they must inevitably transport the oxygen under these conditions. This fact alone leads to a left shift of the oxygen connection curve corresponding to a reduction in the P50 value to about 32 mbar in the best case. However, once such a hemoglobin solution has been infused, unbound 2,3-diphosphoglycerate is immediately excreted by the kidneys in the dissociation equilibrium due to its small molecular size. The DPG is bound to the Hb in a salt-like manner and rapidly dissociates accordingly, so that in a short time everything released in the bloodstream is exposed to DPG. As a result, the P50 value drops to 20-22 mbar. A higher P50 value indicates an increased willingness to give oxygen of a preparation.
Bisher wurde noch kein Hämoglobinpräparat gefunden, das leicht Sauerstoff für eine Sauerstoffversorgung des Gewebes abgibt. Es ist bekannt, dass Pyridoxal-5-phosphat (Fig. 1) bevorzugt auch an der gleichen Stelle der Hb-Mole-kel gebunden wird wie DPG, überraschenderweise ist es jedoch erheblich fester als Diphosphoglycerat an das Hämoglobin gebunden. Das von R.E. Benesch, R. Benesch, A. 40 Benk, R. Renthal und B. A. Bray in Proc. I. Interamer. Symp. Haemoglobins, Caracas (1969), «Genetical, func-tional and physical studies of hemoglobins», pgs. 134-142 (Karger, Basel 1971) beschriebene Modellpräparat aus Hämoglobin und Pyridoxal-phosphat lässt sich nicht als In-45 fusionslösung verwenden, da es pyrogene Reaktionen auslöst. So far, no hemoglobin preparation has been found that easily releases oxygen for an oxygen supply to the tissue. It is known that pyridoxal-5-phosphate (FIG. 1) is preferably also bound at the same point in the Hb molecule as DPG, but surprisingly it is bound to the hemoglobin considerably more strongly than diphosphoglycerate. The R.E. Benesch, R. Benesch, A. 40 Benk, R. Renthal and B. A. Bray in Proc. I. Interamer. Symp. Haemoglobins, Caracas (1969), "Genetical, functional and physical studies of hemoglobins", pgs. Model preparation 134-142 (Karger, Basel 1971) described from hemoglobin and pyridoxal phosphate cannot be used as an infusion solution because it triggers pyrogenic reactions.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass es möglich ist, ein für die intravenöse Injektion geeignetes Hämoglobinpräparat mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber so Erythrozyten herzustellen, das aus einem Kondensationsprodukt von Hämoglobin und Pyridoxalphosphat besteht und keine pyrogene Reaktion bewirkt. Ein'solches Präparat kann wegen seiner günstigen Sauerstoff-Affinität therapeutisch intravenös verwendet werden. In diesem Kondensa-55 tionsprodukt liegt ein Hämoglobintetrameres mit einer statistischen Verteilung von Pyridoxalphosphat am Hämoglobin vor. Das Präparat hat selbst bei einem pH-Wert von 7,4 einen PSo-Wert von 42 mbar. Die Verweilzeit eines solchen Präparates in der Blutbahn beträgt etwa 2 Stunden. It has now surprisingly been found that it is possible to produce a hemoglobin preparation suitable for intravenous injection with increased oxygen release compared to erythrocytes, which consists of a condensation product of hemoglobin and pyridoxal phosphate and does not cause a pyrogenic reaction. Such a preparation can be used therapeutically intravenously because of its favorable oxygen affinity. In this condensation product there is a hemoglobin tetramer with a statistical distribution of pyridoxal phosphate on the hemoglobin. The preparation has a PSo value of 42 mbar even at a pH of 7.4. The duration of such a preparation in the bloodstream is about 2 hours.
60 60
- Derartige pyrogenfreie und im Blutkreislauf als hervorragende Sauerstoffdonatoren wirksame, als Infusionslösungen (Hb/PP) verwendbare Hämoglobinpräparate gewinnt man, wenn man von dem Verfahren der Hämoglobingewin-65 nung von R.E. Benesch und R. Benesch [Proc. of the National Academy of Science USA 59, 526-532 (1968)] abweicht und dabei erfindungsgemäss vorgeht, wie im Patentanspruch 1 definiert. - Such pyrogen-free hemoglobin preparations, which are effective in the blood circulation as excellent oxygen donors and can be used as infusion solutions (Hb / PP), can be obtained by using the hemoglobin recovery method from R.E. Benesch and R. Benesch [Proc. of the National Academy of Science USA 59, 526-532 (1968)] deviates and thereby proceeds according to the invention as defined in claim 1.
