DE1767477C3 - Thyrocalcitonin und Verfahren zu seiner Gewinnung - Google Patents

Description

2. ß-Thyrocalcitonin der Formel

I ι

H — Cys—Ser—Asn — Leu—Ser—Thr—Cys

— VaI — Leu — Ser — AIa — Tyr — Trp

— Arg — Asn — Leu — Asn — Asn — Phe

— His — Arg — Phe — Ser — GIy — Met(O)

— GIy — Phe — GIy — Pro — GIu — Thr — Pro -NH₂. jo

3. Verfahren zur Gewinnung von Schvveine-Thyrocalcitonin, in welchem man entfettetes Schweine-Schilddrüsengewebe extrahiert und den Extrakt durch Fällung mit Trichloressigsäure oder Aceton, Gegenstromverteilung und Gelchromatographie in beliebiger Reihenfolge oder durch Gegenstromdialyse reinigt, dadurch gekennzeichnet, daß man das entfettete und gegebenenfalls mit Alkohol oder verdünnter wässeriger Trichloressigsäure vorgereinigte Schweine-Schilddrüsengewebe wenigstens einmal mit einem Wasser und ein Niederalkanol enthaltenden Lösungsmiltelsystem bei einem pH von etwa 1 bis 6 extrahiert und das reine Thyrocalcitonin und/oder Thyrocalcitonin-sulfoxid abtrennt.

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Gegenstand der Erfindung sind reines Thyrocalcitonin und ein Verfahren zu seiner Gewinnung. Das »eue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Vorzugsweise entfettetes Schilddrüsengewebe, das gegebenenfalls mit Alkohol oder wäßriger Trichloressig-Säure vorextrahiert ist, ein- oder mehrmals mit einem Wasser und ein Niederalkanol enthaltenden Lösungsmittelsystem bei einem pH von etwa 1 bis 6 extrahiert lind die erhaltene Lösung in üblicher Weise, z. B. wie im belgischen Patent 685 991 beschrieben, auferbeitet.

Das als Ausgangsmaterial verwendete entfettete Schilddrüscngewebe wird in bekannter Weise hergestellt, indem man Schilddrüsen von Säugetieren, wie t. B. Rindern, Schafen, Ziegen, insbesondere Schweiilen, mit einem lipophüen Lösungsmittel, wie z. B. Aceton, bei niedriger Temperatur extrahiert (vgl. belgische Patentschrift 685 991).

Das so erhaltene Pulver kann, wenn erwünscht, mit Alkohol, z. B. 95 bis 96%>igem Äthanol oder mit verdünnter Trichloressigsäure. z. B. einer 15%igcn wäßrigen Lösung von Trichloressigsäure, vorgereinigi werden.

Das im Lösungsmittelsystcm enthaltene Niederalkanol ist z. B. Methanol, Äthanol, Propanol, η-Butanol oder see. Butanol. Der Wassergehalt des Systems kann beispielsweise zwischen 4 und 5O⁰O liegen, vorzugsweise beträgt er 5 bis 30 ",Ό. Das genannte saure pH wird beispielsweise mit anorganischen Säuren wie Schwefelsäure oder Salzsäure oder organischen Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, oder mit sauren Puffern wie Acetatpuffer oder Citratpuffer eingestellt Das Lösungsmittelsysteni kann gegebenenfalls weitere organische Lösungsmittel wie Aceton oder organische Basen wie Pyridin oder Morpholin, und/oder anorganische Salze, wie Natriumchlorid, enthalten Besonders hervorzuheben sind die Systeme n-Butanol-Eisessig-Pyridin-Wasser (17: 12 : 6 : 15), n-Butanol-Eisessig-Wasser (50 : 5 :14), n-Butanol-Eisessie-Wasser (4:1: 5), n-Butanol-Ameisensäure-Wasser^ (50:5:14), Äthanol-0,05 η-Salzsäure (70-30), 80°,üiges oder 95°/oiges Äthanol mit verdünnter 'Salzsäure, Aceton-Äthanol-verd. Salzsäure G : 1 : 1).

' Die Extraktion des entfetteten und gegebenenfalls vorgereinigten Schilddrüsenpulvers wird vorzugsweise unter Sauerstoffausschluß, z. B. in Stickstoffatmosphäre, vorgenommen. (Es ist vorteilhaft, auch die weiteren Aufarbeitungsoperationen unter Ausschluß von Sauerstoff durchzuführen.) Die Temperatur wird zweckmäßig zwischen 0 und 25° C gehalten.

Um die aktive Substanz mit wenig Lösungsmittel möglichst quantitativ zu extrahieren, kann man die Extraktion in mehreren Stufen ausführen. Dabei können die gleichen oder verschiedene Lösungsmittclsysteme zur Anwendung gebracht werden.

