DE2732587A1

DE2732587A1 - Polypeptid mit thymischer wirksamkeit

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Publication number: DE2732587A1
Application number: DE19772732587
Authority: DE
Inventors: Jean-Francois Dr Bach
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-09-22
Filing date: 1977-07-19
Publication date: 1978-03-23
Also published as: US4148886A; DE2732587C2

Description

Patentanwälte Dr. Dieter F. Morf Oipl.-Fliys. M. Gritschneder _ig>
JuU

8 München 8fc,Pi«wnauerstr. 28 00002IA

Dr. Jean-Prancois Bach und Dr. Jean Hamburger Paris, Frankreich

Polypeptid mit thymischer Wirksamkeit

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Dr.Jean-Francois Bach und 00002IA

Dr.Jean Hamburger

Beschreibung

Es ist bekannt j dass die immunologische Funktion zur Abstossung von Hauttransplantaten bei Mäusen, denen im neugeborenen Zustand der Thymus entfernt wurde, durch Injektion von zellfreien Thymusextrakten wiederhergestellt werden kann. In einer Millipore-Kammer bestimmte Werte, aus denen eine teilweise Erholung von im neugeborenen Zustand der Thymektomie unterworfenen Mäusen durch Thymusverpflanzungen hervorgeht, deuten darauf hin, dass der Thymus die Funktion einer endokrinen Drüse aufweist und ein Hormon produziert, das in den Blutkreislauf gelangt; vgl. D. Osoba et al., Nature 199 (1963), Seite 359. Die Erfindung betrifft dieses neue Polypeptidhormon, das als "Thymusfaktor-Polypeptidhormon" bezeichnet wird, sowie ein neues Verfahren zur Isolierung und Reinigung dieses für medizinische Zwecke geeigneten Polypeptids.

Man erhält das Hormon im allgemeinen aus Schweineblut durch Defibrinierung, Dialyse, Konzentrierung an einem geeigneten Filter, Fraktionierung durch ein Molekularsieb, Chromatographie an einem Ionenaustauscherharz, weitere Fraktionierung durch Dünnschichtchromatographie und schliesslich Elektrophorese. Die Dünnschichtchromatographie und Elektrophorese können durch weitere Gelfiltrationsstufen ersetzt werden. Jede Stufe des Isolierverfahrens wird durch einen Biotest überwacht, bei dem die hemmende Wirkung des Peptids auf die Bildung von Rosetten in Gegenwart von Azathioprin (im folgenden kurz "Az") bestimmt wird. Das Verfahren ist brauchbar für die

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Isolierung des Thymusfaktor-Polypeptidhormons aus dem Blut von Mensch, Maus, Rind oder Schwein. Die bevorzugte Quelle ist Schweiieblut.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird frisch gesammeltes Schweineblut defibriniert durch mechanische Mittel. Dies kann erfolgen durch Rühren des frisch gesammelten Blutes mit einem Rührstab und durch Entfernen des am Stab anhaftenden Fibrins.

Das defibrinierte Blut wird zur Entfernung der Hauptmenge des Proteins und von anderem nicht-dialysierbaren Material dialysiert. Zweckmässig verwendet man hierzu eine künstliche Niere (im folgenden als Dialysator bezeichnet), die mit einer künstlichen Membran, beispielsweise einer Polyacrylamid-Membran, ausgerüstet ist. Ein Dialysator ist besonders geeignet zum Dialysieren von grossen Volumina. Das defibrinierte Blut wird vor der Dialyse zur Gewinnung von Serum zentrifugiert

Das Dialysat, welches den Thymusfaktor enthält, wird durch eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Ultrafiltration (oder Diafiltration) bedeutet die selektive Zurückhaltung von gelösten Teilchen durch konvektiven Lösungsmittelfluss durch eine anisotrope, mit einer Haut versehene Membran. Bei der Ultrafiltration werden gelöste Stoffe, Kolloide oder Teilchen von Abmessungen, die grosser sind als der Grenzwert der Membran, quantitativ in Lösung zurückgehalten, während die gelösten Teilchen, welche .kleiner sind als der Durchmesser der Poren in der Haut, ungehindert mit dem Lösungsmittel durch die unterstützende Membran hindurchgehen. Thymusfaktor-Polypeptidhormon wird vorzugsweise mit Hilfe einer Amicon-UM2-Ultrafiltrations-Membran konzentriert.

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Amicon-UM2-Ultrafiltrations-Membranen sind von besonderer Struktur, sie sind aus einer nicht-celluloseartigen Polymerlösung in ebene Folien gegossen. Diese Membranen sind anisotrop und bestehen aus einer sehr dünnen (0,1 bis 1,5 um), dichten "Haut" mit einer extrem feinen, definierten Porenstruktur auf einer viel dickeren (50 bis 250 um), offenzelligen, schwammartigen Schicht des gleichen Polymeren. Die UM2-Membran hat einen "Grenzwert" des Molekulargewichts für abzuscheidende Stoffe von etwa 1000, d.h. diese Membran hält Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 1000 zurück und lässt Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1000 passieren. Dies führt zu einer Konzentrierung des Thymusfaktor-Polypeptidhormons in der Diafiltrationskammer. Amicon-Membranen werden hergestellt von der Amicon Corporation, 21 Hartwell Avenue, Lexington, Massachusetts.

