DE1932527C3 - Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden Praeparates - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden PraeparatesInfo
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Description
I 932 527
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden Präparates aus dem Gift einer
Schlange der Gattung Trimeresurus.
Die sogenannte »Habu«-Schlange ist eine Giftschlange, die zu der Gattung Trimeresurus der Familie
Crotalidae gehört. Als Beispiele für diese Gattung seien genannt: Trimeresurus flavoviridis, Trimeresurus
okinavensis, Trimeresurus elegans, Trimeresurus tokarensis, Trimeresurus tinkami, Trimeresurus mucrosquamatus
und Trimeresurus stejnegeri. Wenn nicht besonders angegeben, so sind unter dem Ausdruck
»Habu« diese Schlangen gemeint.
Die Schlange »Habu« ist für ihre große Giftigkeit bekannt und ist auf den Tokarainseln und südlich
davon beheimatet. Ihr Gift ist gefürchtet, da es bei Menschen und Tieren durch seine hämorrhagische
und gewebenekrotische Wirkung tödlich wirkt.
Bei der Untersuchung der Giftwirkung des Gifts der »Habu«-Schlange wurde überraschenderweise festgestellt,
daß eine durch eine bestimmte Behandlung des Giftes erhaltene Substanz eine stark blutstillende
Wirkung aufweist, die klinisch mit zufriedenstellendem Erfolg verwendet werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden Präparates, da.>
> dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige, neutrale Lösung des Giftes einer Schlange der Gattung
Trimeresurus mit einem organischen Lösungsmittel in an sich bekannter Weise extrahiert, die wäßrige
Phase gegen destilliertes Wasser dialysiert, die dialy-
sierte Lösung lyophilisiert, das erhaltene Produkt in Phosphatpuffer pH 7,4 löst, die Lösung auf ein
Dextrangel mit einem Molgewicht-Fraktionierungsbereich von 1000 bis 50 000 gibt, die aktive Substanz
mit Phosphatpuffer pH 7.4 fraktioniert eluiert, die
Fraktionen sammelt, welche im Recalcinierungstest stark wirksam sind, lyophilisiert, das Produkt in
Natriumacetatpuffer pH 7,1 löst, die Lösung auf einen
basischen Ionenaustauscher gibt, die aktive Substanz mit Natriumacetatpuffer eluiert und die Fraktion
mit der Wirkung im Recalcinierungstest gewinnt und gegebenenfalls lyophilisiert.
Das Verfahren der Erfindung ist in folgender Tabelle schematisch dargelegt.
Wäßrige Lösung des rohen Giftes
Entfernung der Lipide
Zentrifugieren
F-I-A 1 wäßrige Phase [ *—
Dialyse
F-I-B I dialysierte Lösung j
Dialyse
F-I-B I dialysierte Lösung j
Sephadex-Säulcnchromatographie
organische Phase und Niederschlag
Waschen mit Wasser
Zentrifugieren
P-Il
4-4-4-4- 4- + + 4- ± blulkoagulicrendc Wirkung
4-4-4- 4-4- .4- ± hämorrhagische Wirkung
DEAE-Ccllulose-Säulenchromatographic
wäßrige Phase 1
Niederschlag organische Phase F-II F-III
Γ | I | I | D-IV | T | Ί | blutkoaguliercndc Wirkung |
D-I | D-M | D-III | I- + | D-V | D-Vl | hämorrhagische Wirkung |
t | ± | 4- I- 4 | + 4- 4- | ± | - | |
— | - | £ | 4- + | — | ||
Das rohe Gift wird zuerst in destilliertem Wasser gelöst, dessen pH-Wert vorher auf 7,0 mil Alkali
eingestellt wurde, und die Lösung wird mehrere Male mit dem gleichen Volumen eines organischen Lösungsmittels, z. B. Chloroform, Äther oder Äthyiacetat,
extrahiert und dann zentrifugiert.
