DE2732587C2 - - Google Patents
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- DE2732587C2 DE2732587C2 DE2732587A DE2732587A DE2732587C2 DE 2732587 C2 DE2732587 C2 DE 2732587C2 DE 2732587 A DE2732587 A DE 2732587A DE 2732587 A DE2732587 A DE 2732587A DE 2732587 C2 DE2732587 C2 DE 2732587C2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
- C07K7/062—Serum thymic factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/575—Hormones
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/18—Thymus derived hormone or factor; related peptides
Description
Gegenstand der Erfindung ist ein
Nonapeptid und dieses enthaltende
Arzneimittel gemäß den voranstehenden Ansprüchen.
Dieses Nonapeptid wird als Serum-Thymusfaktor bezeichnet.
Es ist bekannt, daß die immunologische Funktion zur
Abstoßung von Haupttransplantaten bei Mäusen, denen im
neugeborenen Zustand der Thymus entfernt wurde, durch
Injektion von zellfreien Thymusextrakten wiederhergestellt
werden kann. In einer Millipore®-Kammer bestimmte
Werte, aus denen eine teilweise Erholung von im
neugeborenen Zustand der Thymektomie unterworfenen Mäusen durch
Thymusverpflanzungen hervorgeht, deuten darauf hin, daß
der Thymus die Funktion einer endokrinen Drüse aufweist
und ein Hormon produziert, das in den Blutkreislauf gelangt;
vgl. D. Osoba et al., Nature 199 (1963), Seite 359.
Man kann das erfindungsgemäße Nonapeptid aus Blut
durch Defibrinierung, Dialyse, Konzentrierung an einem
geeigneten Filter, Fraktionierung durch ein Molekularsieb,
Chromatographie an einem Ionenaustauscherharz, weitere
Fraktionierung durch Dünnschichtchromatographie und
schließlich Elektrophorese gewinnen. Die Dünnschichtchromatographie
und Elektrophorese können durch weitere Gelfiltrationsstufen
ersetzt werden. Jede Stufe des Isolierverfahrens wird
durch einen Biotest überwacht, bei dem die hemmende
Wirkung des Peptids auf die Bildung von Rosetten in
Gegenwart von Azathioprin (im folgenden kurz "Az")
bestimmt wird. Das Verfahren ist brauchbar für die
Isolierung des Thymusfaktor-Polypeptidhormons aus dem
Blut von Mensch, Maus, Rind oder Schwein. Die bevorzugte
Quelle ist Schweineblut.
Gemäß diesem Verfahren wird frisch gesammeltes Schweineblut
durch mechanische Mittel defibriniert. Dies kann
erfolgen durch Rühren des frisch gesammelten Blutes mit
einem Rührstab und durch Entfernen des am Stab anhaftenden
Fibrins.
Das defibrinierte Blut wird zur Entfernung der Hauptmenge
des Proteins und von anderem nicht-dialysierbaren Material
dialysiert. Zweckmäßig verwendet man hierzu eine künstliche
Niere (im folgenden als Dialysator bezeichnet), die mit einer
künstlichen Membran, beispielsweise einer Polyacrylamid- oder -nitril-
Membran, ausgerüstet ist. Ein Dialysator ist besonders
geeignet zum Dialysieren von großen Volumina. Das defibrinierte
Blut wird vor der Dialyse zur Gewinnung von Serum zentrifugiert.
Das Dialysat, welches den Serum-Thymusfaktor enthält, wird durch
eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Ultrafiltration
(oder Diafiltration) bedeutet die selektive Zurückhaltung
von gelösten Teilchen durch konvektiven Lösungsmittelfluß
durch eine anisotrope, mit einer Haut versehene Membran.
Bei der Ultrafiltration werden gelöste Stoffe, Kolloide
oder Teilchen von Abmessungen, die größer sind als der
Grenzwert der Membran, quantitativ in Lösung zurück
gehalten, während die gelösten Teilchen, welche
kleiner sind als der Durchmesser der Poren in der Haut,
ungehindert mit dem Lösungsmittel durch die unterstützende
Membran hindurchgehen. Der Serum-Thymusfaktor wird
vorzugsweise mit Hilfe einer Amicon-UM2-Ultrafiltrations-
Membran konzentriert.