3 3rd
638 401 638 401
Durch das im Patentanspruch 2 definierte Verfahren sind Präparate mit einer Verweilzeit im Blut von 4 bis zu 9 h erhältlich. The method defined in claim 2 provides preparations with a residence time in the blood of 4 to 9 hours.
In der Sterilfiltration können direkt Infusionseinheiten von 300 ml oder 500 ml hergestellt werden. 300 ml or 500 ml infusion units can be produced directly in sterile filtration.
Durch den Zusatz von IN Natronlauge und von Gluco-semonohydrat werden in den erfindungsgemässen Verfahren chemische Vorgänge bewirkt, durch welche die Sauerstoffverbindungseigenschaften von Hämoglobin verändert und reduktive Enzyme unwirksam gemacht werden. By adding IN sodium hydroxide solution and glucosemonohydrate, chemical processes are brought about in the processes according to the invention, by means of which the oxygen-binding properties of hemoglobin are changed and reductive enzymes are rendered ineffective.
Das Säulen-Chromatogramm solcher Präparate («Se-phadex» G-150,90 x 1,5 cm, 0,3 ml Auftragsvolumen) zeigt Fig. 2 der Zeichnungen. The column chromatogram of such preparations (“Se-phadex” G-150.90 x 1.5 cm, 0.3 ml order volume) is shown in FIG. 2 of the drawings.
Die P5 „-Werte des erfmdungsgemäss hergestellten Präparates bei einem pH-Wert von 7,45 liegen zwischen 40 und 53,3 mbar und übertreffen damit den p50-Wert des Hämoglobins in den Erythrozyten beträchtlich. The P5 "values of the preparation produced according to the invention at a pH value of 7.45 are between 40 and 53.3 mbar and thus considerably exceed the p50 value of the hemoglobin in the erythrocytes.
Es wurde weiter gefunden, dass man durch weitere Modifizierung solcher, durch Bindung von Pyridoxalphosphat an Hämoglobin zur verbesserten Sauerstoffabgabe an das Gewebe befähigte Moleküle, deren Verweilzeit im Blut etwa 2 Stunden beträgt, erreicht, dass diese bei Erhaltung ihrer therapeutischen Funktion mindestens doppelt so lange in der Blutbahn voll wirksam bleiben. Dafür wird das Verfahren zweckmässig wie folgt durchgeführt: It was further found that by further modification of those molecules which are capable of improving the oxygen release to the tissue by binding pyridoxal phosphate to hemoglobin and which have a residence time in the blood of about 2 hours, they are achieved in at least twice as long while maintaining their therapeutic function remain fully effective in the bloodstream. For this purpose, the procedure is expediently carried out as follows:
Menschliche Erythrozyten werden mit schwach alkalischer Waschlösung wenigstens 4mal behandelt, dann hämolysiert und mit einem Kationenaustauscher in H+-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0-5,5 abgesunken ist, dann vom Harz und ausgefällter Stromamasse durch Kühlzentrifugation befreit, auf eine gewünschte Hämoglobinkonzentration von 5-9% mit Wasser verdünnt, ein pH-Wert von 7-9 mit IN Natronlauge eingestellt, dann unter einem Vakuum von 26,6 mbar 10 Minuten lang, danach unter Einleitung von Stickstoff, gerührt, bis der Sauerstoff im Gefäss durch reinen Stickstoff verdrängt ist, 0,25-1,25 g Pyridoxal-5-phosphat pro Liter 5-9%ige Hämoglobinlösung zugegeben und unter Stickstoff 15 Minuten bis 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur weitergerührt und anschliessend mit der 5- bis lOfachen molaren Menge Natriumborhydrid gegenüber dem Pyridoxalphosphat weitere 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur verrührt, danach wieder evakuiert, ein Dialdehyd der Formel OCH-(CH2)n-CHO, worin n 1-6 bedeutet, in 9facher molarer Menge zum Hämoglobin zugegeben, 45 Minuten lang unter Stickstoff