Nach der Extraktion wird das zurückbleibende feste Produkt in beliebiger Weise, z. B. durch Filtrieren in Gegenwart eines Filterhilfsmittels oder durch Zentrifugieren, abgetrennt. Aus der Lösung, welche praktisch die gesamte aktive Substanz enthält, wird diese in fester Form erhalten, indem man die Lösun« mit Aceton fällt oder lyophilisiert bzw. einengt und dann gegebenenfalls aus saurer Lösung mit Trichloressigsäure fällt. Die dabei erhaltenen Aceton- oder Trichloressigsäure-Fällungen können einer oder mehreren weiteren Extraktionen mit den erfindungsgemäßen Lösungsmittelsystemen unterworfen werden. Dabei kommt insbesondere 7O°/oiges Äthanol bei pH etwa 4 bis 6 als Extraktionsmittel zur Anwendung. Die genannten Extraktions- und Fällungsoperationen können in beliebiger Weise kombiniert werden.

Das Rohprodukt wird in üblicher Weise, z. B. durch Lyophilisieren, partielles Eindampfen, Fällen, Dialyse, Gegenstromverteilung, Chromatographie, Ionenaustausch, Elektrophorese, weiter gereinigt.

Die Dialyse wird vorzugsweise nach dem Gegenstromprinzip durchgeführt. Man verwendet dafür beispielsweise einen »Gegenstromdialysator«, wie er in Fig. 1 schematisch dargestellt ist.

Er besteht aus zwei spiegelbildlich gerillten Platten, P₁ und P_n, z. B. aus Kunststoff, die beide plangeschliffen sind und mittels Schrauben dicht zusammengepreßt werden. Durch Zwischenlegen einer Membran M, z. B. aus Cellophan. entstehen zwei Zirkulationssysteme, I und II, deren Anschlüsse nach außen (Z₁ und A, = Zufluß und Abfluß der zu dialysiercnden Lösung; Z₁₁ und A_n= Zufluß und Abfluß des Lösungsmittels) in die Platten eingebaut sind. Durch System I zirkuliert die zu dialysierende Lösung, während durch System TI im Gegenstrom das Lösungsmittel geleitet wird. Der Austausch der Stoffe, z.B. dialysierbare Peptide, Salzionen, vollzieht sich längs des gesamten Zirkulationsweges. Die Gesamtlänge ist durch entsprechende Zapfstellen so unter-

leilt, daß, wenn erwünscht, ⁵/_β, V₃, V₂, »/a oder >/» j_er Gesamtlänge zur Verfügung stehen. Der Quer- !chnitt der Rillen beträgt bei der verwendeten Appafatur 5 X 1 mm, die Gesamtlänge der Rillen 20 m (Fiillvolumen einschließlich der Zuleitungen 120 ml). purch verschiedene Zirkulationsgeschwindigkeiteii (und/oder Verkürzung des Zirkulationsweges) der mittels Schlauchpumpen kontinuierlich durch die Apparatur gepumpten Lösungen und durch geeignete Wahl der Membran kann die Dialyse so reguliert werden, wie es dem jeweiligen zu dialysiei enden Rohprodukt entspricht, bis eine genügende Fraktionierung erreicht ist. Das erhaltene Produkt kann, wenn erwünscht, auf anderem Wege, z. B. durch Craig-Verteilung oder Gel-chromatographie, weitergereinigt werden.

Bei weitgehender Reinigung des Thyrocalcitonins wird es in verschiedene aktive Komponenten aufgespalten, unter anderem in die Komponenten *-Thyrocalcitonin und /J-Thyrocalcitonin. a-Thyrocalcitonin ao wird bei der Chromatographie an A!uminiumoxyd teilweise in 2 Komponenten (I₁ und λ.,) aufgespahen. die mit *-Thyrocalcitonin und /i-thyrocalcitonin identisch sind. /i-Thyrocalcitonin ist das Sulfoxid von rt-Thyrocalcitonin.

Beispiel 1

10 kg mit Aceton entfettetes Schweineschilddrüsengewebe werden mit 100 und dann mit 50 1 Lösungsmittelsystem I (= 68 1 n-Butanol + 48 1 Pyridin + 24 1 Eisessig + 60 1 bidestilliertes Wasser; pH = 5,2) in Stickstoffatmosphäre 2 Stunden gerührt und unter Zusatz von 1 bzw. 0,5 kg Filterhilfsmittel filtriert und mit 25 1 Lösungsmittel I gewaschen. Die vereinigten Lösungen (1751) kühlt man auf 8' ab, gibt unter Rühren in Stickstoffatmosphäre 875 1 auf

— 20° gekühltes Aceton hinzu und rührt noch 3 Stunden weiter. Man läßt die Mischung über Nacht bei