Amicon-UM2-Ultrafiltrations-Membranen sind von besonderer
Struktur, sie sind aus einer nicht-celluloseartigen Polymer
lösung in ebene Folien gegossen. Diese Membranen sind
anisotrop und bestehen aus einer sehr dünnen (0,1 bis 1,5 µm),
dichten "Haut" mit einer extrem feinen, definierten
Porenstruktur auf einer viel dickeren (50 bis 250 µm), offenzelligen,
schwammartigen Schicht des gleichen Polymeren. Die
UM2-Membran hat einen "Grenzwert" des Molekulargewichts
für abzuscheidende Stoffe von etwa 1000, d. h. diese Membran
hält Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als
etwa 1000 zurück und läßt Substanzen mit einem Molekulargewicht
von weniger als etwa 1000 passieren. Dies führt
zu einer Konzentrierung des Serum-Thymusfaktors
in der Diafiltrationskammer.
Die den Serum-Thymusfaktor enthaltende, konzentrierte Lösung wird
der Gelfiltration durch ein Dextrangel-Molekularsieb unter
worfen. Ein geeignetes Dextrangel ist das Sephadex®-Gel.
Sephadex® ist ein chromatographisches
Material, das in der Lage ist, Substanzen entsprechend ihrem
Molekulargewicht zu trennen. Diese Trennmethode ist allgemein
bekannt als Gelfiltration oder Gelchromatographie. Sephadex®
ist ein perlenförmiges Dextrangel, hergestellt durch Vernetzen
von ausgewählten Dextranfraktionen mit Epichlorhydrin.
Dextran ist ein Anhydroglukose-Polymeres, das von verschiedenen
Stämmen des Mikroorganismus Leuconostoc mesenteroides aus
Saccharose enthaltenden Lösungen hergestellt wird. Wegen
des hohen Gehalts an Hydroxylgruppen in den Polysaccaridketten
ist Sephadex® stark hydrophil und quillt daher in
Wasser und Elektrolytlösungen.
Es sind verschiedene Sephadex®-Typen erhältlich, die in
ihren Quellungseigenschaften sich unterscheiden. Jeder
fraktioniert innerhalb eines bestimmten
Molekulargewichtsbereiches, was vom Quellgrad des Gels
abhängt. Moleküle mit einem Molekulargewicht oberhalb
der Obergrenze dieses Bereiches - Ausschlußgrenze - werden
vom Gel vollständig ausgeschlossen und werden mit dem
Leervolumen eluiert. Moleküle mit einem Molekulargewicht
unterhalb dem Fraktionierungsbereich werden üblicherweise
bei einem Elutionsvolumen eluiert, das annähernd gleich
dem gesamten Bettvolumen ist. Sephadex® G-25, das bevorzugte
Material zur Fraktionierung des Serum-Thymusfaktors,
hat einen Fraktionierbereich des Molekulargewichts von
1000 bis 5000. Die "feine" Qualität wird für präparative
Zwecke bevorzugt, bei denen die mit der "superfeinen"
Qualität erzielbare extrem gute Trennung nicht erforderlich
ist, bei denen jedoch die Fließgeschwindigkeit von
größerer Bedeutung ist.
Sephadex® G-25 wird mit einem geeigneten Phosphatpuffer
eluiert. Restliche Proteine, die noch in dem Ansatz
vorhanden sind, werden von dieser Säule nicht zurückgehalten
und werden mit dem Leervolumen eluiert.
Die aktiven Fraktionen, bestimmt durch die Aktivität im
Rosettentest, werden vereinigt, entsalzt und der Chromatographie
an einer Ionenaustausch-Cellulose unterworfen, vorzugsweise
einem Kationenaustauscherharz, wie Carboxymethylcellulose
(CM-Cellulose).
Die Carboxymethylcellulosesäule wird mit
Salzlösungen abgestufter Konzentration eluiert. Die
aktiven Fraktionen können, falls gewünscht, durch
ein Millipore®-Filter filtriert werden zwecks
Entfernung von Bakterien. In diesem Falle
gibt man ein geeignetes Konservierungsmittel, wie Natriumazid,
zu allen nachfolgenden Lösungen zu, damit diese steril
bleiben.