Die den Thymusfaktor enthaltende, konzentrierte Lösung wird der Gelfiltration durch ein Dextrangel-Molekularsieb unterworfen. Ein geeignetes Dextrangel ist das Sephadexgel, hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals, Box 175, S-751 0U, Uppsala 1, Schweden. Sephadex ist ein chromatographisches Material, das in der Lage ist, Substanzen entsprechend ihrem Molekulargewicht zu trennen. Diese Trennmethode ist allgemein bekannt als Gelfiltration oder Gelchromatographie. Sephadex ist ein perlenförmiges Dextrangel, hergestellt durch Vernetzen von ausgewählten Dextranfraktionen mit Epichlorhydrin. Dextran ist ein Anhydroglukose-Polymeres, das von verschiedenen Stämmen des Mikroorganismus Leuconostoc mesenteroides aus Saccharose enthaltenden Lösungen hergestellt wird. Wegen _:. des hohen Gehalts an Hydroxylgruppen in den Polysaccarid- , ketten ist Sephadex stark hydrophil und quillt daher in Wasser und Elektrolytlösungen. '

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Es sind verschiedene Sephadextypen erhältlich, die in ihren Quellungseigenschaften sich unterscheiden. Jeder Sephadextyp fraktioniert innerhalb eines bestimmten Molekulargewichtbereiches, was vom Quellgrad des Gels abhängt. Moleküle mit einem Molekulargewicht oberhalb der Obergrenze dieses Bereichs - Ausschlussgrenze - werden vom Gel vollständig ausgeschlossen und werden mit dem Leervolumen eluiert. Moleküle mit einem Molekulargewicht unterhalb dem Praktionierungsbereich werden üblicherweise bei einem Elutionsvolumen eluiert, das annähernd gleich dem gesamten Bettvolumen ist. Sephadex G-25, das bevorzugte Sephadexmaterial zur Fraktionierung des Thymusfaktors, hat einen Fraktionierbereich des Molekulargewichts von 1000 bis 5000. Die "feine" Qualität wird für präparative Zwecke bevorzugt, bei denen die mit der "superfeinen" Qualität erzielbare extrem gute Trennung nicht erforderlich ist, bei denen jedoch die Fliessgeschwindigkeit von grösserer Bedeutung ist.

Sephadex G-25 wird mit einem geeigneten Phosphatpuffer eluiert. Restliche Proteine, die noch in dem Ansatz vorhanden sind , werden von dieser Säule nicht zurückgehalten und werden mit dem Leervolumen eluiert.

Die aktiven Fraktionen, bestimmt durch die Aktivität im Rosettentest, werden vereinigt, entsalzt und der Chromatographie an einer Ionenaustausch-Cellulose unterworfen, vorzugsweise einem Kationenaustauscherharz, wie Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose). Eine geeignete Carboxymethylcellulose kann man erhalten von Brown Company, 500 Fifth Avenue, New York, New York. Die Carboxymethylcellulosesäule wird mit Salzlösungen abgestufter Konzentration eluiert. Die aktiven Fraktionen können, falls gewünscht, durch ein Millipore-Filter filtriert werden zwecks Entfernung von Bakterien. In diesem Falle

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gibt man ein geeignetes Konservierungsmittel, wie Natriumazid, zu allen nachfolgenden Lösungen zu, damit diese steril bleiben.

Für die Abfiltration von Mikroorganismen kann man eine Anzahl von Cellulose oder Cellulosederivaten, wie Nitrocellulosescheiben, mit gleichmässiger Porosität im Bereich von 0,03 bis 3 Mikron verwenden, beispielsweise diejenigen der Millipore Corporation, 200 Walsh Road, Bedford, Massachusetts.

Die aktiven Fraktionen, bestimmt durch den Rosettentest, werden der eindimensionalen und der zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie und dann der Elektrophorese unterworfen. In der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens unterwirft man die aktiven Fraktionen aus der Carboxymethylcellulosesäule der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-25, eluiert mit verdünnter wässriger Essigsäure und unterwirft die aktiven Fraktionen dieser Säule der Gelfiltration durch Sephadex G-10. Sephadex G-10 schliesst Moleküle mit einem Molekulargewicht über 700 aus, so dass das Thymusfaktor-Polypeptid mit dem Leervolumen eluiert wird.

