DE2604759C2

DE2604759C2 - Verfahren zur Gewinnung von iv-verträglichen Γglobulinen

Info

Publication number: DE2604759C2
Application number: DE2604759A
Authority: DE
Inventors: Waldemar Dr. 5800 Hagen Schneider
Original assignee: Schura Blutderivate & Co Kg 4150 Krefeld De GmbH; Schura Blutderivate & Co Kg 4150 Krefeld GmbH
Current assignee: Armour Pharma GmbH
Priority date: 1976-02-07
Filing date: 1976-02-07
Publication date: 1983-06-01
Also published as: DE2604759A1; MX5356E; DK151609C; DK151609B; FR2340738A2; ZA77684B; FI62624B; SE442707B; ES455708A2; SE7700960L; AU508852B2; HU177708B; DD132758A6; FI62624C; DK47277A; IN144987B; AT351672B; FR2340738B2; AU2190277A; JPS52117414A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von iv-verträglichen Gammaglobulinen aus einem Gammaglobulin-Rohniederschlag von Blut, der mittels üblicher Fällmethoden, wie durch Cryo-Äthanol-Fraktionierung gewonnen wurde, durch Unlöslichmachen des antikomplementären Gammaglobulin-Anteils in einer wäßrigen Lösung des Rohniederschlages durch Bindung desselben an ein wasserlösliches Polymer und anschließendes Ausfällen der unlöslichen Bestandteile, in dem als wasserlösliches Polymer Hydroxyäthylstärke verwendet wird, welche in einem Molekulargewicht von 1000-900 000 und in einer Konzentration von 1-30 Gew.-% in der Lösung vorliegt, die einen pH-Bereich von 3,5 -8,0 aufweist, nach Patent 25 00 076.

Wenn auch das beschriebene Verfahren gemäß Stammpatent ein Gammaglobulin ergibt, das allen Anforderungen der medizinischen Praxis gerecht wird, so hat es sich doch als günstig erwiesen, die Ausbeute zu erhöhen, eine bessere Reproduzierbarkeit und eine Erleichterung der Herstellung zu gewährleisten.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die wäßrige Gammaglobulin enthaltende Lösung zusätzlich mit einer Aufschlämmung von glimmerartigen Schichtsilicaten in einer Konzentration im Bereich von 0,2- 10 Gew.-% versetzt wird und daß die Reaktion bei einer Temperatur von +4°—20°C, bei einem pH-Wert der Lösung von 4,0—7,6 während einer Reaktionszeit zwischen 3 und 10 Stunden stattfindet, worauf nach Hinzufügen eines Fällungsmediums, wie Polyäthylenglykol, der auszuscheidende Gammaglobulin-Anteil zusammen mit den Schichtsilicaten entfernt wird.

Unter »glimmerartigen Schichtsilikaten« werden Silikate verstanden, deren Zusammensetzung folgende-Grenzformeln wiedergeben:

a) Me;Y_o_„[(AI³⁺, Cr³⁺, Fe¹⁺, Fe²⁺. Mg²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺)^₃ (OH)₂(Si₄-,AI₁O₁₀F und

b) Me⁺Y_n^f(AI³⁺. Cr³⁺. Fe³⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Li⁺)^ ⁺ (OH)₂(Si₄O₁₀)]'-

Die Kationen Me⁺ können gegen andere, auch organische Kationen zeolithisch ausgetauscht werden. Als Quellungsflüssigkeit Y lassen sich beliebige Molekeln mit Ausnahme von gesättigten Kohlenwasserstoffen einführen.

Die Menge der Quellungsflüssigkeit kann in weiten Grenzen geändert werden. Da auch die Menge χ der einwertigen Kationen pro (Si, AI)₄Oio-Baueinheit, d. h. die Schichtladung, variiert, ergibt sich eine außerordentliche Mannigfaltigkeit.

Erfindungsgemäß werden vorteilhaft als Schichtsilicat Bentonit mit der Hauptkomponente Montmorillonit, Batavit oder Vermiculit verwendet.

Die intensive Forschung hat sich insbesondere des Montmorillonits angenommen (vergleiche hierzu Bibliographie in »Organische Derivate der glimmerartigen Schichtsilikate« von WEISS; angewandte Chemie 1963; S. 113 ff.). Montmorillonit besteht aus zweidimensional unendlichen Makro-Anionen, welche über die dazwischenliegenden Kationen elektrostatisch vernetz!

sind. Die Energie zur Quellung, d. h. zur Vergrößerung

so des Schichtabstandes unter Entfernung der positiven und negativen Ladungen voneinander, liefert die Hvdratation oder Solvatation der Kationen und der Anionenschich'.en. Da die Solvatationsenergie im allgemeinen wesentlich kleiner ist als die Hydratationsenergie, können nur Molekelarten mit hohen Dielektrizitätskonstanten oder mit der Befähigung zur Bildung von Wasserstoffbrücken eingelagert werden.

Auch Aminosäuren, Peptide und Proteine können in glimmerartige Schichtsilicate eingelagert werden. Proteine werden bei niedrigem pH-Wert nahezu quantitativ eingetauscht. Mit steigendem pH-Wert sinkt die Zahl der kationischen Positionen in den Proteinen und der Austausch wird unvollständig.