Für die Filtration von Mikroorganismen kann man eine
Anzahl von Cellulose oder Cellulosederivaten, wie Nitro
cellulosescheiben, mit gleichmäßiger Porosität im Bereich
von 0,03 bis 3 µm verwenden.
Die aktiven Fraktionen, bestimmt durch den Rosettentest,
werden der eindimensionalen und der zweidimensionalen
Dünnschichtchromatographie und dann der Elektrophorese unterworfen.
Bevorzugt unterwirft man die aktiven Fraktionen aus der
Carboxymethylcellulosesäule der Gelfiltration unter Verwendung
von Sephadex® G-25, eluiert mit verdünnter wäßriger
Essigsäure und unterwirft die aktiven Fraktionen dieser Säule
der Gelfiltration durch Sephadex® G-10, das
Moleküle mit einem Molekulargewicht über 700 ausschließt, so daß der
Serum-Thymusfaktor mit dem Leervolumen eluiert wird.
Das erfindungsgemäße Nonapeptid weist einen isoelektrischen
Punkt (p I ) bei einem pH-Wert von 7,5 ± 0,1 auf. Die mangelnde
Affinität gegenüber Aktivkohle deutet auf die Abwesenheit von
aromatischen Aminosäuren hin. Die Elution des Polypeptids mit
dem Leervolumen bei der Chromatographie an Sephadex® G-10 und
die Zurückhaltung an Sephadex® G-15, G-25 und G-50 zeigen ein
Molekulargewicht von mehr als 700 und weniger als 3000 an.
Die Ultrafiltration durch Amicon-Membranen ergibt ein Molekulargewicht
von 500 bis 10 000. An CF50-, PM30- bzw. PM10-Membranen
(Mgw.-grenzen bzw. -trennwerte 50 000, 30 000 bzw. 10 000)
wird keine nennenswerte Retention festgestellt. Andererseits
wird keine merkliche Aktivität in UM2- und UM0,5-Filtration
vorgefunden, deren Molekulargewichtsgrenzen bzw. -trennwerte
bei 1000 bzw. 500 liegen. Das Nonapeptid besitzt die Eigenschaft,
daß es an Carboxymethylcellulose bei pH-Werten von
weniger als 7,0 und an Diäthylaminoäthylcellulose bei pH-Werten von mehr als
9,0 gebunden wird. Das an Carboxymethylcellulose gebundene Nonapeptid
kann mit 0,12 m NaCl eluiert werden. Die Chromatographie an Celluloseplatten
ergibt mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid (20 : 20 : 9) als Lösungsmittel
einen Rf-Wert von 0,32, mit destilliertem Wasser einen Rf-Wert von
0,8. Das Verhältnis Elutionsvolumen/Leervolumen beträgt
2,1 in einer Sephadex® G-25-Molekularsiebsäule in 0,2 M
Phasphatpuffer bei pH-Wert 7,3.
Säurehydrolyse bei 110°C in 6 N HCl über Nacht ergibt
die folgende Aminosäurezusammensetzung:
Asp,Ser₂,Glu₂,Lys,Gly₂,Ala,
worin die Abkürzungen die folgenden Bedeutungen haben:
Im Hinblick auf das Molekulargewicht in der Größenordnung
von 1000 Daltons, einem isoelektrischen Punkt pI bei etwa
pH 7,5, der Aminosäureanalyse und der Sequenzuntersuchungen,
die unter Verwendung der Edman-Technik, modifiziert durch
Hartley, durchgeführt wurden, wird angenommen, daß die
Aminosäuresequenz des Thymusfaktors wie folgt ist:
Pyroglutamyl-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn,
worin die Abkürzungen die folgenden Bedeutungen haben:
Das erfindungsgemäße Nonapeptid ist verwendbar zur Behandlung
von Autoimmunerkrankungen, z. B. bei den lupusartigen
Krankheiten, insbesondere bei der Behandlung von Lupus
Erythematosus beim Menschen. Es kann ferner in der Geriatrie
zur selektiven Stimulierung der T-Zellen-Aktivität eingesetzt
werden.
