DE2855827C2

DE2855827C2 - Verfahren zur Gewinnung von Human-Chorion-Somatomammotropin

Info

Publication number: DE2855827C2
Application number: DE2855827A
Authority: DE
Inventors: Paolo Siena Neri; Berislay Pende
Original assignee: Istituto Sieroterapico E Vaccinogeno Toscano "sclavo" Spa Siena It
Current assignee: Istituto Sieroterapico E Vaccinogeno Toscano "sclavo" Spa Siena It
Priority date: 1977-12-27
Filing date: 1978-12-22
Publication date: 1986-06-12
Also published as: DE2855827A1; FR2413363B1; GB2010849A; IT1114943B; JPS6157290B2; NL7812567A; FR2413363A1; GB2010849B; ES476706A1; AR231990A1; CA1113859A; BE873094A; JPS5498309A; US4219467A

Description

in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8 bis 9 löst, aus der trüben Lösung Feststoffe und kolloidale Aggregate durch Zentrifugieren abtrennt und die dabei erhaltene klare Lösung über eine Filterpresse abzieht,
das Filtrat von a) durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Rückhaltgrenze von 10 000 Dalton und Kontakt mit Ionenaustauschern wiederholt reinigt und einengt und

das Konzentrat von b) nach einer weiteren Ultrafiltration auf eine Chromatographiesäule aufbringt, einen Puffer von pH-Wert 8 bis 9 zugibt und das so erhaltene chromatographische Profil in drei Fraktionen auftrennt, von denen man die erste, die kein HCS enthält, verwirft, die zweite, die HCS mit einer Reinheit von 50% enthält, über eine weitere Ultrazentrifuge und eine weitere Chromatographiesäule führt, wo man die Fraktion mit hohem Molekulargewicht verwirft und die zweite Fraktion, die HCS mit einer Reinheit von mehr als 90% enthält, mit der aus der ersten Chromatographiesäule stammenden dritten Fraktion, die ebenfalls HCS mit einer Reinheil von mehr als 90% enthält, zusammenführt und gefriertrocknet.

Human-Chorion-Somatomammotropin (das im folgenden als HCS bezeichnet wird) ist ein hormonelles Protein, das in der menschlichen Placenta enthalten ist, und das therapeutisch angewandt werden kann, wenn ein Abort zu befürchten ist, oder in einer anderen pathologischen Situation in der Schwangerschaft.

Es konnte gesichert werden, daß HCS ausschließlich durch die Placenta synthetisiert wird: es besitzt verschiedene biologische Aktivitäten und es wird angenommen, daß es einen wesentlichen Einfluß auf die Regelung des Anabolismus während der Schwangerschaft besitzt.

Die bisher bekannten Verfahren zur Extraktion von HCS ermöglichen keine Gewinnung von Produkten mit einer ausreichenden Reinheit, mit deren Hilfe es möglich ist, chemische Untersuchungen im großen Maßstab durchzuführen, um eine praktische Anwendung eines derartigen Hormons zu erreichen. Derartige Verfahren beruhen hauptsächlich auf einer ersten Extraktion mit Salzlösungen und anschließende Ausfällung mit kaltem Äthanol. Der Niederschlag wird erneut gelöst und mit Ionenaustauschern und durch Elektrophorese fraktioniert. Unter anderem ist das Friesen-Verfahren zu erwähnen (Friesen, H. G., Nature, 208 (1965) S. 1214), das nach dem oben zusammengefaßten Verfahren eine Ausbeute von 7% ergibt, bezogen auf die Menge an HCS, die in dem Ausgangsmaterial enthalten ist (die Anfangskonzentration an HCS liegt in der Größenordnung von 0,01 bis 0,05 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der ausgestoßenen Placenta).

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Isolierung von HCS zu entwickeln, mit dessen Hilfe es möglich ist, HCS mit hoher Reinheit in hoher Ausbeute zu isolieren, ohne daß die Gefahr der Denaturierung oder Modifizierung der biologischen Eigenschaften auftritt.

Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Patentanspruch gekennzeichnete Verfahren.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, HCS bis zu einer Ausbeute von 50% und darüber mit einer Reinheit von mehr als 90% zu gewinnen, indem man aus einem Placenta-Auszug oder einer Protein-Fraktion davon e^!ne Phase abtrennt, die HCS enthält und diese Phase nacheinander abwechselnden Behandlungen zur Anreicherung, Ultrafiltration und Chromatographie unterwirft. Die Anwendung der Ultrafiltration ermöglicht es unter anderem, eine wiederholte Ausfällung zu vermeiden und die zu behandelnden Volumina zu verringern. Die Ausschaltung (oder zumindest außerordentliche Verringerung) der Ausfällstufen führt dazu, daß die biologisch wirksamen Moleküle des HCS ständig in wäßriger Lösung gehalten werden, ohne daß die Gefahr der Der.aturierung oder Modifizierung der biologischen Eigenschaften besteht. Im Gegensatz dazu besteht diese Gefahr ständig bei den bekannten Verfahren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf verschiedene Ausgangssubstanzen wie Placenta-Extrakte, rohe immunologische Fraktionen oder Fraktionen, die während der Reinigung von Immunoglobulinen abgetrennt worden sind.

Wie oben angegeben, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren aufeinander folgende abwechselnde Behandlungen zur Anreicherung und Ultrafiltrationen und Chromatographie.

Die Anreicherung wird durch Ionenaustausch durchgeführt. Eine entsprechende Auswahl der Ionenaustauscher erlaubt eine sehr genaue Auswahl der Komponenten der Polypeptid-Fraktion, die eine ähnliche elektrostatische Oberflächenladung besitzen. Eine genaue Überwachung der Chromatographie (Gel-Chromatographie) ermöglicht es, eine sehr reine Fraktion mit einer begrenzten Variation des Molekulargewichts der Polypeptide zu isolieren. Die Ultrafiltration erfolgt schließlich durch Membranen mit einer Durchlaßgrenze für Moleküle mit einem Molekulargewicht von 10 000.

Im folgenden wird eine spezielle Reihenfolge der verschiedenen obenerwähnten Stufen beschrieben. In diesem Zusammenhang wird auf das Fließschema verwiesen, das eine beispielhafte Arbeitsweise angibt.

Das Ausgangsmaterial (ein Placentaextrakt oder eine Proteinfraktion) wird in 0,1 m Puffer mit einem pH-Wert von 8 bis 9 gelöst, wobei man eine Lösung erhält, in der das HCS weniger als 1% der Proteine ausmacht. Anschließend werden unlösliche Teilchen durch Zentrifugieren (De Laval Separator) entfernt und die schillernden kolloidalen Aggregate mit einer Kugelzentrifuge entfernt. Die klare überstehende Flüssigkeit, die nahezu farblos ist, kann leicht durch einfaches Abfiltrieren abgetrennt werden. Das Filtrat wird einer Ultrafiltration unterworfen und die geklärte und konzentrierte Lösung wird mit einem Ionenaustauscher zusammengebracht, um Verunreinigungen mit einem ähnlichen Molekulargewicht, aber einer unterschiedlichen clektri-

scr en Ladung zu entfernen.

Es wird eine weitere Ultrafiltration durchgeführt, und anschließend nochmalige Behandlung(en) mit Ionenaustauscher und weitere Ultrafiltration(en).

In dieser Stufe beginnt man mit dem Chromatographieverfahren: eine Fraktion, enthaltend hochgereinigtes HCS, wird gefriergetrocknet Eine erste Fraktion wird verworfen, während eine zweite Fraktion (enthaltend unreines KCS) der Ultrafiltration unterworfen und erneut Chromatographien wird. Diese Stufen werden wiederholt und insgesamt erhält man nach dem Gefriertrocknen (Lyophilisieren) HCS mit einer Reinheit von mehr als 90% in einer Menge die mehr als 50% der Ausgangsmenge beträgt.