Da bei dieser Extraktion Lipide des Giftes in die
organische Phase gehen, wird nur die wäßrige Phase (F-NA) verwendet und gegen destilliertes Wasser
dialysiert, wodurch man die dialysierte Lösung (F-I-B) erhält. Bei dieser Stufe kann ein Verlust an aktiver
Substanz wirkungsvoll verhindert werden, wenn man die wäßrige Phase F-I-A mit der wäßrigen Phase
dialysiert, die man beim Waschen der organischen Phase F-III und des Niederschlages F-Il mit wenig
Wasser erhält.
Die wäßrige Lösung des rohen Giftes und die
wäßrige Phase nach Entfernen der Lipide, F-I-A und
F-NB absorbieren bei 280 ηΐμ fast gleich stark, was
zeigt, daß der Großteil des Proteins in die wäßrige Phase gegangen ist. Die Tatsache, daß die dialysierte
Lösung eine etwas geringere Absorption aufweist,
ft5 läßt sich dadurch erklären, daß durch die Dialyse
niedermolekulare Substanzen entfernt worden sind.
des rohen Schlangengiftes in F-I-A, F-I-B, F-H und
Claims (1)
- i 932 527F-IIl nach dem Recalcinierungstest an Kaninchenplasma zeigt sich, daß die koagulierende Wirkung des rohen Giftes, F-I-A und F-I-B, fast gleich stark ist und in F-Il und F-III kaum Aktivität beobachtet wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Großteil der aktiven Substanz in der dialysierten Lösung enthalten ist.Die so erhaltene Lösung enthält noch verschiedene schädliche Bestandteile, einschließlich des hämorrhagischen Faktors. Die Lösung wird deshalb auf ein Dextrangel mit einem Molgewicht-Fraktionierungsbereich von 1000 bis 50 000 gegeben. Bei Elution mit Phosphatpuffer erhält man die Fraktionen P-I bis P-IV. Die Fraktion P-I mit den hochmolekularen Bestandteilen enthält viel Substanz, die im Recalcinierungstest wirksam ist. aber sie enthält ebenso noch viel hämorrhagischen Faktor. Deshalb wird der hämorrhagische Faktor säulenchromatögraphisch afl einem basischen Ii-nenaustauscherharz, z. B. Diäthylaminoäthylcellulosc (DEAE-Cellulose), Triäthylami-Boäthylcellulose (TEAE-Cellulose) und Diäthylaminoäthylcellulose-Sephadex (DEAE-Sephadex) entfernt, wobei man die Fraktionen D-I bis D-VI erhält, von denen die Fraktion D-III eine stark blutgerinnende Wirkung aufweist, aber wenig hämorrhagischen Faktor enthält.Die so erhaltene aktive Substanz ist ein ausgezeichnetes Hämostatikum mit thrombinähnlicher Wirkung. Seine blutgerinnende Wirkung ist ungefähr mehrere Male bis lOmal so hoch wie die von bekannten, handelsüblichen blutstillenden Agenzien.Das Beispiel erläutert die Erfindung.Beispiel500 mg des lyophilisierten rohen Giftes von Trimeresurus okinavensis wurden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, dessen pH-Wert vorher mit Alkali auf 7,0 eingestellt wurde. Die Lösung wurde mit 10 ml Chloroform ausgeschüttelt und anschließend zentrifugiert. Diese Maßnahme wurde 5mal wiederholt, und die wäßrige Phase wurde gesammelt. Die Chloroformphasen und die Niederschläge wurden tioch 2mal mit destilliertem Wasser ausgeschüttelt Und zentrifugiert, wobei die wäßrigen Phasen gesammelt wurden. Diese wäßrigen Phasen wurden mit der obengenannten wäßrigen Phase vereinigt, und das Gemisch wurde über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysicrtc Lösung wurde lyophilisiert.170 mg des Produkts wurden in I ml eines 1/70-m-Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,4 gelöst. Die Lösung wurde auf ein Dextrangel mit einem Molgewicht-Fraktionierungsbereich von 1000 bis 50 000 (Sephadex-G-75), Säule (2 χ 46 cm) zur Adsorption der im Recalcinierungstest wirksamen Substanz gegeben. Die Säule wurde bei 21 C mit 1/70-m-Phosphatpuffer mit einer Tropfgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde eluiert. Die Fraktionen 25 bis 40 mit starker Wirkung im Recalcinierungstest wurden in einem Fraktionensammler in Reagenzröhrchen (2-ml-Röhrchen) ge* sammelt und lyophilisiert. Zur Bestimmung der koagulierenden Aktivität wurden O1I ml Kaninchenplasma, das etwas Citronensäure enthielt, mit jeweils 0,l ml Eluat sowie 0,1 ml l/40molarer CaCl2-Lösung versetzt, und bei 37° C wurde die Gerinnungszeit bestimmt.55 mg des Produktes wurden in 1 ml 0,005molarcm Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 7,1 gelöst, und die Lösuna wurde auf eine DEAE-Cellulose-Säule (0,9 χ 35 cm) zur Adsorption der im Recalcinierumgstest wirksamen Substanz gegeben, Die Säule wurde mit einem Natriumacetatpuffergradienten von 0,005-bis Q,5molar eluiert. Die mit 0,04- bis 0,1 molarem Natriumacetatpuffer eluierte Fraktion mit der stärksten Wirkung im Recalcinierungstest wurde gesammelt (3,5-ml-Röhrchen) und lyophilisiert. Die koagulierende Aktivität wurde auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt.ω Zum Vergleich wurde das erfindungsgemäß hergestellte Präparat mit dem Handelsprodukt Reptilase verglichen, da dieses eine thrombinähnliche Wirkung besitzt und aus dem Gift der Schlange Bothrope jar;<raca gewonnen wird. 0,1 ml Plasma von Menschenblut, das etwas Citronensäure enthielt, wurden mit 0,1 ml des zu untersuchenden Präparates und 0,1 ml l/40molarer CaCl2-Lösung versetzt und auf 37° C erwärmt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten. Für die Blindprobe wurde an Stelle des Hämostatikums 0,1 ml physiologische Kochsalzlösung verwendet.
Probe
25Gerinnungszeil
SekundenBlindversuch
Reptilase
Präparat der Erfindung
30 0,1 mg/ml
0,05 mg/ml
0,02 mg/ml
0,01 mg/ml261
102
13
19
28
55Zur Bestimmung der thrombinähnlichen Wirkung wurden folgende Versuche durchgeführt: 0,2 ml einer r/oigen Fibrinogenlösung wurden mit 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung und 0.1 ml des zu untersuchenden Präparates gemischt und auf 37" C erwärmt.Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:Probe Gerinnungszeil
SekundenRcntilase < 150 Präparat der
0,1 mg/ml
0,05 mg/ml
0,02 mg/ml
0,01 mg/mlErfindung 37 63 138 253 Patentanspruch Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden Präparates, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige, neutrale Lösung des Giftes einer Schlange der Gattung Trimeresurus mit einem organischen Lösungsmittel in an steh bekannter Weise extrahiert, die wäßrige Phase gegen destilliertes Wasser dialysiert, die dialysierte Lösung lyophilisiert, das erhaltene Produkt in Phosphatpuffer pH 7,4 löst, die Lösung auf ein Dextrangel mit einem Molgewicht-Praktionierungsbereich5 6von 1000 bis 50 000 gibt, die aktive Substanz mit auf einen basischen Ionenaustauscher gibt, diePhosphatpulTer pH 7,4 fraktioniert eluiert, die aktive Substanz mit Natriumacctatpufler eluiertFraktionen sammelt, welche im Recalcinierungs- und die Fraktion mit der stärksten Wirkung imlest stark wirksam sind, lyophilisiert, das Produkt Recaleinierungslest gewinnt und gegebenenfallsin Natriumacetatpuffer pH 7,1 löst, die Lösung 5 lyophilisiert.
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