Das erfindungsgemäße Nonapeptid kann intravenös oder
intramuskulär verabfolgt werden. Als Trägermedien für Präparate,
welche das erfindungsgemäße Nonapeptid enthalten, eignen sich
z. B. sterile Flüssigkeiten, wie Wasser oder Kochsalz
lösung. Neben einem Trägermedium können die erfindungsgemäßen
Arzneimittel bzw. Lösungen weitere Bestandteile,
wie Stabilisatoren, Oxidationsinhibitoren, Suspendiermittel
oder Konservierungsmittel,
enthalten. Die fertigen Lösungen können
leicht nach herkömmlichen Filtriermethoden sterilisiert
werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel stellen wäßrige
Lösungen dar, welche eine für den medizinischen Zweck
ausreichende Menge des Wirkstoffs enthalten. Die zu
verabfolgende Dosis hängt in hohem Maße vom Zustand
und Körpergewicht des Patienten ab. Der parenterale
Verabfolgungsweg wird bevorzugt. Im allgemeinen beträgt
eine geeignete Tagesdosis etwa 0,0001 bis etwa 1 mg
Wirkstoff/kg Körpergewicht bei einer oder mehreren
täglichen Verabfolgung(en). Der bevorzugte Dosisbereich
beträgt etwa 0,0001 bis 0,01 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht.
Besonders vorzuziehen ist eine Tages-Injektionsdosis von
0,1 mg Wirkstoff. Für die parenterale Verabreichung dient
als Einheitsdosis im allgemeinen eine Lösung der reinen
Verbindung in sterilem Wasser. Das Präparat kann auch die
Form eines löslichen Pulvers aufweisen, aus dem nach
Bedarf eine Lösung hergestellt wird.
Eine Methode zur Isolierung des erfindungsgemäßen Nonapeptids aus Schweineblut
bzw. zu seiner Reinigung ist in Beispielen 1 und 2 näher beschrieben.
Das oben beschriebene Verfahren eignet sich zur Isolierung des
erfindungsgemäßen Serum-Thymusfaktors aus
menschlichem, Mäuse-, Rinder- und Schweineblut. Das
Serum von Schweinen, denen der Thymus entfernt wurde,
enthält eine Woche nach der Thymektomie kein Polypeptidhormon,
während dieses im Serum von Schweinen, die einer
Scheinthymektomie unterworfen wurden, vorhanden ist. Das
Hormon ist nicht artspezifisch; daher eignet sich aus
Schweine-, Mäuse- und Rinderblut isoliertes Hormon auch
für die Humanmedizin.
Die Isolierung des Nonapeptids erfolgt in 10 Stufen:
- 1) Defibrinieren,
- 2) Dialyse,
- 3) Konzentrieren an einer Amicon-UM2-Membran,
- 4) Gelfiltration durch Sephadex® G-25,
- 5) Carboxymethylcellulose-Chromatographie,
- 6) Behandlung mit Aktivkohle,
- 7) Dünnschichtchromatographie (DC) mit Butanol/Pyridin als Lösungsmittel,
- 8) zweidimensionale Dünnschichtchromatographie (erste Dimension mit 0,01 n Essigsäure, zweite Dimension mit Methanol/Chloroform/ Ammoniumhydroxid als Lösungsmittel,
- 9) Rechromatographie mit dem letzteren Lösungsmittel und
- 10) Elektrophorese.
Jede dieser Stufen wird nachstehend näher erläutert. Bei
der Fraktionierung geht man von 8 Liter Schweineblut aus.
Normale 3 bis 4 Monate alte Schweine werden in einem Schlachthaus
verbluten gelassen. Das Blut wird sofort durch mechanisches
Rühren defibriniert. Anschließend kühlt man das Blut auf
4°C ab und bringt es ins Labor, wo es zur Serumgewinnung
zentrifugiert wird.
8 Liter defibriniertes Blut liefern bei einmaligem 15minütigem
Zentrifugieren bei 4°C und 1700 g 3,6 Liter Serum.
Die nach dem (nachstehend beschriebenen) Rosettentest
bestimmte biologische Aktivität des defibrinierten und
zentrifugierten Serums beträgt 1/128.