— 10° stehen, filtriert dann die Fällung ab und wäscht sie mit 101 kaltem Aceton nach. Der feuchte Filterrückstand (2,82 kg, Trockengehalt 31,4 °/o) wird unter Rühren in 75 1 0,025 η-Salzsäure gelöst und auf 0° abgekühlt. Darauf gibt man im Verlauf 1 Stunde unter Rühren 7,5 kg feste Trichloressigsäure zu der Lösung, rührt noch 16 Stunden bei 0 bis 5° und zentrifugiert dann den Niederschlag auf einer Durchlaufzentrifuge ab. Der ZentrifugenrücWand wird mit 2,651 kalter lO°/oiger TrichloressigsäurelÖsung, anschließend 5mal mit je 3 1 eiskaltem Aceton und dann noch mit 3 1 eiskaltem Äther gewaschen. Nach Trocknen bei 25 bis 30° während 48 Stunden erhält man 305 g eines beigefarbenen Produktes mit einer Aktivität von 9 MRC-Einheiten pro Gramm Acctontrockenpulver. (Die Aktivität wurde nach Kumar et. al.. J. Endocrin. 33 [1965], 470 bestimmt.) Die weitere Reinigung kann wie im Beispiel 2 gezeigt, durchgeführt werden.

Beispiel 2

103 g entfettetes (Aceton-getrocknetes) Schweineschilddrüsengewebe werden unter Sauerstoffausschluß 24 Stunden lang auf der Schüttelmaschinc mit 1,5 I Lösungsmittelsystem II ( = 75 1 n-Butanol -1-7,5 1 Eisessig + 211 bidestilliertes Wasser; pH = 2,8) bei Zimmertemperatur geschüttelt. Man zentrifugiert den festen Rückstand ab (! Stunde, 2500 · g), extrahiert ihn in der beschriebenen Weise mit 750 ml Lösungsmittel II während 5 Stunden, zentrifueiert und extrahiert den Rückstand wiederum, und zwar mit 375 ml während 12 Stunden. Die vereinigten Lösungen (2350 ml) kühlt man auf 0° ab und versetzt sie unter Rühren mit 12 1 eiskaltem Aceton. Man rührt die Mischung noch 1 Stunde weiter und läßt sie dann 24 Stunden bei - 10° stehen. Es setzt sich allmählich ein schwach rosa gefärbter Niederschlag ab. Er wird durch Dekantieren und Zentrifugieren bei 0 bis 5 abgetrennt, zweimal mit je 80 ml eiskaltem Aceton gewaschen und wiederum abzentrifugiert. Den so erhaltenen Rückstand extrahiert man bei Zimmertemperatur 5mal mit je 50 ml 0,05 η-Salzsäure, voreinigt die Extrakte und befreit sie durch Zentrifugieren von unlöslichen Anteilen. Zu der auf 0° abgekühlten Lösung fügt man unter Rühren 24 g feste Trichloressigsäure, rührt 14 Stunden bei 0 bis 5 ' und zentrifugiert die feine Fällung (mit etwa 4500 · g) ab. Sie wird zuerst mit 20 ml eiskalter lO'V'oiger Trichloressigsäure und dann 4mal mit je 70 ml eiskaltem Aceton gewaschen. Den Rückstand extrahiert man unter Rühren bei Zimmertemperatur mit 100 ml 70°/uigem Äthanol, zentrifugiert (mit etwa 4500 · g) vom unlöslichen Anteil ab und extrahiert diesen mit weiteren 50 ml 70^u/ijigem Äthanol. Die beiden Extrakte werden vereinigt und im Rotationsverdampfer bei etwa 12 mm Hg auf 25 ml eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird auf 0 ' abgekühlt, unter Rühren tropfenweise mit 25 ml eiskalter 25"/niger Trichloressigsäure versetzt und noch 18 Stunden unter Ausschluß von Luft bei 0° weitergerührt. Dabei bildet sich allmählich eine feine Fällung, die durch Zentrifugieren (1 Stunde, 5000 · g) bei 0 bis 5" abgetrennt wird. Sie wird zuerst mit 10 ml eiskalter lOVoiger Trichloressigsäure und anschließend 4mal mit je 40 ml eiskaltem Aceton gewaschen. Den Rückstand trocknet man im Vakuum bei Zimmertemperatur und erhält so 400 mg eines hellgefärbtcn Pulvers. Die Aktivitätsausbeute beträgt 8 MRC-Einheiten pro Gramm Acetontrockenpulver.