gerührt, unvernetztes Hämoglobin dann durch Aussalzen oder Ultrafiltration abgetrennt, das angereicherte vernetzte Präparat mit IN Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 bei 20 °C eingestellt, durch entsprechende Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemonohydrat pro Liter zugefügt und sterilfiltriert. Human erythrocytes are treated with weakly alkaline wash solution at least 4 times, then hemolyzed and treated with a cation exchanger in H + form until the pH has dropped to 5.0-5.5, then freed from the resin and precipitated stromal mass by cooling centrifugation a desired hemoglobin concentration of 5-9% diluted with water, a pH value of 7-9 adjusted with 1N sodium hydroxide solution, then under a vacuum of 26.6 mbar for 10 minutes, then with introduction of nitrogen, stirred until the oxygen in The vessel is displaced by pure nitrogen, 0.25-1.25 g of pyridoxal-5-phosphate per liter of 5-9% hemoglobin solution is added and stirring is continued under nitrogen for 15 minutes to 2 hours at room temperature and then with 5 to 10 times the molar Amount of sodium borohydride compared to the pyridoxal phosphate stirred for a further 20 minutes at room temperature, then evacuated again, a dialdehyde of the formula OCH- (CH2) n-CHO, where n is 1-6, i n 9 times the molar amount added to the hemoglobin, stirred for 45 minutes under nitrogen, uncrosslinked hemoglobin then separated by salting out or ultrafiltration, the enriched crosslinked preparation adjusted to a pH of 7.6 at 20 ° C. with IN sodium hydroxide solution, using appropriate salt additives Blood plasma analog concentrations supplemented, 22 g glucose monohydrate added per liter and sterile filtered.
Für die Abreicherung an unvernetztem Hämoglobin gibt es dabei z.B. zwei Möglichkeiten: For the depletion of uncrosslinked hemoglobin there are e.g. two possibilities:
1. Man rührt allmählich das 0,8- bis l,0fache Volumen der Hämoglobinbereitung an 4molarer Ammoniumsulfatlösung zur Aussalzung des vernetzten Hämoglobins ein. Der abzentrifugierte Niederschlag wird in Wasser gelöst und gegen eine 0,5%ige Kochsalzlösung dialysiert zur Entfernung des Ammoniumsulfats und aller überschüssigen Hilfschemikalien. Die letzten Spuren werden durch einen Mischbettaustauscher entfernt. 1. The 0.8 to 1.0 volume of the hemoglobin preparation of 4 molar ammonium sulfate solution is gradually stirred in to salt out the crosslinked hemoglobin. The centrifuged precipitate is dissolved in water and dialyzed against a 0.5% saline solution to remove the ammonium sulfate and all excess auxiliary chemicals. The last traces are removed by a mixed bed exchanger.
2. Man durchströmt eine Hohlfaser-Patrone Hl P 100 (Hersteller: Firma Amicon Corporation, 21 Hostwell Avenue. Lexington, Massachusetts, USA) mit der Hämoglobin-Bereitung. Durch Ultrafiltration wird unvernetztes Hämoglobin bevorzugt abgepresst und dabei im Unfiltrat abgereichert. 2. The hemoglobin preparation is passed through a hollow fiber cartridge Hl P 100 (manufacturer: Amicon Corporation, 21 Hostwell Avenue. Lexington, Massachusetts, USA). Ultrafiltration preferentially squeezes out uncrosslinked hemoglobin and depletes it in the unfiltrate.
Bei diesem Verfahren lässt man Pyridoxalphosphat zunächst auf Hämoglobin einwirken und reduziert anschliessend durch naszierenden Wasserstoff aus Natriumborhydrid die gebildeten Azomethin-(Schiff-Basen-) zu sekundären Amin-Bindungen. In this process, pyridoxal phosphate is first allowed to act on hemoglobin and then the nascent hydrogen from sodium borohydride reduces the azomethine (Schiff base) formed to secondary amine bonds.