3,6 Liter Serum werden in der Kälte (bei 4°C) unter Ultra
filtrationsbedingungen (positiver Druck in der Membran, keine
Flüssigkeit außerhalb der Membran) 4 Std. dialysiert. Man
verwendet eine handelsübliche Polyacrylnitrilmembran
mit einer Permeabilität von 0,36 bis 0,45
ml/min/mm²/mm Hg und einer Gesamtoberfläche von 1,02 m². Die
Membran wird in einem handelsüblichen
Dialysator
eingesetzt. Eine
Pumpe sorgt für die Serumzirkulation. Das Ultrafiltrat
wird in der äußeren Kammer des Dialysators mit Hilfe einer
zweiten Pumpe, die mit einer automatischen Ausfluß- und
Druckeinrichtung ausgestattet ist, aufgefangen. 0,5% Protein
werden im Ultrafiltrat (80 mg/ml im anfänglichen Serum und
0,4 mg/ml im Ultrafiltrat) gewonnen. Aus 3,6 Liter Serum
erhält man 2,8 Liter Ultrafiltrat.
Die Aktivität des Ultrafiltrats aufgrund des Rosettentests
beträgt 1/128.
In sieben Amicon-Diafiltrationskammern (Modell 402) werden
jeweils 400 ml Serumultrafiltrat gegeben. Dann wird ein
ständiger Druck von 3,51 kg/cm² angelegt. Nach
8 Stunden, wenn die Membran trocken ist, füllt man die
Kammer mit 4 ml Phosphatpuffer (0,2 m; pH 7,3) und rührt
1 Minute, damit das Polypeptid vom Puffer aufgenommen wird.
Die nach dem Rosettentest bestimmte Aktivität hat sich auf
1/25 000 erhöht. Die Waschflüssigkeiten (jeweils 4 ml) werden
vereinigt und der Sephadex® G-25-Gelfiltration unterworfen.
Die vereinigte Probe (28 ml) wird auf eine mit "feinem"
Sephadex® G-25 gefüllte 100-cm-×5-cm-Säule aufgegeben und
mit Phosphatpuffer (0,2 m; pH 7,3) eluiert. Man hält die
Fließgeschwindigkeit bei 5 ml/min und fängt 5-ml-Fraktionen
auf. Das mit Hilfe von Dextranblau bestimmte Leervolumen
(V O ) beträgt 580 ml. Die in der Probe enthaltene Protein
hauptmenge wird mit den Elutionsvolumina im Bereich von
540 bis 580 ml gewonnen.
Beim Rosettentest werden aktive Fraktionen bei einem Elutionsvolumen
(V E ) von 1250 ml (V E /V O = 2,1) festgestellt. Die
aktiven Fraktionen umfassen 15 ml mit Aktivität bei
1/256 000 und 30 ml mit Aktivität bei 1/128 000.
Die durch die Sephadex®-Chromatographie gewonnenen aktiven
Fraktionen werden mit Hilfe von Amixon-UM2-Membranen in
der beschriebenen Weise entsalzt, indem man diese Fraktionen
(insgesamt 45 ml) zusammen mit 300 ml destilliertem Wasser
in die Amicon-Einheit einbringt, bis die Flüssigkeit
vollständig durch die Membran hindurchgegangen ist. Der Filter
rückstand wird in 7 ml Phosphatpuffer (0,01 m; pH 6,3)
aufgenommen. Die erhaltene Probe wird auf eine mit
CM52-Cellulose (Whatman) gefüllte 15-cm-×0,9-cm-Säule
aufgegeben. Die Carboxymethylcellulose wird in der
vorbeladenen Form eingesetzt und mit Phosphatpuffer (0,02 m;
pH 6,3) ins Gleichgewicht gebracht. Nachdem man 40 ml
0,01 m Phosphatpuffer (pH 6,3) hinzugegeben hat, um
ungebundenes Material zu entfernen und um die Säule
wieder ins Gleichgewicht zu bringen, eluiert man mit
Lösungen mit abgestuften NaCl-Konzentrationen (von 0,01 m bis
0,4 m).
In dem vor der NaCl-Zugabe eluierten Volumen werden weniger
als 5% der biologischen Aktivität festgestellt. Die
gesamten übrigen biologischen aktiven Substanzen werden
in Form eines einzigen Maximums mit 0,12 m NaCl eluiert.