Das durch das obige Verfahren erhaltene neue Polypeptid ist verwendbar zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, z.B. bei den lupusartigen Krankheiten, insbesondere bei der Behandlung von Lupus Erythematosus beim Menschen. Dieses neue Polypeptid kann ferner in der Geriatrie zur selektiven Stimulierung der T-Zellen-Aktivität eingesetzt ^r werden. ^;

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Eine Methode zur Isolierung des erfindungsgemässen Polypeptidhormons aus Schweineblut bzw. zu seiner Reinigung ist in Beispielen 1 und 2 näher beschrieben. Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich zur Isolierung des Thymusfaktor-Polypepdidhormons aus menschlichem, Mäuse-, Rinder- und Schweineblut. Das Serum von Schweinen, denen der Thymus entfernt wurde, enthält eine Woche nach der Thymektomie kein Polypeptidhormon, während dieses im Serum von Schweinen, die einer Scheinthymektomie unterworfen wurden, vorhanden ist. Das Hormon ist nicht artspezifisch; daher eignet sich aus Schweine-, Mäuse- und Rinderblut isoliertes Hormon auch für die Humanmedizin.

Beispiel Isolierung und Reinigung des Thymusfaktor-Polypeptids

Die Isolierung des Thymusfaktor-Polypeptids erfolgt in 10 Stufen: 1) Defibrinieren, 2) Dialyse, 3) Konzentrieren an einer Amicon UM2-Membran, Ό Gelfiltration durch Sephadex.G-25, 5) Carboxymethylcellulose-Chromatographie, 6) Behandlung mit Aktivkohle, 7) Dünnschichtchromatographie (DC) mit Butanol/Pyridin als Lösungsmittel, 8) zweidimensional Dünnschichtchromatographie (erste Dimension mit 0,01 η Essigsäure, zweite Dimension mit Methanol/Chloroform/ Ammoniumhydroxid als Lösungsmittel, 9) Rechromatographie mit dem letzteren Lösungsmittel und 10) Elektrophorese.

Jede dieser Stufen wird nachstehend näher erläutert. Bei der Fraktionierung geht man von 8 Liter Schweineblut aus.

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1) Serumherstellung durch Defibrinieren und Zentrifugieren

Normale 3 bis 4 Monate alte Schweine werden in einem Schlachthaus verbluten gelassen. Das Blut wird sofort durch mechanisches Rühren defibriniert. Anschliessend kühlt man das Blut auf 4 ⁰C ab und bringt es ins Labor, wo es zur Serumgewinnung zentrifugiert wird.

8 Liter defibriniertes Blut liefern bei einmaligem 15minütigem Zentrifugieren bei 4 ⁰C und 1700 g 3,6 Liter Serum.

Biologische Aktivität:

Die nach dem (nachstehend beschriebenen) Rosettentest bestimmte biologische Aktivität des defibrinierten und zentrifugierten Serums beträgt 1/128.

2) Dialyse

3,6 Liter Serum werden in der Kälte (bei 4 ⁰C) unter Ultrafiltrationsbedingungen (positiver Druck in der Membran, keine Flüssigkeit ausserhalb der Membran) 4 Std. dialysiert. Man verwendet eine Polyacrylnitrilmembran (Handelsprodukt von Rhöne-Poulenc) mit einer Permeabilität von 0,36 bis 0,45 ml/min/mm^z/mm Hg und einer Gesamtoberfläche von 1,02 m². Die Membran wird in einem handelsüblichen Rhone-Poulenc-6-Dialysator (Rhöne-Poulenc, Centre de Recherche Nicolas Grillet, Vitry sur Seine, Frankreich) eingesetzt. Eine Pumpe sorgt für die Serumzirkulation. Das Ultrafiltrat wird in der äusseren Kammer des Dialysators mit Hilfe einer zweiten Pumpe, die mit einer automatischen Ausfluss- und Druckeinrichtung ausgestattet ist, aufgefangen. 0,5 % Protein werden im Ultrafiltrat (80 mg/ml im anfänglichen Serum und 0,4 mg/ml im Ultrafiltrat) gewonnen. Aus 3»6 Liter Serum erhält man 2,8 Liter Ultrafiltrat. .

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Biologische Aktivität;

Die Aktivität des Ultrafiltrats aufgrund des Rosettentests beträgt 1/128.

3) Amicon-UM2-Membran-Diafiltration

In sieben Amicon-Diafiltrationskammern (Modell 402) werden jeweils ¹IOO ml Serunmltrafiltrat gegeben. Dann wird ein ständiger Druck von 3,51 kg/cm² (50 psi) angelegt. Nach 8 Stunden, wenn die Membran trocken ist, füllt man die Kammer mit 4 ml Phosphatpuffer (0,2 m; pH 7,3) und rührt 1 Minute, damit das Polypeptid vom Puffer aufgenommen wird.

Biologische Aktivität:

Die nach dem Rosettentest bestimmte Aktivität hat sich auf 1/25 000 erhöht. Die Waschflüssigkeiten (jeweils 1 ml) werden vereinigt und der Sephadex-G-25-Gelfiltration unterworfen.

