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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Insulinderivaten.
Da verbesserte Verfahren zur Feststellung von Diabetes mellitus eingeführt wurden und hiedurch die normale Lebenserwartung verlängert wurde, steigt die Zahl der registrierten Fälle dieser Krankheit immer mehr an. Die gegenwärtige Behandlung besteht in einer Diätregelung, gewöhnlich in Kombination mit Insulininjektionen oder mit einem oralen Antidiabetikum, wobei dem Patienten häufig während seines ganzen Lebens ein oder zweimal täglich Injektionen verabreicht werden müssen. Selbst bei einer solchen Behandlung des Patienten ändert sich der Blutzuckerspiegelbeträchtlich, so dass eine streng einzuhaltende Diätvorschrift erforderlich wird. Orale Arzneimittel sind nur bei milden Fällen von Diabetes geeignet und es wird jetzt angenommen, dass sie gewisse unerwünschte Nebenwirkungen haben.
Zu den oben angeführten Nachteilen der gegenwärtigen Behandlung kommt noch, dass ein Teil der Diabetiker Antikörper gegen Insulin erzeugt und im steigenden Ausmass der Insulinwirkung gegenüber resistent wird.
Es ist erwünscht, therapeutische Mittel zu schaffen, die verglichen mit den derzeit angewandten Präparaten eine verbesserte Regelung des Blutzuckerspiegels ermöglichen. Zu diesem Zweck wurden die Eigenschaften von Insulinderivaten untersucht, wobei jedoch die einzelnen Komponenten der komplexen Mischung, die erhalten wird, wenn die Stamminsuline acyliert oder andern Reaktionen unterworfen werden, meist nicht in ihre Komponenten gespalten bzw. letztere nicht hinreichend identifiziert werden konnten.
So ist bekannt, dass Insulin in Harnstoff enthaltenden Pufferlösungen carbamyliert wird, wobei sich aus dem Harnstoff Cyanat bildet undeineMischung carbamylierter Insulinderivate entsteht. Eine Abtrennung und Isolierung bestimmter carbamylierter Verbindungen aus dieser Mischung ist jedoch bisher nicht erfolgt.
Ziel der Erfindung ist es, neue Insulinderivate vorzusehen, in denen die Kombination der substituierten Gruppen zu einer Verbesserung der blutzuckersenkenden Wirkung führt. Hiebei ist die Art der Substitution der primären Aminogruppen des Insulinmoleküls von grösster Bedeutung.
Eine Substitution der Aminogruppen modifiziert auch die antigenen Eigenschaften des Moleküls und kann das Auftreten einer immunologischen Resistenz herabsetzen.
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umgesetzt wird, um eine Carbamylierung an zumindest einer dieser Aminogruppe zu erhalten ; das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass aus dem nach erfolgter Carbamylierung erhaltenen Reaktionsgemisch die neuen Insulinderivate im wesentlichen frei von andern carbamyliertenInsulinen chromatographisch abgetrennt werden.
Die Substitution der Insulinaminogruppen durch Ersatz des Wasserstoffes durch die Carbamylgruppe kann durch Umsetzung des Insulins mit einem Alkalicyanat, z. B. Kaliumcyanat, ausgeführt werden.
Das Blockieren einer oder mehrerer der oben angeführten Aminogruppen, zweckmässig die in Ai (Glyein)-Stellung mit eingeschlossen, ist wie festgestellt werden konnte, eine wesentliche Voraussetzung für Verbindungen mit den erwünschten Eigenschaften.
Es konnte festgestellt werden, dass z. B. das N, N', N"-Tricarbamylinsulin aussergewöhnliche Eigenschaf- ten aufweist, die Wirksamkeit dieser Verbindung bei Meerschweinchen war auf Grund der Blutglucosebestimmung bei dem Spitzenwert und dem Bereich unterhalb der Kurve doppelt so hoch als diejenige von nicht modifiziertem Insulin.
Die erfindungsgemäss erstmalig erhaltenen Verbindungen, die wertvolle therapeutische Eigenschaften aufweisen, sind, wie folgt, charakterisiert bzw. können in nachstehender Weise identifiziert werden ; bemerkt sei, dass diese hochmolekularen Verbindungen keine Schmelzpunkte haben und dass deren Spektra auf Grund der geringen Unterschiede von Molekülen mit 1,2 oder 3 Carbamylgruppen schwer analysierbar sind.