Im einzelnen wird das Verfahren entsprechend der Zeichnung z. B. folgendermaßen durchgeführt: das Ausgangsmaterial (100 kg) wird durch 1 nach 2 geleitet, wo über 3 eine Pufferlösung (0,1 m, PH 83) gefünrt wird. Die trübe Lösung (HCS macht weniger als 1% der Proteine aus) wird über 4 nach 5 geleitet, wo es mit Hilfe eines De Laval Separators mit einer Geschwindigkeit von 250 l/h geklärt wird. Man erhält ungefähr 450 1 einer nicht filtrierbaren schillernden Lösung. Diese wird in 7 weitergeklärt, um die kolloidalen schillernden Aggregate mit Hilfe einer Kugelzentrifuge zu entfernen. Die: klare überstehende Flüssigkeit, die nahezu farblos ist, wird filtriert und über 8 nach 9 geleitet, wo sie weiter durch Filtration durch eine Filterpresse (20 χ 20 cm) mit Hilfe von Seitz K/7 Filtern filtriert wird. Es werden 100 Filter zur Filtration von 4201 benötigt. Das Filtrat wird durch 11 nach 10 geleitet, wo es mit Hilfe eines DDS-Moduls mit einer Oberfläche von 1,7 m² bei 15 bar und einer Temperatur von 7 bis 10⁰C ultrafiltriert wird. Man erhält 35 l/h eines Filtrats, das über 12 verworfer, wird. Das Endvolumen beträgt 80 1. Die Lösung wird, nachdem sie geklärt und eingeengt ist, über 13 nach 14 geleitet, wo sie mit einem Ionenaustauscher (DEAE-Cellulose) zusammengebracht wird, um Verunreinigungen zu entfernen, die ein ähnliches Molgewicht, aber eine andere elektrische Ladung besitzen. Die Elution wird mit 0,5 m Puffer, pH 8,3 (der über 15 zugeleitet wird) durchgeführt. Das 0,1 m Eluat und die Waschflüssigkeiten werden (über 16) verworfen, während die 0,5 m Fraktion von 80 1 eingeengt wird. Die Ultrafiltration wird (in 18) mit UF-Millipore-Kassetten durchgeführt unter Verwendung einer Membran mit einer Rückhaltegrenze von 10 000 Dalton, um die Berührung mit dem Ionenaustauscher auf einer Säule von 10 χ 100 cm (19) zu wiederholen. Das zurückgehaltene Produkt beträgt 4 I.

Über die Leitung 20 wird ein Puffer (pH 8,3, 0,1 m) zugegeben. Über die Leitung 21 wird das Ultrafiltrat ausgetragen. Der Ionenaustauscher, den das Filtrat über 22 erreicht, besteht aus DEAE-Sephadex A-25, wo eine Reinigung wiederholt wird und gleichzeitig eine Molekularfiltration durchgeführt wird. Durch 23 wird der übliche Puffer (0,5 m, pH 8,3) zugeführt und über 24 das zu verwerfende Eluat (0,1 m) ausgetragen. Aufgrund des verringerten Volumens ist es möglich, eine 0,5 m Fraktion in einer Menge von 16 I zu gewinnen. Diese Fraktion wird über die Leitung 25 zu einer weiteren Ultrafiltrationstufe bei 26 über UF Millipore Kassetten geleitet (über 27 wird der 0,1 m Puffer, pH 8,3 zugeführt und über 28 wird das Ultrafiltrat verworfen). Das Endvolumen beträgt nun 1 I.