NaBH NaBH
(Hb)-N = CH-(Pyr) % (Hb)-NH-CH2-(Pyr) (Hb) -N = CH- (Pyr)% (Hb) -NH-CH2- (Pyr)
Anschliessend lässt man einen Dialdehyd der Formel A dialdehyde of the formula is then left
O=CH-(CH2)n-CH=O, n = 1-6 O = CH- (CH2) n-CH = O, n = 1-6
auf die Moleküle einwirken. Dadurch erreicht man eine Aneinanderkopplung der modifizierten Hämoglobin-Moleküle zu grösseren Gebilden. act on the molecules. As a result, the modified hemoglobin molecules are coupled together to form larger structures.
Geeignet für diese Behandlung sind Dialdehyde mit insbesondere geraden Kohlenstoffketten von 3-8 C-Atomen wie Malondialdehyd, Succindialdehyd, Glutardialdehyd, Adipindialdehyd, Suberaldehyd, die der Formel OCH-(CH2)n-CHO entsprechen, in der n einen Wert von 1-6 bedeutet. Suitable for this treatment are dialdehydes with in particular straight carbon chains of 3-8 carbon atoms, such as malondialdehyde, succindialdehyde, glutardialdehyde, adipindialdehyde, suberaldehyde, which correspond to the formula OCH- (CH2) n-CHO, in which n has a value of 1-6 means.
Dieses Verfahrensprodukt (Hb/PP)m gemäss Fig. 3 der Zeichnung besteht aus This process product (Hb / PP) m according to Fig. 3 of the drawing consists of
A = hochvernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (m >3) B = oligomervernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (m = 2-3) A = highly cross-linked pyridoxalized hemoglobin (m> 3) B = oligomer cross-linked pyridoxalized hemoglobin (m = 2-3)
C = unvernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (m = 1) C = uncrosslinked pyridoxalized hemoglobin (m = 1)
Als Ausgangsmaterial können auch bereits abgelaufene Blutbank-Erythrozyten für beide Verfahrensmodifikationen verwendet werden. Expired blood bank erythrocytes can also be used as the starting material for both process modifications.
Ausser in einem einwandfreien Pyrogentest wurde das erfmdungsgemäss hergestellte Infusionspräparat aus Hb/PP an Ratten und Mäusen auf akute Toxizität geprüft. Dabei wurden noch 50 ml einer 8%igen Lösung pro kg Körpergewicht ohne abnormales Verhalten und ohne auffällige Symptome von den Ratten intravenös vertragen. Nachdem Mäuse eine intravenöse Dosis von 100 ml pro kg Körpergewicht noch überlebten, wurde gemäss Thaer: «Grundlagen der experimentellen Arzneimittelforschung» (1965) bestimmt, dass die In addition to a flawless pyrogen test, the infusion preparation made of Hb / PP according to the invention was tested for acute toxicity in rats and mice. The rats were tolerated intravenously with 50 ml of an 8% solution per kg body weight without abnormal behavior and without conspicuous symptoms. After mice still survived an intravenous dose of 100 ml per kg body weight, it was determined according to Thaer: "Fundamentals of experimental drug research" (1965) that the
LD50 mehr als 50 ml/kg Körpergewicht beträgt, LD50 is more than 50 ml / kg body weight,
und die Substanz mit dem Prädikat «relativ harmlos» einzustufen ist. and the substance is classified as “relatively harmless”.
Im Gegensatz zu dem Produkt von R. E. und R. Benesch konnte bei dem erfmdungsgemäss hergestellten Präparat aufgrund eines konstanten PS0-Wertes nachgewiesen werden, dass die Schiffsche-Basen-Bindung des Pyridoxal-phosphats an die Aminogruppe des N-terminalen Valins der ß-Kette des Hämoglobins gegen Dialysebehandlung in vitro resistent ist. Es wurde eine erschöpfende Dialyse gegen 0,9% Kochsalzlösung bei 10 °C durchgeführt. In contrast to the product from RE and R. Benesch, the preparation produced according to the invention was able to demonstrate, on the basis of a constant PS0 value, that the Schiff base binding of the pyridoxal phosphate to the amino group of the N-terminal valine of the β chain of the Hemoglobin is resistant to dialysis treatment in vitro. An exhaustive dialysis against 0.9% saline at 10 ° C was carried out.