H) Sephadex-G-25-Gelfiltration

Die vereinigte Probe (28 ml) wird auf eine mit "feinem" Sephadex G-25 gefüllte 100 cm χ 5 cm-Säule aufgegeben und mit Phosphatpuffer (0,2 m; pH 7,3) eluiert. Man hält die Fliessgeschwindigkeit bei 5 ml/min und fängt 5 ml-Praktionen auf. Das mit Hilfe von Dextranblau bestimmte Leervolumen (Vq) beträgt 580 ml. Die in der Probe enthaltene Proteinhauptmenge wird mit den Elutionsvolumina im Bereich von bis 580 ml gewonnen.

Biologische Aktivität:

Beim Rosettentest werden aktive Fraktionen bei einem Elutionsvolumen (Vg) von 1250 ml (VjVV₀ = 2,1) festgestellt. Die aktiven Fraktionen umfassen 15 ml mit Aktivität bei 1/256 000 und 30 ml mit Aktivität bei 1/128 000.

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5) Carboxymethylcellulose-Chromatographie

Die durch die Sephadex-Chromatographie gewonnenen aktiven Fraktionen werden mit Hilfe von Amicon UM2-Membranen in der beschriebenen Weise entsalzt, indem man diese Fraktionen (insgesamt 45 ml) zusammen mit 300 ml destilliertem Wasser in die Amicon-Einheit einbringt, bis die Flüssigkeit vollständig durch die Membran hindurchgegangen ist. Der Filterrückstand wird in 7 ml Phosphatpuffer (0,01 m; pH 6,3) aufgenommen. Die erhaltene Probe wird auf eine mit CM52-Cellulose (Whatman) gefüllte 15 cm χ 0,9 cm-Säule aufgegeben. Die Carboxymethylcellulose wird in der vorbeladenen Form eingesetzt und mit Phosphatpuffer (0,02 m; pH 6,3) ins Gleichgewicht gebracht. Nachdem man ¹IO ml 0,01 m Phosphatpuffer (pH 6,3) hinzugegeben hat,um ungebundenes Material zu entfernen und um die Säule wieder ins Gleichgewicht zu bringen, eluiert man mit Lösungen mit abgestuften NaCl-Konzentrationen (von 0,01 m bis 0,4 m).

Biologische Aktivität:

In dem vor der NaCl-Zugabe eluierten Volumen werden weniger als 5 % der biologischen Aktivität festgestellt. Die gesamten übrigen biologischen aktiven Substanzen werden in Form eines einzigen Maximums mit 0,12 m NaCl eluiert. Man fängt 1-ml-Fraktionen auf. Die aktiven Fraktionen umfassen zwei 1-ml-Fraktionen, jeweils mit Aktivität bei 1/256 000, vier Fraktionen mit Aktivität bei 1/512 und eine Fraktion mit Aktivität bei 1/256 000. Alle diese Fraktionen werden vereinigt und mit Aktivkohle behandelt.

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6) Behandlung mit Aktivkohle

Zur Entfernung der Substanzen, die sich durch Aktivkohle binden lassen, wird die bei der Carboxymethylcellulose-Chromatographie eluierte Probe 1 Stunde bei 4 ⁰C mit Aktivkohle behandelt (1 ml Aktivkohle bei 50 mg/ml Wasser mit 1 Vol. der bei der Carboxymethylcellulose-Chromatographie erhaltenen aktiven Fraktionen). Die Aktivkohle wird durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit zeigt keine Änderung ihrer biologischen Aktivität.

7) Präparative DünnschichtChromatographie

Das mit Aktivkohle behandelte Material wird mit Hilfe einer Amicon UM2-Membran in der beschriebenen Weise entsalzt. Der Filterrückstand wird in Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet . Das gefriergetrocknete Material wird in 50 μΐ Wasser aufgenommen und längs einer horizontalen Linie auf eine präparative Cellulose-Chromatographieplatte aufgebracht. Nach Entwicklung mit Butanol/Pyridin (60 : 30) wird ein schmaler Streifen am Plattenrand mit Fluorescamin oder Ninhydrin sichtbar gemacht. Die den Fluorescaminflecken entsprechenden Plattenbereiche werden eluiert.

Man sprüht Fluram (ein Fluorescamin-Produkt von Hoffman La Roche) in Form einer Acetonlösung bei 15 mgji auf und macht die Flecken durch Bestrahlung mit einer UV-Lampe sichtbar. Die Flecken werden bald nach dem Sprühvorgang markiert, da festgestellt wird, dass sie nicht länger als 1 bis 2 Minuten bestehen bleiben. Die Färbung des Peptids lässt sich auch durch Besprühen mit einer Lösung von Ninhydrin/Cadmiumacetat erreichen. Der 1 cm breite Cellulosestreifen, auf welchem sich der Fluorescaminfleck befindet, wird vom ungefärbten Teil der Platte abgetrennt und eluiert. Die Elution erfolgt durch l8stündiges mechanisches Rühren bei h ⁰C (1 cm² Cellulose/5 ml H₃O). Anschliessend wird die Probe anhand des Rosettentests auf die biolo-

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gische Aktivität geprüft. 30 ml zeigen Aktivität bei 1/25 000.

