DE3633797C2 - Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Eiweissen (Peptiden) aus menschlichem und tierischem Blut (bzw. anderen Körperflüssigkeiten) - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Eiweissen (Peptiden) aus menschlichem und tierischem Blut (bzw. anderen Körperflüssigkeiten)Info
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Description
In der heutigen Therapie von Nierenerkrankungen wird als Methode
der Blutreinigung die Hämodialyse bzw. Hämofiltration benutzt, um
harnpflichtige, schädliche Stoffe aus dem Blut zu entfernen. Dabei
wird eine Flüssigkeit aus dem Blut abfiltriert, die alle Moleküle
von einem niedrigerem Molekulargewicht als 20 kDalton enthält.
Diese Flüssigkeit wird gelegentlich in wissenschaftlichen Arbeiten
auf ihre Zusammensetzung hin untersucht. Es ist bekannt, daß die
Filtratflüssigkeit Eiweißmoleküle enthält, die als Wirkstoffe im
Körper zirkulieren. Routinegemäß werden jedoch diese Filtrate
verworfen, wobei bei einem Behandlungstag pro Patient etwa 60 bis
100 Liter Hämofiltrat/Hämodialysat anfallen. Diese wertvolle
Flüssigkeit wird an allen Behandlungsstationen verworfen. Damit
gehen zahlreiche biologische Wirkstoffe verloren, die als Eiweiße
im Blut vorkommen. Sie sind in der Regel schwer herzustellen und
werden nach einigen Verfahren aus den Bildungsorganen extrahiert,
wie z. B. Insulin aus der Bauchspeicheldrüse. Da die Herstellung
dieser Wirkstoffe durch chemische und biologische Synthese
ebenfalls äußerst schwierig und kostspielig ist, und da für die
Reindarstellung der genannten Eiweiße (Peptide) in ihrer
wirksamen, im Blut zirkulierenden Form bislang keine Verfahren
bekannt sind, sollte ein wirksames, gewerblich anwendbares
Verfahren zur Gewinnung dieser Eiweiße in Mikro- bis Makromengen
entwickelt werden.
Die CA 99 : 120342d, beschreibt die Gewinnung von Substanzen mit
Molgewichten von 350 bis 2.000 Dalton, die aus Ultrafiltraten von
Patienten mit chronischem Nierenversagen isoliert wurden. Zur
Reinigung der Eiweiße, Oligosaccharide etc. werden Ionenaustaus
cher-, Aktivkohle- und Papier-Chromatographie verwendet.
Die GB 2 003 887, beschreibt eine Methode zur Isolierung von
physiologisch aktiven Peptiden aus menschlichem oder tierischem
Urin, wobei für die Eiweißfällung ein pH-Bereich von 3,5 bis 5,0
beansprucht und als Fällungsmittel ein mit Wasser mischbarer
Alkohol verwendet wird. Die anschließende Reinigung erfolgt durch
Gel-Chromatograpie.
Es sollte ein einfaches Verfahren entwickelt werden, das erlaubt,
die biologisch wirksamen Eiweiße aus dem Hämofiltrat (bzw.
Hämodialysat) herzustellen. Dabei sollte die biologisch aktive
Form und die Molekülstruktur nicht verändert werden.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß man aus Hämofiltrat
(bzw. Hämodialysat) durch Adsorption gemäß Anspruch 1 und nachfolgende Reinigung die
Eiweiße für ihre Analyse, für die diagnostisch-therapeutische
Anwendung und für gewerbliche Zwecke gewinnen kann. Besonderes
Interesse gilt hier Wirkstoffen wie Herzhormonen, Hormonen des
Verdauungsapparates, Hormonen der endokrinen Drüsen,
Signalüberträgerstoffe des Gehirnes und peripheren Nervensystems.
- 1 Gewinnung eines Hämofiltrates/Hämodialysates, das von menschlichem Blut als Abfallprodukt bei Hämofiltration (bzw. Hämodialyse) Nierenkranker gewonnen wird oder bei Zuchttieren durch Anlegen eines Hämofiltrationsgerätes erhalten wird.
- 2 Konzentrierung der Peptide des Hämofiltrates (bzw. Hämodialysates) durch Absorption und Elution an Trägern, daß z. B. die Peptide in größeren Mengen z. B. aus 1.0-1.000.000 Litern Hämofiltrat (Hämodialysat) in einem Eluat von ca. 0.05-10 Litern angereichert werden.
- 3 Die Peptidfraktion aus der gleichen Filtratmenge wird in lyophilisierter Form erhalten.