25 g der wie beschrieben gewonnenen Fällung werden mit 1500 ml der unteren Phase des Lösungsmittelsystems III (= n-Butanol-Eisessig-Wasscr [4:1 :5. alles Volumteilel) mit Zusatz von 0.5 g Natriumchlorid pro Liter System unter Sauerstoffausschluß gelöst und auf die ersten drei Röhren eines Craig-Gegenstromverteilungsautomaten verteilt. Weitere 30 Röhren werden mit je 500 ml der gleichen unteren Phase beschickt, worauf man die Apparatur mit Stickstoff füllt und den Verteilungsprozeß mit je 500 ml der oberen Phase pro Rohr über 33 Röhren durchführt. Nach beendeter Verteilung werden aliquote Teile von oberer und unterer Phase lyophilisiert und biologisch getestet. Die aktivsten Lösungen befinden sich in den Röhren 25 bis 33. Sie werden vereinigt, auf ein Zwanzigstel ihres Volumens eingeengt, durch Zentrifugieren von ausgefallenem Material befreit und mit 15 Gewichtsprozent fester Trichloressigsäure versetzt. Man läßt noch einige Stunden bei - -10° stehen, zentrifugiert dann die Fällung ab und wäscht sie zuerst mit 2O^o/oipcr Trichloressigsäure, dann zweimal mit Aceton-Äther (1 :1). Der noch Acetonfcuchlc Rückstand wird sodann mit der etwa lOOfachcn Mcncc 0.1 n-Amciscnsäure 1 Stunde i'iitcr Stickstoff verrührt. Man zentrifugiert ab, wobei sieb '..Ip unlösliche Anteile abscheiden, und lyophilisicri die klare Lösung. Das farblose Lyophilisat (2^f)5 mg' enthält 20 MRC-Einheiten pro mg.

20 mg dieses Lyophilisates werden in 2 ml 0.1 η

Ameisensäure gelöst an Polyacrylaniid-Gel in 0,1 n-Ameiscnsäure chromatographiert. (Säulenvolumen 28 ml; Fraktionen ä 1,5 ml; Durchfiußgeschwindigkeit 0,1 ml/Min.)· Die durch ein registrierendes UV-Durchflußphotometer (254 nm) laufenden Fraktionen werden tierexperimentell getestet und chromatographisch (Dünnschichtchromatographie an Aluminiumoxyd, Silicagel und Polydextran-Gel) und elektrophoretisch (Disc-Elektrophorese nach R c i s f e 1 d et al., Nature 195 11962], 281) geprüft. Die aktivsten Fraktionen enthalten 1,5 mg Thyrocalcitonin einer Aktivität von lOOMRC-Einheiten/mg. Das Produkt wird einer weiteren Craig-Verteilung über 250 Stufen im System n-Butanol-N-Essigsäure (1:1) unter Zusatz von 250 mg Ammoniumacetat pro Liter beider Phasen unterworfen. Dabei zeigt sich eine Aufspaltung in verschiedene aktive Produkte, zur Hauptsache (v-Thyrocalcitonin (Verteilungskoeffizient bei 20° fcsoo ₌ Q₈₂) _und ^-Thyrocalcitonin (fc²"° = 0,29). Im Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd im System Chloroform-Methanol-17°/oiges Ammoniak (41 :41 : 18) weist /J-Thyrocalcitonin einen R_s-Wert (S = Standard = «-MSH-Sulfoxyd = 1) von 0,85 auf, während a-Thyrocalcitonin sich in 2 aktive Komponenten, α, und <*., aufspaltet;

R_Sai = 0,97; R_s^ = 0,88;

im System II werden folgende i?_s-Werte gefunden: Rsfi= 1,0;

R_Sai = 1,09; Rs^ = 1,0.

Eine ähnliche Reinigung erzielt man, wenn man dieses Produkt in einer 300stufigen Craigapparatur (obere und untere Phase je 3 ml) im System III unter Zusatz von 0,15 g Natriumchlorid pro Liter System gegenstromverteilt. Dann werden die aktivsten Fraktionen durch eine Gel-Fraktion an Polydextran-Gel bzw. Polyacryl-Gel von Salzen befreit. Das so gereinigte κ- bzw. /J-Thyrocalcitonin weist eine Aktivität ₄„ von 200 MRC-Einheiten/mg auf und ist chromatographisch und elektrophoretisch homogen.

Beispiel 3

200 g Aceton-getrocknetes Schweineschilddrüsengewebe werden sukzessive mit 3000, 1500 und 600 ml Lösungsmittel II (vgl. Beispiel 2) extrahiert, wobei der unlösliche Teil jeweils durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Die vereinigten Extrakte (4,61) liefern bei der Fällung mit 231 eiskaltem Aceton (analog Beispiel 2) 37 g Aceton-feuchten Rückstand. Dieser wird zuerst mit 500 und dann mit 250 ml 7O°/oigem Äthanol unter Zugabe von soviel Lösungsmittelsystem IV (= 70 ml absolutes Äthanol + 30 ml 2n-Salzsäure), daß das pH zwischen 5,0 und 6,0 liegt (gemessen mit einer üblichen Glaselektrode), extrahiert. Man zentrifugiert die beim genannten pH unlöslichen Anteile ab und engt die vereinigten Extrakte (730 ml) im Rotationsverdampfer auf 145 ml ein. Mit 1,45 ml 2 η-Salzsäure wird die entstandene Trübung wieder aufgelöst. Nach Abkühlen auf 0° fügt man 14,7 g feste Trichloressigsäure zu der Lösung, zentrifugiert die Fällung ab, wäscht mit Aceton und trocknet wie in Beispiel 2. Man erhält so 800 mg eines in 0,1 n-Amcisensäurc gut löslichen Produktes, das wie im Beispiel 2 aufgearbeitet werden kann. Die Aktivitätsausbeutc beträgt 8 MRC-Einhcitcn pro Gramm Acctontrockcnpulvcr.