Es wird eine Scheiben-Gelelektrophorese unter Verwendung von 7, 5% vernetzten Gelen in 10 cm x 5 mm Röhren ausgeführt, wobei als Puffersystem 8 m Harnstoff in 0,3 m tris- (N-Hydroxymethyl)-aminomethanchlorid mit einem pH-Wert von 7,0 verwendet und während 4 h 20 min eine Spannung von 60 V bei 8 MA angelegt wird. In diesem System weisen die neuen Carbamylinsuline folgende anodische Mobilitäten, bezogen auf Insulin (1, 00), auf :
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Die Trennung und Identifizierung der Monocarbamylinsuline kann chromatographisch erfolgen, wobei gemäss nachstehendem Beispiel 2 eine Fraktion (Peak zwischen 149-204ml)B-N-Monoearbamylinsulln und eine weitere Fraktion (Peak zwischen 373 - 414 ml) A -N-Monocarbamylinsulin enthält; eine dritte
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Fraktion (Peak zwischen 428 - 507 ml) enthält A, -N, N'-Dicarbamylinsulin.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen wurden auch durch Bestimmung der endständigen NH2Gruppen identifiziert. Diese kann auf zweierlei Weise erfolgen :
Die Verbindungen werden mit Kaliumcyanat earbamyliert. Hiebei werden die Monocarbamylinsuline in einem Umsetzungsausmass mit Kaliumcyanat reagieren, welches das quantitative Vorliegen von zwei endständigen Aminogruppen anzeigt, wogegen die Dicarbamyl- und Tricarbamylinsuline in einem Ausmass reagieren werden, das quantitativ das Vorliegen einer bzw. keiner endständigen Aminogruppe aufzeigt.
Ferner kann eine solche Analyse durch tryptische Digestion mit einem Trypsinsubstrat zwecks Freisetzung von B-30-Alanin ausgeführt werden. Ein earbamyliertes Insulin, in welchem nur die A-und/oder
B -Aminogruppe substituiert ist, zeigt eine positive Reaktion in diesem Versuch durch Freisetzung von freiem Alanin, wogegen eine Verbindung in der die B29 -Aminogruppe substituiert ist, bei diesem Test eine negative Reaktion ergibt. 29
Sowie bei den Stamminsulinen kann auch in erfindungsgemäss erhältlichen Insulinderivaten, z. B. im N, N', N"-Tricarbamylderivat Zink in einer bestimmten Form vorliegen.
Erfindungsgemäss erhältliche Insulinderivate können in der gleichen Weise, wie die Stamminsuline zu pharmazeutischen Präparaten verarbeitet und klinischmit in Vergleich zu den Stamminsulinen grösseren oder kleineren Dosierungen verabreicht werden. Die normale tägliche Insulindosis beträgt 20 bis 70 internationale Einheiten für Erwachsene und für resistente Patienten mehr als 200 und in manchen Fällen über 500 Einheiten des Standardinsulins. Die erfindungsgemäss erhältlichen Derivate können zu Lösungen, Suspensionen oder gefriergetrockneten Präparaten verarbeitet werden. Eine solche Lösung kann z.
B. eine neutrale Lösung oder eine Lösung mit einem physiologischen pH-Wert sein und 0, 136 Gew.-%/Vol.-% Natriumacetat 0,7 Gew.-%/Vol.-% Natriumchlorid und 0, 1 Gew. -%/Vol. -% Methylhydroxybenzoat in pyrogenfreiem Wasser enthalten.
Die Erfindung ist mit verschiedenen Arten von Insulinen, insbesondere Schwein- und Rinderinsulinen, welche bei der Behandlung von Diabetes und andern Krankheiten viele Jahre hindurch klinisch verwendet wurden, anwendbar.
Die Erfindung soll an Hand von Beispielen näher erläutert werden.