Ein so verringertes Volumen erlaubt es, daß man die gesamte Probe auf eine Chromatopraphiesäule (30, über 29) aufgibt. Über 31 wird wieder ein 0.2 bis 0,5 m Puffer, pH 8 bis 9 zugegeben. HCS wird durch radiale Immunodiffusion gemessen und das chromatographische Profil wird in drei Fraktionen aufgetrennt Die erste Fraktion, die kein HCS enthält, wird über 32 verworfen. Die zweite Fraktion, die HCS mit einer Reinheit von 50% enthält, wird über 33 in eine Ultrazentrifuge (34) zurückgeleitet. Die dritte Fraktion enthält KCS mit einer Reinheit über 90% und wird über 35 in die Gefriertrockenvorrichtung 36 geleitet.

Die zurückgeleitete Fraktion wird nach der Ultrafiltration bei 38 (wohin sie über 37 gelangt), Chromatographien und ergibt zwei Hauptfraktionen: die erste enthält Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht und wird über 39 verworfen und die zweite enthält HCS mit einer Reinheit von mehr als 90% und wird über 40 in die Gefriertrockenvorrichtung 36 geleitet, wo sie mit der dritten Fraktion aus der ersten Chromatographie zusammen kommt. Die beiden Anteile werden zusammen gefriergetrocknet. Es ist günstig, die zusammengegebenen Fraktionen vor dem Lyophilisieren durch Ultrafiltration einzuengen.

Das nach dem Gefriertrocknen erhaltene HCS, das in Form eines cremefarbenen Pulvers vorliegt, vird in 42 getrocknet und besitzt eine Reinheit von über 90%.

Beispiel

100 kg einer Bl + 1 Fraktion nach dem Merieux Verfahren, die durch Lösen in Äthanol und Wiederausfällen, ausgehend von Placentaextrakt gewonnen worden sind, und von denen Albumin und der Hauptanteil der Hämoglobine, Lipoproteine und Immunoglobuline entfernt worden ist mit einem Proteingehalt von ungefähr 30% wurden innerhalb von 3 Stunden in 700 I einer 0.1 m Lösung von NH4HCO3, pH 8,2 gelöst. Die Lösung wurde zur Entfernung unlöslicher Anteile mit Hilfe eines De Laval Separators geklärt. Da die Lösung noch trüb bzw. schillernd war, wurde sie mit 16 000 g zentrifugiert, mit Hilfe einer kleinen Kugelzentrifuge bei einer Temperatur die nicht über 4°C hinaus ging. Dje entstehende Lösung wurde durch eine Membran mit einer Trenngrenze von 10 000 Dalton zentrifugiert, bis sie eine entsprechende Proteinkonzentration (4%) erreicht hatte.

Ungefähr 40 g/l, feuchte DEAE-Cellulose, die vorher aktiviert worden war, wurden zu der HCS-Lösung gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt und ungefähr 200 1 eines 0,1 m Eluats verworfen. Es wurden 80 I eines 0,5 m Puffers, pH 8,2 zu dem Ionenaustauscherharz gegeben und das Ganze 2 Stunden gerührt. So wurde ein 0,5 m Eluat gesammelt, dessen Volumen auf 20 1 verringert wurde, mit einem 0,1 m Puffer gewaschen und das Verfahren wiederholt, wobei 20 1 auf einen Ionenaustauscher DEAE-Sephadex A-25 gegeben wurden. 80 1 eines 0,5 m Eluats wurden erneut auf ein Volumen von 2 1 ultrafiltriert und mit Sephadex G-75 Chromatographien. Die erste Fraktion wurde verworfen und 16 1 der HCS-Lösung gewonnen, auf 150 ml ultrafiltriert und erneut der Gel-chromatographie unterworfen. 8 1 einer gereinigten HCS-Lösung wurden auf ein Volumen von 500 ml filtriert und gefriergetrocknet. Die Ausbeute an HCS betrug 50% und die Reinheit 92%.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Isolierung von Human-Chorion-Somatomammotropin (HCS) mit hoher Reinheit aus Placentaextrakten, durch Ausfällen und anschließendes Fraktionieren des HCS-Extraktes mit Hilfe von Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, daß man einen durch übliche Fällungsmethoden gereinigten Placentaextrakt mit einem Proteingehalt von etwa 30%