Man fängt 1-ml-Fraktionen auf. Die aktiven Fraktionen
umfassen zwei 1-ml-Fraktionen, jeweils mit Aktivität
bei 1/256 000, vier Fraktionen mit Aktivität bei 1/512 000
und eine Fraktion mit Aktivität bei 1/256 000. Alle
diese Fraktionen werden vereinigt und mit Aktivkohle
behandelt.
Zur Entfernung der Substanzen, die sich durch Aktivkohle
binden lassen, wird die bei der Carboxymethylcellulose-
Chromatographie eluierte Probe 1 Stunde bei 4°C mit Aktivkohle
behandelt (1 ml Aktivkohle bei 50 mg/ml Wasser mit
1 Vol. der bei der Carboxymethylcellulose-Chromatographie
erhaltenen aktiven Fraktionen). Die Aktivkohle wird durch
Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit
zeigt keine Änderung ihrer biologischen Aktivität.
Das mit Aktivkohle behandelte Material wird mit Hilfe einer
Amicon-UM2-Membran in der beschriebenen Weise entsalzt. Der
Filterrückstand wird in Wasser aufgenommen und gefrierge
trocknet. Das gefriergetrocknete Material wird in 50 µl Wasser
aufgenommen und längs einer horizontalen Linie auf eine
präparative Cellulose-Chromatographieplatte aufgebracht. Nach
Entwicklung mit Butanol/Pyridin (60 : 30) wird ein schmaler
Streifen am Plattenrand mit Fluorescamin oder Ninhydrin
sichtbar gemacht. Die den Fluorescaminflecken entsprechenden
Plattenbereiche werden eluiert.
Man sprüht ein Fluorescamin-Produkt in Form
einer Acetonlösung bei 15 mg-% auf und
macht die Flecken durch Bestrahlung mit einer UV-Lampe
sichtbar. Die Flecken werden bald nach dem Sprühvorgang
markiert, da festgestellt wird, daß sie nicht länger
als 1 bis 2 Minuten bestehen bleiben. Die Färbung des
Peptids läßt sich auch durch Besprühen mit einer Lösung
von Ninhydrin/Cadmiumacetat erreichen. Der 1 cm breite
Cellulosestreifen, auf welchem sich der Fluorescaminfleck
befindet, wird vom ungefärbten Teil der Platte abgetrennt
und eluiert. Die Elution erfolgt durch 18stündiges mechanisches
Rühren bei 4°C (1 cm² Cellulose/5 ml H₂O). Anschließend
wird die Probe anhand des Rosettentests auf die biologische
Aktivität geprüft. 30 ml zeigen Aktivität bei
1/25 000.
Nach Entwicklung mit Butanol/Pyridin (60 : 30) als Lösungsmittel
finden sich nicht mehr als 2% der ursprünglichen
Aktivität am Startpunkt, während eine von 100% nicht
unterscheidbare Aktivität an der Lösungsmittelfront
festgestellt wird. Der Cellulosestreifen an der Lösungs
mittelfront wird eluiert und das Eluat gefriergetrocknet.
Man führt eine zweite dünnschichtchromatographische Reinigungsstufe
durch zweidimensionale Chromatographie an Celluloseplatten
durch. Als erstes Lösungsmittelsystem dient 0,01 n
Essigsäure, in welcher die biologische Aktivität bei einem
Rf-Wert von 0,8 festgestellt wird. Das zweite Lösungsmittel
system ist Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid (20 : 20 : 9).
Nach der Entwicklung in der zweiten Dimension werden mit
Fluorescamin immer noch drei Flecken festgestellt. Bei der
Elution zeigt sich, daß der Fleck bei dem Rf-Wert von 0,32
die gesamte biologische Aktivität beinhaltet. 30 ml des
Eluats zeigen Aktivität bei 1/20 000.
Das eluierte Material ergibt bei der Rechromatographie mit Methanol/
Chloroform/Ammoniumhydroxid (20 : 20 : 9) lediglich einen
Fleck, der sich bei Einfärbung mit Fluorescamin oder Ninhydrin
in gleicher Weise zeigt. 30 ml des Eluats besitzen Aktivität
bei 1/20 000.