Nach Entwicklung mit Butanol/Pyridin (60 : 30) als Lösungsmittel finden sich nicht mehr als 2 % der ursprünglichen Aktivität am Startpunkt, während eine von 100 % nicht unterscheidbare Aktivität an der Lösungsmittelfront festgestellt wird. Der Cellulosestreifen an der Lösungsmittelfront wird eluiert und das Eluat gefriergetrocknet.

8) Zweidimensionale präparative DünnschichtChromatographie

Man führt eine zweite dünnschichtchromatographische Reinigungsstufe durch zweidimensionale Chromatographie an Celluloseplatten durch. Als erstes Lösungsmittelsystem dient 0,01 η Essigsäure, in welcher die biologische Aktivität bei einem R„-Wert von 0,8 festgestellt wird. Das zweite Lösungsmittelsystem ist Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid (20 : 20 : 9). Nach der Entwicklung in der zweiten Dimension werden mit Fluorescamin immer noch drei Flecken festgestellt. Bei der Elution zeigt sich, dass der Fleck bei dem R„-Wert von 0,32 die gesamte biologische Aktivität beinhaltet. 30 ml des Eluats zeigen Aktivität bei 1/20 000.

9) Rechromatographie

Das eluierte Material ergibt bei der Rechromatographie mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid (20 : 20 : 9) lediglich einen Fleck, der sich bei Einfärbung mit Fluorescamin oder Ninhydrin in gleicher Weise zeigt. 30 ml des Eluats besitzen Aktivität bei 1/20 000.

10) Hochspannungs-Elektrophorese

Die Hochspannungs-Elektrophorese bildet die letzte Stufe der Reinigung. Man führt eine Papierelektrophorese während 50 r Minuten bei HO V/cm und 40 mA in bis zu einem pH-Wert von 1,9 verdünnter Ameisensäure durch. Drei Komponenten werden

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durch Ninhydrin und Fluorescamin sichtbar gemacht. Bei diesen Bedingungen wandert das aktive Produkt um 9 cm zur Kathode. Die aktive Probe wird mit destilliertem Wasser vom Papier eluiert (1 ml HpO/1 cm² Papier). 4 ml Eluat zeigen Aktivität bei 1/128 000; es werden 30 ug Peptid gewonnen, wie der Test mit Ninhydrin und Pluorescamin zeigt (nach Hydrolyse über Nacht in 6 η HCl bei 110 ⁰C).

Beispiel Isolierung und Reinigung des Thymusfaktor-Polypeptids

Die Isolierung des Thymusfaktor-Polypeptids erfolgt in 7 Stufen:

1) Defibrinieren, 2) Dialyse, 3) Konzentrieren an einer Amicon UM2-Membran, 4) Sephadex-G-25-Gelfiltration und Filtration durch eine Millipore-Membran, 5) Carboxymethylcellulose-Chromatographie, 6) Sephadex-G-25-Gelfiltration, 7) Sephadex-G-10-Gelfiltration.

Jede dieser Stufen wird nachstehend näher erläutert. Bei der Fraktionierung geht man von 2000 1 Schweineblut aus.

1) Defibrinieren von Schweineblut

Normale, 3-4 Monate alte Schweine lässt man im Schlachthof ausbluten und defibriniert das Blut unmittelbar durch mechanische Bewegung. Man kühlt das Blut auf 4 ⁰C und bringt es in das Labor, wo man es zur Gewinnung des Serums zentrifugiert. 8 1 defibriniertes Blut liefern bei einmaligem 15minütigem Zentrifugieren bei 4 ⁰C und 1700 g 3,6 1 Serum.

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2) Serumherstellung durch Ultrafiltration

2000 1 defibriniertes Schweineblut werden der Ultrafiltration unter Verwendung eines Dialysators unter den Bedingungen unterworfen, die im Beispiel 1, Stufe 2) angegeben sind.

3) Amicon-UM2-Membran-Diafiltration

420 1 des Serumultrafiltrats werden durch Diafiltration durch Amicon-UM2-Membranen unter den in Beispiel 1, Stufe angegebenen Bedingungen auf ein Volumen von 4,2 1 konzentriert.

4) Sephadex-G-25-Gelfiltration

3 1 des Amicon-Konzentrats werden der Gelfiltration in Anteilen von 28 ml unter Verwendung von 107 Sephadex-G-25-Säulen unter den in Beispiel 1, Stufe 4) angegebenen Bedingungen unterworfen. Die aktiven Fraktionen werden durch den Rosettenversuch bestimmt und durch eine Millipore-Membran (Porengrösse 0,22 Mikron) filtriert, um verunreinigende Bakterien zu entfernen. Man gibt 0,02 % Natriumazid zu diesen aktiven Fraktionen und in den nachfolgenden Stufen hinzu, um ein steriles Präparat zu gewährleisten.