Beispiel 4

a) 200 g entfettetes Aceton-gelrocknetes Schweineschilddrüsengewebe wird mit 21 7O°/oigem Äthanol bei 20° unter Stickstoff verrührt und tropfenweise mit soviel Lösungsmittelsystem IV (vgl. Beispiel 3) versetzt, daß das mit einer Glaselektrode gemessene pH eine halbe Stunde bei 5,8 konstant bleibt. Dann gibt man unter Rühren nochmals 21 70°/oiges Äthanol zu, rührt noch 1,5 Stunden weiter und trennt den unlöslichen Teil mittels einer Glasfilternutsche ab. Er wird bei einem pH von 5,8 bis 6,0 zuerst mit 1000 und hierauf mit 500 ml 7O°/oigem Äthanol extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden im Rotationsverdampfer im Vakuum auf 1,2 Liter eingedampft und dann lyophilisiert. Man löst das Lyophilisat in 500 ml 0,02 n-Salzsäure, nitriert durch ein Wattefilter, kühlt, auf 0° und fällt mit 50 g fester Trichloressigsäure wie im Beispiel 2 beschrieben. Nach Waschen mit Aceton und Trocknen wie im Beispiel 2 erhält man 600 mg Rohprodukt. Die Aktivitätsausbeute beträgt 6 MRC-Einheiten pro Gramm Acetontrockenpulver.

b) Man läßt 80 g Polyacrylamid-Gel über Nacht in 0,1 η-Ameisensäure quellen und füllt das Gel in ein Chromatographie-Rohr (innerer Durchmesser 2,5 cm), so daß es in gesetztem Zustand eine Höhe von 94 cm erreicht (Gesamtvolumen des Gelbettes 460 ml). 600 mg des nach a) erhaltenen Rohproduktes werden in 20 ml 0,1 η-Ameisensäure gelöst, auf die Gelsäule gebracht und mit 0,1 η-Ameisensäure eluiert. Das Eluat wird durch ein registrierendes Durchfluß-UV-Photometer (254 nm) geleitet und in Fraktionen von je 15 ml gesammelt. Die Eluate werden dünnschichtchromatographisch an Polydextran-Gel in 0,1 n-Ameisensäure (mit Chlor-Tolidin-Reagens) analysiert sowie biologisch geprüft. Das Aktivitätsmaximum liegt bei einem Eluatvolumen, das 0,8 Säulenvolumen entspricht. Die Fraktionen werden einzeln lyophilisiert und liefern 70% der Gesamtaktivität; die besten Fraktionen weisen eine Aktivität von 40 MRC-Einheiten/mg auf. Das Molekulargewicht dieser aktiven Stoffe liegt unter 5000. Das Produkt kann durch multiplikative Verteilung und/oder Gelchromatographie weitergereinigt werden. Zu diesem Zweck werden je 2 bis 5 g des angereicherten Materials einer Gegenstromverteilung über 250 bis 300 Stufen im Sytem n-Butanol-Methanol-0,1 n-Essigsäure (4 :1 : 5) unterworfen. Nach biologischer und chromatographischer Kontrolle erhält man 2 aktive Fraktionen mit K-Werten von etwa 0,5 und 1,5. Sie werden einer weiteren Polyacrylamid-Chromatographie in 0,1 n-Ameisensäure unterworfen, worauf die spezifische Aktivität auf etwa 80 MRC-Einheiten steigt. Diese Fraktionen enthalten noch Trichloressigsäure, die, wenn erwünscht, durch Ionenaustausch in 0,1 nessig- oder ameisensaurer Lösung an stark basischem Polystyrolharz entfernt wird. Zur weiteren Reinigung verteilt man 100 bis 500 mg des 50- bis 70°/oigen Produktes im Gegenstrom über 800 bis 1100 Stufen unter ständiger chromatographischer und elcktrophoretischer Kontrolle. Als System dienen z. B. n-Butanol-n-Essigsäure (1 :1) mit 0.25 g Ammonacetat/ Liter oder n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:5) bis (5:1:4). Nach wiederholter Lyophilisation erhält man chromatographisch und elektrophoretisch einhcitl'ches λ- und fl-Thyrocalcitonin einer spezifischen Aktivität von je 200 MRC-Einheiten/mg Trockensubstanz; beide Peptide sind als Acetate leicht, als