Die Hochspannungs-Elektrophorese bildet die letzte Stufe der
Reinigung. Man führt eine Papierelektrophorese während 50
Minuten bei 40 V/cm und 40 mA in bis zu einem pH-Wert von
1,9 verdünnter Ameisensäure durch. Drei Komponenten werden
durch Ninhydrin und Fluorescamin sichtbar gemacht. Bei
diesen Bedingungen wandert das aktive Produkt um 9 cm
zur Kathode. Die aktive Probe wird mit destilliertem
Wasser vom Papier eluiert (1 ml H₂O/1 cm² Papier). 4 ml
Eluat zeigen Aktivität bei 1/128 000; es werden 30 µg Peptid
gewonnen, wie der Test mit Ninhydrin und Fluorescamin
zeigt (nach Hydrolyse über Nacht in 6 n HCl bei 110°C).
Die Isolierung des Thymusfaktor-Polypeptids erfolgt in
7 Stufen:
- 1) Defibrinieren,
- 2) Dialyse,
- 3) Konzentrieren an einer Amicon-UM2-Membran,
- 4) Sephadex® G-25-Gelfiltration und Filtration durch eine Millipore®-Membran,
- 5) Carboxymethylcellulose-Chromatographie,
- 6) Sephadex® G-25-Gelfiltration,
- 7) Sephadex® G-10-Gelfiltration.
Jede dieser Stufen wird nachstehend näher erläutert. Bei
der Fraktionierung geht man von 2000 l Schweineblut aus.
Normale, 4 bis 4 Monate alte Schweine läßt man im Schlachthof
ausbluten und defibriniert das Blut unmittelbart durch
mechanische Bewegung. Man kühlt das Blut auf 4°C und
bringt es in das Labor, wo man es zur Gewinnung des
Serums zentrifugiert. 8 l defibriniertes Blut liefern
bei einmaligem 15minütigem Zentrifugieren bei 4°C und
1700 g 3,6 l Serum.
2000 l defibriniertes Schweineblut werden der Ultrafiltration
unter Verwendung eines Dialysators unter den Bedingungen
unterworfen, die im Beispiel 1, Stufe 2) angegeben sind.
420 l des Serumultrafiltrats werden durch Diafiltration
durch Amicon-UM2-Membranen unter den in Beispiel 1, Stufe 3
angegebenen Bedingungen auf ein Volumen von 4,2 l konzentriert.
3 l des Amicon-Konzentrats werden der Gelfiltration in
Anteilen von 28 ml unter Verwendung von 107 Sephadex®
G-25-Säulen unter den in Beispiel 1, Stufe 4) angegebenen
Bedingungen unterworfen. Die aktiven Fraktionen werden durch
den Rosettenversuch bestimmt und durch eine Millipore®-
Membran (Porengröße 0,22 µm) filtriert, um verunreinigende
Bakterien zu entfernen. Man gibt 0,02% Natriumazid zu
diesen aktiven Fraktionen und in den nachfolgenden Stufen
hinzu, um ein steriles Präparat zu gewährleisten.
Die durch die Sephadex® G-25-Gelfiltration gemäß Stufe 4)
erhaltenen aktiven Fraktionen werden entsalzt und an
Carboxymethylcellulose chromatographiert, wie in Beispiel 1,
Stufe 5) beschrieben.
Die aktiven Fraktionen jeder Carboxymethylcellulosesäule
werden durch den Rosettentest bestimmt und
vereinigt. Die vereinigten Fraktionen von jeder Carboxy
methylcellulosesäule werden lyophilisiert.
Die in Stufe 5) erhaltenen lyophilisierten Fraktionen
werden der Gelfiltration an 100 Säulen von Sephadex® G-25
unterworfen, die in 5%ige Essigsäure gefüllt und Abmessungen
von 90 cm × 1,5 cm und ein Leervolumen (V O ) von 44 ml
aufweisen, bestimmt unter Verwendung von Dextran Blau. Man
verwendet eine Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min und
sammelt 2-ml-Fraktionen.
Die Fraktionen, die aktiv im Rosettentest sind, liegen etwa
bei einem Elutionsvolumen von 70 ml (V E ) mit einem V E /V O von
1,6. Die aktiven Fraktionen umfassen 14 ml mit einer Aktivität
bei ¼ × 107 und 4 ml mit Aktivität bei ¹/₁ × 107. Die
aktiven Fraktionen werden vereinigt, ohne Entsalzen lyophilisiert
und der Gelfiltration an Sephadex® G-10 unterworfen.