Ergebnis Result
Präparat P50 (mbar) Preparation P50 (mbar)
vor Dialyse nach Dialyse before dialysis after dialysis
Hb/PP 731017 42,6 44 Hb / PP 731017 42.6 44
Hb/PP 731013 52 49,3 Hb / PP 731013 52 49.3
Vergleiche dazu Literatur-Zitat R.E. Benesch et al. 1971 Compare literature quotation R.E. Benesch et al. 1971
Die überlegene Wirksamkeit unter den physiologischen Bedingungen des Blutkreislaufes zeigt das Präparat Hb/PP auch im Tierversuch. Das Präparat gibt auch unter einem normalen venösen Sauerstoff-Partialdruck von 53,3 mbar bereits Sauerstoffmengen an das Gewebe ab, die frei gelöstes normales Hämoglobin erst unter pathologischen Verhältnis- The preparation Hb / PP also shows the superior effectiveness under the physiological conditions of the blood circulation in animal experiments. Even under a normal venous oxygen partial pressure of 53.3 mbar, the preparation already releases amounts of oxygen into the tissue, the released normal hemoglobin only under pathological conditions.
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
638401 638401
sen, d.h. wenn der venöse P02 auf etwa 26,6 mbar abgesunken ist (K. Messmer et al. in Vorbereitung), erreicht. sen, i.e. when the venous P02 has dropped to about 26.6 mbar (K. Messmer et al. in preparation).
Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert. In den Zeichnungen zeigt Fig. 1 die Strukturformel von Pyridoxal-5-phosphat, und Fig. 2-6 sind Chromatogramme von erfiridungsgemäss hergestellten Präparaten. The process according to the invention is further illustrated by the examples below. In the drawings, FIG. 1 shows the structural formula of pyridoxal-5-phosphate, and FIGS. 2-6 are chromatograms of preparations produced according to the invention.
Beispiel 1 example 1
Das Erythrozytensediment einer 4 Wochen gelagerten Blutkonserve (etwa 270 ml) wird 10 Minuten lang mit 1/3 seines Volumens einer l,6%igen Kochsalzlösung mit 1,2% ß-Propiolactongehalt verrührt. Die Erythrozyten werden bei 0 C abzentrifugiert und nach Absaugen des Uberstandes und der gebildeten Thrombozytenhaut noch 4mal mit dem 1- bis 2fachen Volumen folgender Lösungen auf der Kühlzentrifuge gewaschen: The erythrocyte sediment of a 4-week stored blood (about 270 ml) is stirred for 10 minutes with 1/3 of its volume of 1.6% saline with 1.2% β-propiolactone content. The erythrocytes are centrifuged off at 0 C and, after aspirating off the supernatant and the platelet skin formed, are washed 4 more times with the 1 to 2-fold volume of the following solutions on the cooling centrifuge:
1. 3,8% Natriumbicarbonat/Wasser 1. 3.8% sodium bicarbonate / water
2. 3,8% Natriumbicarbonat/Wasser 2. 3.8% sodium bicarbonate / water
3. 1:1-Mischung l,6%ige Kochsalz-/3,8%ige Bi-carbonatlösung 3. 1: 1 mixture 1.6% saline / 3.8% bicarbonate solution
4. l,6%ige Kochsalzlösung 4. 1.6% saline
Zur Hämolyse werden die gewaschenen Erythrozyten in die Menge aqua pro injectione eingerührt, die dem Erythro-zytenausgangsvolumen entspricht, und mit Kationenaustauschersuspension in der H+-Form - zum Beispiel «DOWEX» 50 WX 8 - versetzt, bis der pH-Wert auf 5 absinkt. Es folgt Abstumpfung auf einen pH-Wert von 5,5-5,7 mit IN Natronlauge und Abtrennung von Stroma und Harz durch Kühlzentrifugierung und Abgiessen. Mit aqua pro injectione wird der Überstand auf 8,6% Hämoglobin verdünnt, mit IN Natronlauge auf pH-Wert 7,5 eingestellt und pro Liter Lösung mit 3,6 g Natriumchlorid, 22 g Glukosemonohydrat, 0,29 g Kaliumchlorid, 0,23 g Calciumchlorid-dihydrat und 0,25 g Magnesiumsulfat-heptahydrat versetzt. For hemolysis, the washed erythrocytes are stirred into the amount of aqua pro injectione, which corresponds to the initial erythrocyte volume, and mixed with cation exchange suspension in the H + form - for example «DOWEX» 50 WX 8 - until the pH drops to 5. This is followed by dulling to a pH of 5.5-5.7 with 1N sodium hydroxide solution and separation of stroma and resin by cooling centrifugation and pouring off. The supernatant is diluted to 8.6% hemoglobin with aqua pro injectione, adjusted to pH 7.5 with IN sodium hydroxide solution and with 3.6 g of sodium chloride, 22 g of glucose monohydrate, 0.29 g of potassium chloride, 0.23 per liter of solution g of calcium chloride dihydrate and 0.25 g of magnesium sulfate heptahydrate were added.