5) Carboxymethylcellulose-Chromatographie

Die durch die Sephadex-G-25-Gelfiltration gemäss Stufe 4) erhaltenen aktiven Fraktionen werden entsalzt und an Carboxymethylcellulose chromatographiert, wie in Beispiel 1, Stufe 5) beschrieben.

Die aktiven Fraktionen jeder Carboxymethylcellulosesäule werden durch den Rosettentest bestimmt und vereinigt. Die vereinigten Fraktionen von jeder Carboxymethylcellulosesäule werden lyophilisiert. '

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6) Sephadex-G-25-Gelfiltration

Die in Stufe 5? erhaltenen lyophilisierten Fraktionen werden der Gelfiltration an 100 Säulen von Sephadex-G-25 unterworfen, die in 5~iige Essigsäure gefüllt und Abmessungen von 90 cm χ 1,5 cm und ein Leervolumen (V_Q) von 44 ml aufweisen, bestimmt unter Verwendung von Dextran Blau. Man verwendet eine Pliessgeschwindigkeit von 0,2 ml/min und sammelt 2-ml-Fraktionen.

Biologische Aktivität:

Die Fraktionen, die aktiv im Rosettentest sind, liegen etwa bei einem Elutionsvolumen von 70 ml (V_) mit einem V-/V-. von

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1,6. Die aktiven Fraktionen umfassen 14 ml mit einer Aktivität bei 1/4 χ 10⁷ und 4 ml mit Aktivität bei 1/1 χ 10⁷. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, ohne Entsalzen lyophilisiert und der Gelfiltration an Sephadex-G-10 unterworfen.

7) Sephadex-G-10-Gelfiltration

Die aktiven Fraktionen werden der Gelfiltration an 20 Säulen aus Sephadex G-10 unterworfen, die in destilliertes Wasser gefüllt sind. Die Elution erfolgt mit destilliertem Wasser. Der Thymusfaktor wird mit dem Leervolumen eluiert. Die das aktive Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert und ergeben eine Gesamtmenge von 100 nMol Thymusfaktor-Peptid.

Bestimmung der thymischen Aktivität von Serum durch Rosettentest

Der Rosettentest wird von J-.F. Bach und M. Dardenne in "Immunology" 25 (1973), Seite 353 beschrieben.

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Zur Bestimmung der thymischen Aktivität des Serums wird dieses zuerst durch eine Amicon-Membran (Centriflo CP50 A, Amicon) filtriert, durch welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 50 000 hindurchgehen. Man inkubiert das infiltrierte Serum in einem Hämolyseröhrchen mit 3 x Milzzellen, welche von ausgewachsenen C 57/Bl 6-Mäusen (erhalten vom Centre d¹EIevage des Animaux de Laboratoire du C.N.R.S., il5 Orleans, La Source), denen 10 bis 20 Tage vorher der Thymus entfernt wurde, erhalten wurden. Die Thymektomiemethode wird von M. Dardenne und J.-P. Bach in "Immunology" 25 (1973), Seiten 3ⁱ*3/3¹*4 beschrieben.

Die Inkubierung wird während 90 Minuten bei 37 ⁰C in Gegenwart von Azathioprin bei einer Konzentration von 10 ug/ml durchgeführt. Diese Konzentration liegt in der Mitte zwischen der Mindest-Azathioprinkonzentration, welche 50 % rosettenbildende Milzzellen von normalen Mäusen blockiert (1 ug/ml), und der entsprechenden Mindestherruakonzentration für rosettenbildende Milzzellen von ausgewachsenen, der Thymektomie unterworfenen Mäusen (25 bis 10 ug/ml). Nach der Inkubierung gibt man zu den Zellen in der Testprobe 12 χ 10 Schaf-Erythrozyten. Die in der Probe enthaltenen Zellen werden innerhalb von 6 Min. bei 200 g abzentrifugiert und anschliessend durch Rotation an einer Drehtrommel (10 cm Durchmesser) bei geringer Drehzahl (10 UpM) neuerlich vorsichtig und langsam suspendiert. Die rosettenbildenden Zellen werden in einem Hämatocytometer gezählt. Wenn keine thymische Aktivität vorhanden ist, beträgt die Anzahl der rosettenbildenden Zellen (RBZ) 1210/10⁶ - 120 (Standardabweichung). Wenn thymische Aktivität vorliegt, verringert sich die RBZ-Anzahlauf 200 bis 400/10 Zellen. In Abwesenheit von Azathioprin ^;! bewirkt normales Serum keine RBZ-Hemmung. Thymische Aktivität liegt definitionsgemäss bei einer Hemmung von mehr als 50 % ·. rosettenbildenden Zellen vor.