Die aktiven Fraktionen werden der Gelfiltration an 20 Säulen
aus Sephadex® G-10 unterworfen, die in destilliertes Wasser
gefüllt sind. Die Elution erfolgt mit destilliertem Wasser.
Der Serum-Thymusfaktor wird mit dem Leervolumen eluiert. Die das
aktive Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt
und lyophilisiert und ergeben eine Gesamtmenge von 100 n Mol Serum-
Thymusfaktor.
Der Rosettentest wird von J.-F. Bach und M. Dardenne in
"Immunology" 25 (1973), Seite 353 beschrieben.
Zur Bestimmung der thymischen Aktivität des Serums wird
dieses zuerst durch eine Amicon-Membran (Centriflo CF50 A,
Amicon) filtriert, durch welche Substanzen mit einem Molekulargewicht
von weniger als 50 000 hindurchgehen. Man inkubiert
das infiltrierte Serum in einem Hämolyseröhrchen mit 3 × 106
Milzzellen, welche von ausgewachsenen C57/Bl6-Mäusen
(erhalten vom Centre d'Elevage des Animaux de Laboratoire
du C.N.R.S., 45 Orl´ans, La Source), denen 10 bis 20 Tage
vorher der Thymus entfernt wurde, erhalten wurden. Die
Thymektomiemethode wird von M. Dardenne und J.-F. Bach
in "Immunology" 25 (1973), Seiten 343/344 beschrieben.
Die Inkubierung wird während 90 Minuten bei 37°C in Gegenwart
von Azathioprin bei einer Konzentration von 10 µg/ml durchgeführt.
Diese Konzentration liegt in der Mitte zwischen der
Mindest-Azathioprinkonzentration, welche 50% rosettenbildende
Milzzellen von normalen Mäusen blockiert (1 µg/ml),
und der entsprechenden Mindesthemmkonzentration für rosettenbildende
Milzzellen von ausgewachsenen, der Thymektomie
unterworfenen Mäusen (25 bis 10 µg/ml). Nach der Inkubierung
gibt man zu den Zellen in der Testprobe 12 × 106 Schaf-
Erythrozyten. Die in der Probe enthaltenen Zellen werden
innerhalb von 6 Min. bei 200 g abzentrifugiert und anschließend
durch Rotation an einer Drehtrommel (10 cm Durchmesser) bei
geringer Drehzahl (10 UpM) neuerlich vorsichtig und
langsam suspendiert. Die rosettenbildenen Zellen werden in
einem Hämatocytometer gezählt. Wenn keine thymische Aktivität
vorhanden ist, beträgt die Anzahl der rosettenbildenden
Zellen (RBZ) 1210/106 ± 120 (Standardabweichung). Wenn
thymische Aktivität vorliegt, verringert sich die RBZ-Anzahl
auf 200 bis 400/106 Zellen. In Abwesenheit von Azathioprin
bewirkt normales Serum keine RBZ-Hemmung. Thymische Aktivität
liegt definitionsgemäß bei einer Hemmung von mehr als 50%
rosettenbildenden Zellen vor.
In den nachstehenden Beispielen sind parenteral verabfolgbare
Präparate beschrieben.
erfindungsgemäßes Nonapeptid0,1 mg
pyrogenfreies, steriles, destilliertes Wasser1,0 ml
Das Präparat wird durch Filtration sterilisiert und
anschließend in Ampullen, Fläschchen oder Mehrfachdosis-
Fläschchen verpackt.
1. Ampulle:
erfindungsgemäßes Nonapeptid0,1 mg 2. Ampulle:
Lösungsmittel: für Injektionszwecke geeignetes steriles Wasser1,0 ml
erfindungsgemäßes Nonapeptid0,1 mg 2. Ampulle:
Lösungsmittel: für Injektionszwecke geeignetes steriles Wasser1,0 ml
Claims (2)
1. Nonapeptid der Formel
PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn.
PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn.
2. Arzneimittel, enthaltend das Nonapeptid gemäß Anspruch 1
und übliche Träger oder Verdünnungsmittel.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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