Nach erneuter Kühlzentrifugation wird dekantiert und in geschlossenem Gefäss 10 Minuten lang unter einem Vakuum von 26,6 mbar gerührt. After cooling again by centrifugation, the mixture is decanted and stirred in a closed vessel for 10 minutes under a vacuum of 26.6 mbar.
Durchleiten von Reinstickstoffgas vertreibt den letzten Sauerstoff, so dass anschliessend das Hämoglobin überwiegend in der Desoxyform vorliegt. Diese wird mit 1,1g Pyridoxal-5-phosphat-monohydrat pro Liter Lösung (entspricht etwa 3,5 mol Pyridoxalphosphat pro 1 Mol Hb-Te-tramer) umgesetzt, indem 1 Stunde lang bei 20 °C unter Stickstoff gerührt wird, nach vorheriger Zugabe von 2,12 g Natriumbicarbonat pro Liter. Passing through pure nitrogen gas expels the last oxygen, so that the hemoglobin is then predominantly in the deoxy form. This is reacted with 1.1 g of pyridoxal-5-phosphate monohydrate per liter of solution (corresponds to approximately 3.5 mol of pyridoxal phosphate per 1 mol of Hb-tetramer) by stirring for 1 hour at 20 ° C. under nitrogen, according to the previous one Add 2.12 g sodium bicarbonate per liter.
Es folgt eine Endeinstellung mit IN Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 (bei 20 °C) und Sterilfiltration. Ausbeute: Etwa 400 ml Lösung 8%ig an Hb. This is followed by a final adjustment with IN sodium hydroxide solution to a pH of 7.6 (at 20 ° C) and sterile filtration. Yield: About 400 ml of 8% Hb solution.
Pso-Wert bei pH-Wert 7,45:42,6 mbar Pso value at pH 7.45: 42.6 mbar
Beispiel 2 Example 2
Die vereinigten Erythrozytensedimente sechs frischer Blutkonserven (etwa 1,51) werden gemäss Beispiel 1, jedoch 5 Minuten lang mit 2,0% ß-Propiolacton/1,6% Natriumchloridlösung behandelt. Die Hämolyse erfolgt mit dem doppelten Erythrozytenvolumen von etwa 3 Litern aqua pro injectione. The combined erythrocyte sediments of six fresh blood (about 1.51) are treated according to Example 1, but for 5 minutes with 2.0% β-propiolactone / 1.6% sodium chloride solution. Hemolysis is carried out with twice the erythrocyte volume of about 3 liters of aqua pro injectione.
Die pH-Einstellung mit IN Natronlauge vor dem Zusatz von - der Verdünnung angepasst - 0,82 g Pyridoxal-phos-phat-monohydrat pro Liter Lösung erfolgt in Abweichung von Beispiel 1 auf 9,0, und die Rührdauer unter Stickstoff beträgt 2 Stunden. The pH adjustment with IN sodium hydroxide solution before the addition of - adjusted to the dilution - 0.82 g of pyridoxal-phosphate monohydrate per liter of solution takes place in deviation from Example 1 to 9.0, and the stirring time under nitrogen is 2 hours.