Trichloracetate relativ schwer löslich. /5-Thyrocalcitonin ist gegen milde Oxydation mit Perameisensäure stabil, während a-Thyrocalcitonin in ein stärker polares Produkt (a₂) übergeht, das sich chromatographisch von /J-Thyrocalcitonin nicht unterscheiden läßt. Durch chromatographischen Vergleich der Trypsin-Abbauprodukte läßt sich nachweisen, daß sich ß-Thyrocalcitonin von α-Thyrocalcitonin nur durch den Gehalt an Methioninsulfoxid statt Methionin unterscheidet. Der Trypsin-Abbau ergibt 3 Bruchstücke, die durch Gegenstromverteilung im Ammonacetatsystem getrennt und rein isoliert werden können. Die Bruchstücke sind biologisch nicht mehr aktiv. Nach Aminosäureanalyse (s. Tabelle 1) bildeten sich je ein Hcpta-, Undcca- und Telradecnpeptid. Der durch Methionin/Methioninsulfoxid bedingte Unterschied von λ- und /?-TC kommt nur im Bruche stück Tr_s zur Geltung. Es ergibt sich, daß «-Thyrocalcitonin ein lineares Dolriacontapepüd mit einem -S-S-Ring ist. Die Formel des (\-Thyrocalcitonins ist

H—Cys—Ser—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys

— VaI — Leu — Ser — Al a — Ty r — Trp

— Arg—Asn — Leu — Asn — Asn — Phe

— His — Arg — Phe — Ser — GIy — Met

— GIy — Phe — GIy — Pro — GIu — Thr

— Pro — NH₁.

Tabelle I
Analytische Daten für «-TC und a-TC-sulfoxid (=/?-TQ, sowie deren tryptische Fragmente

	a-TC und a-TC- sulfoxid	a-TC oxidiert	Tr,	Tr, oxidiert	Tr,	Tr,	Tr,- salfoxid	0 0	1 1125	I 1141
Trpi)	1 1	—*)	1 0	—	0 1	0 0 1	0,57 0,78 1,6 1,	0,40 0,73 1,9 6
His	2 4 2	4 2	1 1 1	1 1	1 3 0	1
Arg	4	4	3	3	0	1
Asp/Asn . . ...	1	1	0	0	0	2
Thr	2	2	0	0	0	3 0
Ser	3 1	3 1	0 1	0 1	0 0	0 0 0
Glu/Gln	1.3 O 1	0 2 1	1,2 0 1	0 2 1	ooo	1
Pro .. ...	1	0	0	0	0	0 0
GIy	O 3	1 3	0 2	0 2	0 i	0
AIa	1	0,5	1	0,8	0	2
Vs/Cys)2	3	3	0	0	1
Cys(O,H)	3 3604	2 3620	14 1601		7 914
VaI	0,56 0,54 1,1 2,	0,51 0,48 1,5 9	0,53 0,51 1,6 2,5		0,29 0,24 5,3 4,7
Met
Met(O,)
Lee ..
Tyr
Phe
Total Aminosäuren ... Molgewichtsprozent be rechnet
Dünnschichtchromato- graphies) BuOH — AcOH — H.O (75:7,5: 21) MeOH-CHCL1 -NH4OH 17%ig (41:4L: 18)
Elektrophorese 4) auf Celluloseacetat.. auf Avicel-Cellulose

^l) Spektraphatometrisch bestimmt.

*) — bedeutet nicht bestimmt

») Rf-Werte auf Aluminiumoxid.

*) pH = 1,9; 90 Min.; 9 Vait/cm. Die Zahlen bedeuten kathodisch«! Laufstrecken in cm.

Beispiel 5

20 g acetongetrocknetes Schweineschilddräsen gewebe werden in analoger Weise wie in Beispiel 2 beschrieben mit der oberen Phase des Lösungsmittelsystems V (= 75 Liter n-Buranol + 7,5 Liter Ameisensäure -t- 21 Liter bidestilliertes Wasser) extrahiert. Gleiche Aufarbeitung des Extraktes wie im Beispiel 4 ergibt ein Rohprodukt mit einer Aktivitätsausbei von 7 MRC-Einheiten pro Gramm Acetontrockc pulver.

Beispiel 6

500 kg tiefgefrorene Schweineschilddrüsen werd in einer Fleischhackmaschine zerkleinert und 400 Liter auf —10° vorgekühltes Aceton, in w

ίη?Λ?< ^Natri"^^äthy^l^^amⁱⁿtftraacetat gelöst suid, eingetragen Der entstehende Bm wird in einen

5,4 und rührt unter Stickstoffatmosphäre 15 Minuten Anschließend gibt man noch 200 Liter 70Viges

=efLf_mlr_PÄ

gerührt und dann stehengelassen, so daß sich die imlöslichen Anteile absetzt. Die überstehende, St