- 4 Aus der Filtratmenge werden die gewonnenen Peptide über konventionelle Chromatographieverfahren der Gelfiltration, Immunabsorption und Ionenaustausch weiter in Untergruppen nach Molekulargewicht, Immunoepitopen und physikochemischen Moleküleigenschaften wie Ionenstärke (insbesondere nach ihrer Acidität/Basizitat) aufgeteilt.
- 5 Die Untergruppen der Peptide werden durch weitere Präcipitationsverfahren wie Ethanol-, Methanol- und Ätherfällung in weitere Untergruppen aufgetrennt.
- 6 Die Untergruppen der Peptide werden durch Gelchromatographie, Fast Protein Liquid Chromatographie (FPLC) und High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) in einem oder zwei Reinigungsschritten hochgereinigt erhalten.
- 7 Die gewonnenen gereinigten Peptide werden in ihrer Wirksamkeit auf Targetzellen und über Rezeptorwirkung (auf Erfolgsorgane) auf ihre biologische Bedeutung hin analysiert.
- 8 Die gewonnenen, gereinigten Peptide werden durch Sequenzanalyse in ihrer Struktur aufgeklärt.
- 9 Die Struktur der gewonnenen, einheitlichen Peptide wird durch die Verfahren der Flüssigkeitsphasensynthese, Festphasensynthese und gentechnologischen Synthese in größeren Mengen nachgebaut. Sie sind für gewerbliche Zwecke verwendbar.
- 10 Die extrahierten Peptide werden direkt oder als Syntheseprodukte für die gewerbliche Anwendung benutzt.
- 11 Die extrahierten Peptide werden direkt oder als Syntheseprodukte, z. T. auch als Fragmente, zur Herstellung von heterologen und monoklonalen Antikörpern benutzt, die für die Immunoteste wie Radioimmunoassay, ELISA, und weitere Verfahren der Immunodiagnostik verwandt werden.
- 12 Die Strukturen der extrahierten Peptide werden zur gentechnologischen Weiteranalyse prätranslational synthetisierter Peptide benutzt und diese wie oben bei 9. ff weiter verwandt.
- 13 Die Struktur der extrahierten Peptide wird dazu benutzt, neue, abgeleitete Strukturanaloga durch Modifikation der Aminosäuresequenz zu entwickeln, die, wie oben bei 9. ff geschildert, für gewerbliche Zwecke angewendet werden.
Das Verfahren soll anhand der Erläuterung der Isolierung eines
hormonell wirksamen Peptides, des Cardiodilatin-99-126 (auch als
alpha-ANP - atriales natriuretisches Polypeptid bezeichnet),
dargelegt werden. In einer, dem Erfahrenen vertrauten, ähnlichen
Aufbereitungsweise können jedoch prinzipiell alle anderen, im
Hämofiltrat (bzw. Hämodialysat) vorkommenden Eiweiße isoliert
werden.
Es werden Hämofiltrate (bzw. Hämodialysate) aus menschlichem oder
tierischem Blut in Mengen von 10 bis 1.000.000 Litern
aufgearbeitet.
Die Eiweiße enthaltenden Ausscheidungsflüssigkeit wird angesäuert
und mit Essigsäure und Mineralsäure auf pH 2,7 gebracht und pro
1.000 l werden 2,5 kg Alginsäure oder alternativ mit Kieselgel
(z. B. Aerosil, Firma Degussa) eingerührt. Nach 10 Std. haben sich
die Peptide an die Alginsäure gebunden. Die Alginsäure wird
abfiltriert mit Ethanol oder anderen Fettlösungsmitteln und 0,05 M
Mineralsäure gewaschen. Nach Zugabe von 0,2 M Mineralsäure werden
die Peptide in weniger als 5 Liter angereichert und durch
Salzkuchenbildung bei pH 3.8-4.0 und Kochsalzsättigung erhalten.
Durch Gelfiltration und anschließender Lyophilisation oder durch
Ultrafiltration und anschließendem Lyophilisieren werden die
gesamten Peptide in fester trockener Form gewonnen. Dieses
Lyophilisat enthält alle bekannten und unbekannten Peptide mit
bioaktiven Funktionen, z. B. Cardiodilatin-99-126 (weitere z. B.
Insulin, Glucagon, Sekretin, Gastrin etc.), das durch
Radioimmunoassay oder im Biotest nachgewiesen oder über ein
chemisches oder biologisches Peptidscreening nachgewiesen werden.
Ebenso kann der Eiweißkuchen durch Absorption und Elution an
kommerziellen Reverse-Phase Materialien als Pulverform, Filter
oder an Chromatographiesäulen, z. B. Nucleosil, Sepak c18, etc.,
aus dem Hämofiltrat gewonnen werden.
Durch Dialyse mit kleinporigen Membranen und nachfolgender
Lyophilisation kann ebenfalls eine Anreicherung erreicht werden.