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Eigenschaften des Polypeptidhormons

Das erfindungsgemässe Polypeptidhormon weist einen isoelektrischen Punkt (p_) bei einem pH-Wert von 7,5 - 0,1 auf. Die mangelnde Affinität gegenüber Aktivkohle deutet auf die Abwesenheit von aromatischen Aminosäuren hin. Die Elution des Polypeptide mit dem Leervolumen bei der Chromatographie an Sephadex G-IO und die Zurückhaltung an Sephadex G-15, G-25 und G-50 zeigen ein Molekulargewicht von mehr als und weniger als 3000 an. Die Ultrafiltration durch Amicon-Membranen ergibt ein Molekulargewicht von 500 bis 10 000. An CP50-, PM30- bzw. PMlO-Membranen (Mgw.-grenzen bzw. -trennwerte 50 000, 30 000 bzw. 10 000) wird keine nennenswerte Retention festgestellt. Andererseits wird keine merkliche Aktivität in UM2- und UM0,5-Piltraten vorgefunden, deren Molekulargewichtsgrenzen bzw. -trennwerte bei 1000 bzw. 500 liegen. Das Polypeptid besitzt die Eigenschaft, dass es an Carboxymethylcellulose bei pH-Werten von weniger als 7,0 und an Diäthylaminoäthylcellulose bei pH-Werten von mehr als 9,0 gebunden wird. Das an Carboxymethylcellulose gebundene Polypeptid kann mit 0,12 m NaCl eluiert werden. Die Chromatographie an Celluloseplatten ergibt mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid (20 : 20 : 9) als Lösungsmittel einen R„-Wert von 0,32, mit destilliertem Wasser einen R„-Wert von 1,0 und mit 0,01 η Essigsäure einen R„-Wert von 0,8.

Säurehydrolyse bei 110 ⁰C in 6N HCl über Nacht ergibt die folgende Aminosäurezusammensetzung:

Asp,Serp,GlUp,Lys,Gly„,AIa ,

worin die Abkürzungen die folgenden Bedeutungen haben:

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Abkürzung Aminisäure

Asp Asparaginsäure

Ser Serin

GIu Glutaminsäure

Lys Lysin

GIy Glycin

AIa Alanin

Im Hinblick auf das Molekulargewicht in der Grössenordnung von 1000 Daltons, einem isoelektrischen Punkt pi bei etwa pH 7j5, der Aminosäureanalyse und der Sequenzuntersuchungen, die unter Verwendung der Edman-Technik, modifiziert durch Hartley>durchgeführt wurden, wird angenommen, dass die Aminosäuresequenz des Thymusfaktors wie folgt ist:

Pyroglutamyl-AIa-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn , worin die Abkürzungen die folgenden Bedeutungen haben: Abkürzung Aminosäure

GIn Glutamin

Asn Asparagin

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Das neue Polypeptid der Erfindung kann intravenös oder intramuskulär verabfolgt werden. Als Trägermedien für Präparate, welche das Polypeptid enthalten, eignen sich z.B. sterile Flüssigkeiten, wie Wasser oder Kochsalzlösung. Neben einem Trägermedium können die erfindungsgemässen Arzneimittel bzw. Lösungen weitere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Oxidationsinhibitoren, Suspendiermittel oder Konservierungsmittel, z.B. Phenol oder Chlorbutanol, enthalten. Die fertigen Lösungen können leicht nach herkömmlichen Filtriermethoden sterilisiert werden.

Die erfindungsgemässen Arzneimittel stellen wässrige Lösungen dar, welche eine für den medizinischen Zweck ausreichende Menge des Wirkstoffs enthalten. Die zu verabfolgende Dosis hängt in hohem Masse vom Zustand und Körpergewicht des Patienten ab. Der parenterale Verabfolgungsweg wird bevorzugt. Im allgemeinen beträgt eine geeignete Tagesdosis etwa 0,0001 bis etwa 1 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht bei einer oder mehreren täglichen Verabfolgung(en). Der bevorzugte Dosisbereich beträgt etwa 0,0001 bis 0,01 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht, Besonders vorzuziehen ist eine Tages-Injektionsdosis von 0,1 mg Wirkstoff. Für die parenterale Verabreichung dient als Einheitsdosis im allgemeinen eine Lösung der reinen Verbindung in sterilem Wasser. Das Präparat kann auch die Form eines löslichen Pulvers aufweisen, aus dem nach Bedarf eine Lösung hergestellt wird.

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In den nachstehenden Beispielen sind parenteral verabfolgbare Präparate beschrieben, die in Ampullen, Fläschchen oder Mehrfac'idosis-Fläschchen abgefüllt werden können.

Beispiel

Parenterale Lösung, die 0,1 mg des Thymusfaktor-Polypeptidhormons enthält

Thymusfaktor-Polypeptidhormon 0,1 mg

pyrogenfreies, steriles, destilliertes Wasser 1,0 ml

Das Präparat wird durch Filtration sterilisiert und anschliessend in Ampullen, Fläschchen oder Mehrfachdosis-Fläschchen verpackt.

Beispiel

Ampullen mit einem Gehalt von 0,1 mg lyophilisiertem Thymusfaktor-Polypeptidhormon

Ampulle:

Thymusfaktor-Polypeptidhormon 0,1 mg

Ampulle:

Lösungsmittel: für Injektionszwecke

geeignetes steriles Wasser 1,0 ml

Nach Bedarf verwendet man passende Vielfache der vorgenannten Mengen.