^S^ eter S?" ^

480 Liter Aceton nochmals 4 Stunden bei RaumteT-peratur in Stickstoffatmosphäre gerührt. Nachstehenlassen wird die überstehende Lösung abgesaugt und der Rückstand zentrifugiert. Die vereinigen fisun gen (2800Liter) enthalten die Hauptmenfe des Z-rocalcitonins (etwa 75 bis 80V.). Sie wfrden unter Rühren langsam mit konzentrierter Natronlauge !ersetzt, bis das pH mit der Glaselektrode gemessen auf 2,9 bis 3,0 konstant bleibt. Bei einem Vakuum von 20 bis 40 mm Hg wird bei einer maximalen Badtemperatur von 30° auf die Hälfte eingedampft Das Konzentrat wird mit 2800Liter NlethylenchloS 1 Stunde gerührt und 4 Stunden stehengelassen Die obere, leicht gelb gefärbte wäßrige Phase wi?d 2 gesogen, die Methylenchloridphase mit 200 Liter

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Vakuum (20 bis 40 mm Hg) bei 25° von organischen Lösungsmitteln vollständig befreit, auf 700 Liter konzentriert und auf 5° abgekühlt. Mit 2,7 Liter konzentrierter Salzsäure wird das pH auf 1,5 gestellt und 84 kgTrichloressigsäure portionenweise unter Rühren in Stickstoffatmosphäre im Laufe von 2 Stunden zu der bei 0 bis 5° gehaltenen Lösung zugegeben. Die Lösung, in der sich allmählich ein feiner Niederschlag bildet, wird 6 Stunden in der Kälte stehengelassen. Die Fällung wird in einer Zentrifuge von der gelbgefärbten Lösung getrennt. Es werden 760 e einer dunkelgefärbten, klebrigen Masse erhalten, dil mit 4,5 Liter eiskaltem Aceton verrieben wird' In der dunkelgefärbten Acetonlösung bildet sich ein sandfarbenes Pulver. Unter Rühren werden 4,5 Liter auf -10° abgekühlter Äther zugegeben und diese Mischung bei - 10° stehengelassen. Der durch Zentrifugieren gewonnene Rückstand wird noch zweimal mit kaltem Äther gewaschen und bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Das Trockenpulver (335 g) enthält 2 MRC-Einheiten pro Gramm tiefgefrorener Schweineschilddrüse. Es kann wie im Beispiel 2 beschrieben weitergereinigt werden.

Beispiel 7

Man rührt eine Suspension von 40 kg mit Aceton entfettetem Schweineschilddriisengewebe in 400 Liter absolutem Äthanol, deren pH mit konzentrierter HCl auf 6,5 eingestellt ist, 2 bis 3 Stunden Lei Raumtemperatur. Durch Zentrifugieren trennt man etwa 360 Liter ab. Das vorextrahierte, noch etwa 40 Liter Äthanol enthaltende Produkt wird in eine Mischung von 140 Liter absolutem Äthanol und 60 Liter 0 05 η Salzsäure eingetragen; den pH-Wert von 6,3 'senkt man unter Zugabe von etwa 5 Liter einer Mischung von absolutem Äthanol und 5 n-Salzsäurc (7 · 3) auf

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d£«ltSr

. _n — bei Raumtemperatur getrocknet. Aus-

Deute: 20g eines hellen Pulvers mit etwa 6 MRC-Das Produkt kann durch Gelchroma- - im Beispiel 4 b) beschrieben oder yegenstromdialyse wie im Beispiel 8 beschrieweitergereinigt werden.

Beispiel 8

H,,w^{g 6}I"^ x^{ach Beis}P^ie* 4 a) gewonnenen Rohproduktes (O,9MRC-Einheiten/mg) werden in 20OmI tu (Sn ^sen?^aure gelöst und von unlöslichen An- « ETA!?' ^{auf der} Zentrifuge (1 Stunde, 5000 g) befreit. D.e klare Lösung zeigt ein pH 2,65. Sie wird m.t emer Geschwindigkeit (F₁) von 36 ml/h in dem •""Msensäure vorgewaschenen Gegenstrom-¹S-O gegen 0,1 η-Ameisensäure mit N=,^ _■· '^indlS^keit (^vu) von 365 ml/h geleitet. y£h, ♦" ^dle 8^esamte zu dialysierende Lösung im Zirkulation^ystem I eingeströmt ist, wird noch mit 3fimS.\^{( Fullvolume}n) 0,1 η-Ameisensäure (F₁ = 36 ml/h) weiter dialysiert. Durch Einengen unter Vakuum _m Rotationsverdampfer und Lyophilisation '*"*"' werden aus dem Zirkulations-. --_. 1090 ml) 272 mg einer dunkelbrau-Masse erhalten, welche, 0,W₀Jg in 0,1 n-AmeiemhälT ^{8 mind}estens 3 MRC-Einheiten/mg

«o Die Lösunp aus dem Zirkulationssystem I (330 ml), 5 in gleicher Weise gegen 0,1 n-Amei-/siert. Das Lyophilisat aus dem Synach dieser zweiten Dialyse wiegt 52 mg und ist mindestens so aktiv wie der dialysierbare Anteil . Uialyse. Es werden also 324 mg rohes Thyroitonm, frei von hochmolekularen Stoffen, gewon-

cit^Ä" ^?.'-^{d etWa 5O}°^{/o der} gesamten Thyrocalcitonmaktivitat enthalten.