Beispiel l : Herstellung vonN, N', N"-Tricarbamylinsulin (l) Rinder-Zinkinsulin [100 mg Burroughs Wellcome Ltd., kristallisiert, Feuchtigkeitsgehalt 7, 09%, Zinkgehalt 0, 336% (nicht korrigiert mit bezug auf den Verlust beim Trocknen), biologische Wirksamkeit 23,0 Einheiten/mg (nicht korrigiert mit bezug auf den Verlust beim Trocknen) getestet durch Eintritt von Krämpfen bei Mäusen] in einer Suspension in 5 ml 0, 2 m Tris-Puffer [Tris ist eine Abkürzung für Tris- (N-Hydroxymethyl)-aminomethan] bei einem pH-Wert von 8,5 wird mit einer Lösung von 5 ml von 1 m Kaliumcyanat vermischt. Die Lösung wird innerhalb von 2 min
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Diepro-teinhaltigen Fraktionen werden vereinigt, bei Raumtemperatur zumindest 1 h stehengelassen und dann gefriergetrocknet.
Die Ausbeute an Tricarbamylinsulin beträgt 95 bis 100%, bestimmt mittels Absorptionsmessungen bei 280 nm.
(2) Gemäss einer zweiten Verfahrensweise wird eine kleine Menge von Dicarbamylderivaten aus dem Tricarbamylinsulin abgetrennt. Das Carbamylierungsgemisch wird, wie oben beschrieben, entsalzt und dann einer Gradientelution (Verwendung von Puffern mit unterschiedlichen Trennverhalten) in einer Sephadex A-25 Säule (100 x 1 cm) unterworfen, unter Verwendung eines Ausgangspuffers von 0, 1 m Tris- Acetat, PH = 7, 1, das 8 m Harnstoff enthält und in welchen der gleiche Puffer, der 0, 2 m NaCl enthält, strömt, wobei das Volumen des Mischbehälters 200 ml beträgt. Das aus der Säule austretende Protein wird durch Messungen von E280 bestimmt ; die Hauptanteile, die mehr als 80% des Ausgangsinsulins enthalten, werden eluiert, miteinander vereingt und entsalzt. Das Tricarbamylinsulin wird in gefriergetrocknetem Zustandaufbewahrt.
Das Tricarbamylderivat ist am wenigsten bei einem pH-Wert von 4,0 löslich, so dass das Entsalzen nicht nur durch Gel-Filtration, sondern auch durch Ausfällung bei einem pH-Wert von 4,0 erzielt werden kann.
Die Untersuchung des Derivates durch Analyse der endständigen NH -Gruppe zeigt, dass sowohl das A
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ninreste von der endständigen COOH-Gruppe der B-Kette freigesetzt. Das Derivat reagiert nicht mit Ninhydrin, womit bestätigt wird, dass die drei NH-Gruppen des Insulins blockiert sind. Das Derivat gibt eine einzige Bande bei Acrylamid-Elektrophorese bei einem pH-Wert von 8, 5 in 8 m Harnstoff.
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2 : Herstellung vonZinkfreies Insulin (200 mg) wird in 10 ml 0, 1 m Natriumphosphat, das einen pH-Wert von 7,0 aufweist, aufgelöst, wonach Kaliumcyanat (16,8 mg) zugesetzt werden, und das Reaktionsgemisch 3 h bei 30 C gehalten wird.
Das Gemisch der carbamylierten Derivate wird in einer Sephadex G-25 Säule (30 x 3 cm) unter Verwendung von 0,05 m N-Äthylmorpholin als Eluierungsmittel behandelt und dann gefriergetrocknet. Das so erhaltene Gemisch wird chromatographisch in einer Sephadex-A-25 Säule (55 xl, 5 cm) getrennt, wofür als Eluierungsmittel zunächst 0, 9 m Tris-chlorid in 8 m Harnstoff bis 2,50 ml angesammelt sind, und dann 0,12 m Tris-chlorid in 8 m Harnstoff verwendet wird. Die erste Fraktion (Peak), die man zwischen 98 bis 130 ml erhält, enthält nicht umgesetztes Insulin, wobei zwischen 149 bis 204 ml B-N-Monocarbamylinsulin, zwischen 373 bis 414 ml A-N-Monocarbamylinsulin und zwischen 428 bis 507 ml Ai, B-N. N'-Diearbamyl- insulin erhalten wird. Jede Fraktion wird auf einer Sephadex G-25 Säule entsalzt und dann gefriergetrock- net.