Weiter kann durch Ultrafiltration (Porenweite z. B. 500 Dalton)
und anschließender Lyophilisation eine Anreicherung der Eiweiße
erhalten werden.
Verschiedenen Verfahren der Ionenaustauschchromatographie
ermöglichen eine Trennung in verschiedene Untergruppen der
gewonnen Eiweißmoleküle in großtechnischem Mengen. Säulen mit
einer Kapazität, die Peptide aus 1.000-1.000.000 Liter
Hämofiltrat/Hämodialyseflüssigkeit in einem Chromatographiegang
abtrennen, können kontinuierlich benutzt werden.
In der Regel sind nach der Ionenaustauschchromatographie zwei
weiter Chromatographiegänge notwendig, um die Reinigung auf über
80% Reinheitsgrad zu erreichen, ein dritter Trenngang erreicht
über 95%. Dazu sind Kombinationen von Reversephase-Verfahren der
FPLC und HPLC mit verschiedenen Puffern möglich.
Hierzu sind die Sequenzierverfahren der Peptide mit Gasphase
anzuwenden. In der Regel reichen die Peptide aus 1.000 l
Hämofiltrat aus, um eine Analyse mit kompletter Sequenz zu
erhalten, da fast alle wichtigen Wirksubstanzen im fMol Bereich
zirkulieren und im pMol Bereich durchsequenziert werden können.
Die Testung unbekannter Substanzen wird nach üblichen Verfahren
zum Nachweis der biologischen Aktivität, z. B. im Tierversuch,
durch Organteste oder Gewebsteste, durchgeführt.
Claims (8)
1. Verfahren zur Gewinnung von Eiweißen aus einer bei der
Hämofiltration und/oder Hämodialyse von menschlichem oder
tierischem Blut anfallenden Flüssigkeit, wobei die Eiweiße
aus der Flüssigkeit aus Hämofiltrat und/oder Hämodialysat
durch Zusatz von schwach ionischen Polysäuren bei einem pH unter 7,2 gewonnen
werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Eiweißmoleküle im Körper zirkulierende Wirkstoffe und
Peptidhormone und Neuropeptide, die Körperfunktionen
regulieren, sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die Eiweißmole
küle als Hormone des Verdauungstraktes, wie Insulin,
Glucagon, Secretin, Gastrin, Motilin, Hormone der endok
rinen Organe, Hypophyse, Schilddrüse, Nebenschilddrüse,
Neuropeptide des peripheren und zentralen Nervensystems
gewonnen werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Eiweißmoleküle Cardiodilatin 99 bis 126 oder ANP sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Eiweiße aus anderen Körperflüssigkeiten
gewonnen werden, wie Urin, Ascites, Liquor.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die bei der Hämofiltration
und/oder Hämodialyse anfallende Flüssigkeit aus menschli
chem oder tierischem Blut durch Zusatz von Alginsäuren,
Kieselsäuren gewonnen werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die
Alginsäure im Verhältnis 1000 : 2,5 l/kg dem Hämofiltrat
und/oder Hämodialysat zugegeben wird und der pH-Wert durch
die Zugabe von Alginsäure auf pH 2,7 eingestellt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die
Alginsäure im Verhältnis 1000 : 10 bis 0,1 l/kg dem Hämofil
trat und/oder Hämodialysat zugegeben wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863633797 DE3633797C2 (de) | 1986-10-03 | 1986-10-03 | Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Eiweissen (Peptiden) aus menschlichem und tierischem Blut (bzw. anderen Körperflüssigkeiten) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863633797 DE3633797C2 (de) | 1986-10-03 | 1986-10-03 | Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Eiweissen (Peptiden) aus menschlichem und tierischem Blut (bzw. anderen Körperflüssigkeiten) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3633797A1 DE3633797A1 (de) | 1988-04-07 |
| DE3633797C2 true DE3633797C2 (de) | 1995-08-10 |
Family
ID=6311029
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE19863633797 Expired - Fee Related DE3633797C2 (de) | 1986-10-03 | 1986-10-03 | Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Eiweissen (Peptiden) aus menschlichem und tierischem Blut (bzw. anderen Körperflüssigkeiten) |
Country Status (1)
| Country | Link |
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Families Citing this family (2)
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| DE19615710A1 (de) * | 1996-04-22 | 1997-10-23 | Forssmann Wolf Georg | Verfahren zur Gewinnung und Anwendung eines biologisch aktiven Eiweisstoffes - Kollagenfragment HF-COLL-18/514cf - in partiell aufgereinigter und synthetischer Form aus Körperflüssigkeiten zur Beeinflussung des Zellwachstums und der Diagnose von Kollagenerkrankungen sowie der Osteoporose |
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Also Published As
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|---|---|
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