./t

Beispiel 9

25 g eines mit Trichloressigsäure gefällten, durch Verteilung vorgereinigten Produktes mit 3 MRC-Einheiten/mg werden in 2S00 ml 0,01 η-Salzsäure gelöst. Die nitrierte Lösung wird zwecks Entfernung von Trichloressigsäure dreimal mit dem gleichen Volumen Diäthyläther ausgeschüttelt, nachdem das pH vor der letzten Extraktion von 3,4 auf 2,5 gesenkt wurde. Die kaum gefärbte wäßrige Phase wird im Vakuum vom Äther befreit und im Gegenstromdialysator (v_t = 163 ml/h) gegen bidestilliertes Wasser (^rn ⁼ 365 ml/h) dialysierL

Die aus dem Zirkulationssystem II gewonnene Lösung (4480 ml) wird im Vakuum auf 140 ml eingeengt und zweimal mit dem gleichen Volumen Diäthyläther extrahiert. Aus der von Äther befreiten wäßrigen Phase werden durch Lyophilisation 2,95 g rohes Thyrocalcitonin gewonnen (5 MRC-Einheiten/mg).

Die im Zirkulationssystem I erhaltene Lösung (2,6 Liter) wird im Vakuum auf 1,5 Liter eingeengt und zweimal mit je I Liter Äther ausgeschüttelt. Man füllt die von Äther im Vakuum befreite wäßrige Phase, welche ein pH von 3,2 zeigt, mit bidestilliertem Wasser auf 1500'ml auf und dialysiert sie (v_t = 121 ml/h) gegen bidestilliertes Wasser (v_n = 365 ml/h).

Die aus dem Zirkulationssystem Π gewonnene Lösung (4530 ml) ergibt 1,6 g angereichertes Thyrocalcitonin mit 10 MRC-Einheiten/mg. Man dialysiert die aus dem Zirkulationssystem I gewonnene Lösung (1730 ml), der man 17,3 ml 1 η-Ameisensäure zufügt, um das pH von 4,4 auf 3,4 einzustellen, gegen 0,001 η-Ameisensäure (V₁ = 82 ml/h; v_n = 365 ml/h). Aus dem Zirkulationssystem Π werden aus 5,3 Liter Lösung noch 642 mg angereichertes Produkt mi einer Aktivität von 9 MRC-Einheiten/mg gewonnen

Beispiel 10 S

Eine aus 450 g Acetontrockenpulver von Schweine-Schilddrüsen nach Beispiel 4 a) erhaltene Trichlor essigsäurefällung wird, ohne mit Aceton gewascher zu sein, nacheinander mit 80 ml und 40 ml 0,1 πιο Ameisensäure und mit 10 ml 0,1 η-Salzsäure geschüttelt und zentrifugiert. Die überstehenden Lösungen werden vereinigt und mit 0,01 n-Ameisensäurc auf 200 ml ergänzt. Die Lösung, deren pH = 2,4 ist, wird im Gegenstromdialysator gegen 0,01 n-Ameisensäure dialysiert (V₁ — 121 ml/h; v_n = 365 ml/h). Aus dem Zirkulationssystem Π werden 1,1g Produkt gewonnen, das etwa 30°/» Trichloressigsäure enthält und biologisch inaktiv ist. Die Lösung aus dem Zirkulationssystem I (360 ml) wird mit 0,01 n-Ameisen-SO säure auf 400 ml ergänzt und nochmals gegen 0,01 n-Ameisensäure dialysiert fo = 121 ml/h; υ_π = 365 ml/h). Aus dem Zirkulationssystem Π erhält man 213 mg aktives Produkt. Durch nochmalige Dialyse der auf 200 ml eingeengten Lösung aus dem Zirkuas lationssystem I gegen 0,01 n-Ameisensäure (V₁ = 36 ml/h; v_n = 365 ml/h) werden 62 mg gereinigtes Thyrocalcitonin mit 30MRC/mg erhalten. Die aus dem Zirkulationssystem I gewonnene Lösung (386 ml) wird im Vakuum auf 200 ml eingeengt und nochmals gegen 0,01 η-Ameisensäure dialysiert (vj = 36 ml/h; ν_ιτ — 365 ml/h). Die Lösung aus dem Zirkulationssystem II ergibt 42 mg aktives Produkt und diejenige aus dem Zirkulationssystem I 173 mg Produkt, letzteres ist wesentlich weniger aktiv als die dialysierbaren Anteile der 2. bis 4. Dialyse.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. a-Thyrocalcitonin der Formel

, 1

H—Cys—Ser—Asn — Leu —Ser—Thr— Cys

— VaI — Leu — Ser — AIa — Tyr — Trp

— Arg — Asn — Leu — Asn — Asn — Phe

— His — Arg — Phe — Ser — GIy — Met — GIy

— Phe — GIy — Pro— GIu — Thr— Pro -NH₅.