Nach wiederum analoger Aufarbeitung resultieren After again processing analogously result
4 Liter einer Hb/PP-Lösung, 6%ig an Hb 4 liters of an Hb / PP solution, 6% Hb
Ps0-Wert: 42,6 mbar Ps0 value: 42.6 mbar
Beispiel 3 Example 3
Das Erythrozytensediment einer 10 Tage alten Blutkonserve wird ohne ß-Propiolacton-Vorbehandlung den 4 Waschvorgängen analog Beispiel 1 unterworfen. Die gewaschenen Erythrozyten werden aber in 450 ml aqua pro injectione hämolysiert (stärkere Verdünnung). Zur Reaktion mit 1,1g Pyridoxal-5-phosphat-monohydrat pro Liter Lösung (entsprechend 5 mol Pyridoxal-phosphat pro 1 mol Hb-Te-tramer) wird aber auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und anschüessend 2 Stunden lang unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt. The erythrocyte sediment of a 10-day-old blood preserve is subjected to the 4 washing operations analogous to Example 1 without β-propiolactone pretreatment. However, the washed erythrocytes are hemolyzed in 450 ml aqua pro injectione (greater dilution). For reaction with 1.1 g pyridoxal-5-phosphate monohydrate per liter of solution (corresponding to 5 mol pyridoxal phosphate per 1 mol Hb-tetramer), the pH is adjusted to 7.3 and then under for 2 hours Nitrogen stirred at room temperature.
Nach der üblichen Elektrolyt-Endeinstellung erhält man etwa 700 ml Hb/PP-Lösung mit einem Gehalt von 5,5% Hb. After the usual final electrolyte adjustment, about 700 ml of Hb / PP solution with a content of 5.5% Hb is obtained.
Pso-Wert: 52 mbar Pso value: 52 mbar
Beispiel 4 Example 4
Vereinigte Erythrozytensedimente von 25 abgelaufenen Blutkonserven (etwa 61) werden gemäss Beispiel 1, aber nur 5 Minuten lang mit der angegebenen ß-Propiolacton-/Koch-salzlösung gerührt. Abweichend von Beispiel 1 erfolgt ausserdem die pH-Einstellung auf einen Wert von 7,0 vor Zusatz des Pyridoxalphosphates. Combined erythrocyte sediments from 25 expired blood (approximately 61) are stirred according to Example 1, but only for 5 minutes with the specified β-propiolactone / common salt solution. In contrast to Example 1, the pH is also adjusted to a value of 7.0 before the pyridoxal phosphate is added.
Am Ende der analog Beispiel 1 durchgeführten Weiterverarbeitung werden 10,5 Liter eines Hb/PP-Präparates mit einem Hb-Gehalt von 8% gewonnen, das einen P50-Wert von 45,3 mbar hat. At the end of the further processing carried out analogously to Example 1, 10.5 liters of an Hb / PP preparation with an Hb content of 8%, which has a P50 value of 45.3 mbar, are obtained.
Beispiel 5 Example 5
100 ml 6%ige Hämoglobinlösung wurden durch Evakuieren auf 26,6 mbar und anschliessendes Spülen mit Stickstoff in die Desoxyform überführt. 47 mg Pyridoxalphosphat wurden unter Rühren zugegeben, und es wird 15 Minuten lang weitergerührt. Dann wurden 56 mg Natriumborhydrid zugegeben und weitere 20 Minuten lang gerührt (Zimmertemperatur). Nach dem erneuten Evakuieren wurden 0,8 ml 10% Glutardialdehyd zugegeben und 45 Minuten lang unter Stickstoff gerührt. Um das unvernetzte Hämoglobin abzutrennen, wurden 90 ml 4molare Ammoniumsulfatlösung innert 7 Minuten zugegeben und noch 10 Minuten lang gerührt. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Überstand verworfen. Der Niederschlag wurde in 20 ml Wasser aufgelöst. Es folgte eine 3stündige Dialyse mit «Visking»-Dialysierschlauch Typ 10/32 gegen das 50fache Volumen einer 0,5%igen Kochsalzlösung, wobei die Aussenlösung 3mal ausgewechselt wurde. Die dialysierte Hämoglobinlösung wurde zur restlosen Entfernung des Ammoniumsulfats über einen Mischbettaustauscher geschickt, bestehend aus stark saurem Kationenaustauscher, zum Beispiel «Dowex» WX 8 Kationenaustauscher in der Na+-Form bzw. «Dowex» 21 K Anionenaustauscher in der Cl~-Form (Lieferant: Firma DOW Chemical Company, Midland, Michigan, USA). 100 ml of 6% hemoglobin solution were converted into the deoxy form by evacuating to 26.6 mbar and then flushing with nitrogen. 47 mg of pyridoxal phosphate was added with stirring and stirring continued for 15 minutes. Then 56 mg of sodium borohydride was added and stirring was continued for a further 20 minutes (room temperature). After the evacuation again, 0.8 ml of 10% glutaraldehyde was added and the mixture was stirred under nitrogen for 45 minutes. In order to separate the uncrosslinked hemoglobin, 90 ml of 4 molar ammonium sulfate solution were added within 7 minutes and stirring was continued for 10 minutes. The resulting precipitate was centrifuged off and the supernatant was discarded. The precipitate was dissolved in 20 ml of water. This was followed by a 3-hour dialysis with «Visking» dialysis tube type 10/32 against 50 times the volume of a 0.5% saline solution, the external solution being replaced 3 times. The dialyzed hemoglobin solution was sent through a mixed bed exchanger to remove the ammonium sulfate completely, consisting of a strongly acidic cation exchanger, for example “Dowex” WX 8 cation exchanger in the Na + form or “Dowex” 21 K anion exchanger in the Cl ~ form (supplier: DOW Chemical Company, Midland, Michigan, USA).