Ende der Beschreibung.

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Claims

Dr. Jean-Prancois Bach und

Dr. Jean Hamburger 2732587 00002IA

Patentansprüche

/ 1. /Thymusfaktor-Polypeptidhormon, das ein fester Stoff ist, ' mit den folgenden Eigenschaften:

a) isoelektrischer Punkt (pi) bei pH 7,5 - 0,1 ,

b) keine Affinität gegenüber Aktivkohle _y

c) Molekulargewicht zwischen 700 und 3000, bestimmt durch Molekularsiebfiltration und Membranfiltration ,

d) wird bei einem pH-Wert unterhalb 7 an Carboxymethylcellulose gebunden ₃

e) wird bei einem pH-Wert von oberhalb 9 an Diäthylaminoäthylcellulose gebunden ,

^' R_-Wert an Celluloseplatten von 0,32 in Methanol/Chloroform/ Ammoniumhydroxid (20:20:9); R_f-Wert von 0,8 in Ο,ΟΙΝ-Essigsäure; R_-Wert von 1,0 in destilliertem Wasser,

g) enthält keine aromatischen Aminosäuren,

h) das Verhältnis Elutionsvolumen/Leervolumen beträgt 2,1 in einer Sephadex-G-25-Molekularsiebsäule in 0,2M Phosphatpuffer bei pH-Wert 7,3.

2. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidhormons mit '..·< thymischer Aktivität, gekennzeichnet durch die folgenden < Stufen:

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ORIGINAL INSPECTED

00002IA 2.

a) Dialysieren von defibriniertem Blutserum unter Ultrafiltrationsbedingungen durch eine Polyacrylnitrilmembran mit einer Permeabilität von 0,36 bis 0,45 ml/min/mm²/mm Hg Druck,

b) Hindurchleiten des Dialysats durch eine Amicon-UM2-Filtermembran, welche den Durchgang von Molekülen mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 zulässt, und Gewinnen des durch die Filtermembran zurückgehaltenen Materials,

c) Chromatographieren des vom Filter zurückgehaltenen Materials an Sephadex G-25 und Eluieren mit 0,2M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,3,

d) Entsalzen dieses Eluats und Chromatographieren des entsalzten Produkts in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,3 an Carboxymethylcellulose und Eluieren mit NaCl-Lösungen abgestufter Konzentration,

e) Chromatographieren dieses Eluats an Sephadex G-25 und Eluieren mit 5-5Siger Essigsäure und

f) Chromatographieren dieses Eluats an Sephadex G-10 und Eluieren mit Wasser.

3. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidhormons mit thymischer Aktivität, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:

a) Dialysieren von defibriniertem Blutserum unter Ultrafiltrationsbedingungen durch eine Polyacrylnitrilmembran mit einer Permeabilität von 0,36 bis 0,45 ml/min/mm²/mm Hg Druck,

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b) Hindurchleiten des Dialysats durch eine Amicon-UM2-Filtermeinbran, welche den Durchgang von Molekülen mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 ermöglicht, und Gewinnen des durch die Filtermembran zurückgehaltenen Materials,

c) Chromatographieren des vom Filter zurückgehaltenen Materials an Sephadex G-25 und Eluieren mit 0,2M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,3,

d) Entsalzen dieses Eluats und Chromatographieren des entsalzten Produkts in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,3 an Carboxymethylcellulose und Eluieren mit NaCl-Lösungen abgestufter Konzentration,

e) Behandeln der aktiven Eluatfraktionen im Rosettentest mit Aktivkohle und Entfernen der Aktivkohle,

f) Chromatographieren des mit Aktivkohle behandelten Materials an Cellulose und Entwickeln zunächst mit Butanol/Pyridin, dann mit 0,01N Essigsäure und mit Methanol/Chloroform/Ammoniumhydroxid (20:20:9) und

g) Unterwerfen der im Rosettentest aktiven Eluate einer Hochspannungs-Papierelektrophorese bei einem pH-Wert von 1,9 und Eluieren mit Wasser.

Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufe f) ausführt an Celluloseplatten mit Butanol/Pyridin (60:30) als Lösungsmittel, woran sich eine zweidimensionale Chromatographie mit 0,01N Essig- ;. säure in der ersten Dimension und mit Methanol/Chloroform/ Ammoniumhydroxid (20:20:9) in der zweiten Dimension und eine Rechromatographie in Methanol/Chloroform/ Ammoniumhydroxid (20:20:9) anschliesst und wobei man

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die Stufe g) bei ¹IO V/cm und hO mA in auf einen pH-Wert von 1,9 verdünnter Ameisensäure durchführt.

5. Arzneimittel aus einer therapeutisch wirksamen Menge des Thymusfaktor-Polypeptidhormons von Anspruch 1 und einem nicht-toxischen, pharmakologisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

6. Thymusfaktor-Polypeptidhormon mit der Aminosäuresequenz: Pyroglutamyl-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn.

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