Nach der Einstellung auf pH-Wert 7,5 mit n-NaOH und auf eine isotonische Elektrolyt- beziehungsweise Glukosekonzentration (Zusatz von 2 g Glukose und 0,21 g Natriumbicarbonat) wurde das Präparat sterilfiltriert und im Kühlschrank (5 °C) aufbewahrt. After adjustment to pH 7.5 with n-NaOH and to an isotonic electrolyte or glucose concentration (addition of 2 g glucose and 0.21 g sodium bicarbonate), the preparation was sterile filtered and stored in the refrigerator (5 ° C).
Das Präparat entsprach einem P50-Wert von 21,3 mbar und zeigte das Säulen-Elutions-Diagramm über «Sepharo-se» 6 B (Produkt der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB) gemäss Fig. 4. The preparation corresponded to a P50 value of 21.3 mbar and showed the column elution diagram over “Sepharo-se” 6 B (product from Pharmacia Fine Chemicals AB) according to FIG. 4.
Beispiel 6 Example 6
Es wurde wie in Beispiel 5, jedoch mit der 3fachen An-satzgrösse bis zur Zugabe des Glutardialdehyds gearbeitet. Nach dem Rühren wurde das Präparat durch eine mit 0,9%-NaCl-Lösung vorgefüllte Hohlfaser-Ultrafiltrationspatrone HIP 100 mit einem Eingangsdruck von 666 mbar umge- The procedure was as in Example 5, but with 3 times the batch size until the glutardialdehyde was added. After stirring, the preparation was passed through a hollow fiber ultrafiltration cartridge HIP 100 pre-filled with 0.9% NaCl solution at an inlet pressure of 666 mbar.
4 4th
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
5 638 401 5 638 401
pumpt. Das durch die Ultrafiltration abgepresste Volumen Beispiel 7 wurde kontinuierlich durch steriles Wasser ersetzt. Die Um- Es wurde wie in Beispiel 5, jedoch mit Zusatz von 71 mg pumpdauer betrug etwa 5 Stunden. In dieser Zeit fand Pyridoxalphosphat, gearbeitet. Das entsprechend hergestellgleichzeitig eine Vollentsalzung statt. Das Präparat wurde te Endprodukt wies einen P50-Wert von 24 mbar auf und wie in Beispiel 5 eingestellt, hatte einen P50-Wert von 25,3 5 zeigte das Gelchromatogramm von Fig. 6. pumps. The volume of Example 7 pressed by the ultrafiltration was continuously replaced by sterile water. The change was as in Example 5, but with the addition of 71 mg pumping time was about 5 hours. During this time pyridoxal phosphate was found. This means that full demineralization takes place simultaneously. The final product had a P50 value of 24 mbar and, as set in Example 5, had a P50 value of 25.3. 5 showed the gel chromatogram of FIG. 6.
mbar und zeigte das Gelchromatogramm von Fig. 5. mbar and showed the gel chromatogram of FIG. 5.
s s
1 Blatt Zeichnungen 1 sheet of drawings
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