Albumine, Globuline und Prolamine werden ebenfalls gebunden. Mit Serumglobulinen scheint die Reaktion vom Rande der Silicatkristalle aus nur etwa 20 - 30Ä ins Innere fortzuschreiten. Albumine werden zwischen den Silicatschinhten gespreitet. Der Schichtabstand von 14,5

bis 15,0 A zeigt, daß für das gespreitete Protein eine Schichtdicke von maximal 5,5 bis 6 A zur Verfügung steht

Da sich in der aufgenommenen Gammaglobulin-Menge sowohl unbeschädigte als auch beschädigte Moleküle befinden, muß es das Bestreben sein, die beschädigten möglichst in irgendeiner Weise zu binden und damit von den physiologisch einwandfreien Molekülen chemisch unterscheidbar zu machen. Die beschädigten Moleküle sind in der Lage, Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden. Sie werden daher verstärkt innerhalb der Silicat-Schichten eingelagert und gebunden, während die unbeschädigten Gammaglobu-Iin-Moleküle in der Lösung verbleiben. Gebunden in den Schichten des Schichtsüicates lassen sich anschließend die beschädigten Gammag|obulin-Mo|eküle leicht, z, B, durch Zentrifugieren, entfernen.

Das im Sinne der Erfindung erwünschte Kationenaustauschvermögen zeigen nach Hofmann (Z. Kristallogr. (A) 98 [1937] 31; Chemie 55 [1942] 283) auch Kadin und diesem verwandte Stoffe (z.B. Halloysit, AI₂O₃' 2 SiO₂ - 4 H₂O) und gewisse glimmerartige Mineralien, die hinsichtlich ihres Gitteraufbaus verwandt sind.

Die Strukturformel des Batavits (=eisenfreies Vermiculit) ergibt sich nach WEISS und HOFMANN (Z. Naturf, 6b, 405) wie folgt:

^: ((Mg_2-6

₁0₁₀^-I-Mg₀ ⁺J₄-I-2,3^ H₂O.

Es wurde gefunden, daß dieses Material wie der Montraorillonit innerkristallines Quellvermögen und hohes Kationenaustauschvermögen besitzt. Die Untersuchungen (a. a. O.) zeigten, daß Batavit bis zu 5 Gew.-°/o Humanalbumin aufnimmt, wobei das Eiweiß zwischen die Silicatschichten eingelagert wurde. Auch Vermiculit, >» angenäherte Strukturformel

= {(Mg₃, Al₂, Fe₃ ¹, Fe₂ ¹¹J(OH)₂[Si₃J₅ AI₀.₆₅ O₁₀]))⁰-⁶⁵-+ 0,65 Me⁺

zeigt die erwünschten Eigenschaften bezüglich der Schichtenbildung und Quellfähigkeit. Vermiculit entspricht einem trioktaedrischen Mortmorillonit, doch sind seine Kristalle viel größer und das Gitter ist regelmäßiger ausgebildet

Zusammengefaßt kann demnach gefolgert werden, daß sich für das Reinigungsverfahren Minerale eignen, die eine Schichtstix'-tur zeigen, die Kationen zwischen den Silicatschichten aufweist und zur Quellung neigen. Nach der experimentellen Erfahrung werden durch derartige Mineralien die defekten Garamaglobulin-Moleküle gehalten — offenbar aufgrunu ihrer starken Kationen-Aktivierung — und die unbeschädigten nicht gebunden.

Im Zusammenhang mit Gammaglobulinen ist ein Verfahren bekannt geworden, bei dem die zu reinigende Proteinfraktioii in physiologischer Salzlösung bei einem pH-Wert von 6-8,5 mit Bentonit versetzt wird (US-PS 34 49 316). Es hat sich jedoch gezeigt, daß durch die kombinierte Verwendung von Hydroxyäthylstärke und einem Protein bindenden Material eine besonders hohe Reinheit, d. h. praktisch 100%, natives Gammaglobulin, erzielt werden kann. Dies ist bei hoher Ausbeute und leicht reproduzierbaren Bedingungen möglich, wenn nach dem Verfahren gemäß der Erfindung vorgegangen wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1
a) Abtrennen des Gammaglobulins

Es wird ausgegangen von einem gesammelten Plasma, das mit 8% Äthanol versetzt wird und bei einem pH-Wert von 7,2 bei minus 3°C ausgefällt wurde. Hierbei wird die Fraktion I ausgeschieden. Die aufstehende Flüssigkeit wird anschließend bej minus 5°C und einem pH-Wert von 5,8 mit 19% Äthanol versetzt. Hierbei wird die Fraktion II-III ausgeschieden, die aus Gamma-Globulinen besteht. Der Niederschlag wird wieder aufgelöst und bei pH 5 und 8% Äthanol erneut gefällt. Der verbleibende Überstand wird dann mit 25% Äthanol bei pH 7,2 erneut gefällt. Der hierbei entstehende Niederschlag ( = Fraktion II) besteht aus mindestens 90% Gammaglobulin.

b) Herabsetzung der antikomplementären
Wirksamkeit

Der Gammaglobuliii-Niiederschlag wird in einer gepufferten, wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert 7,0 in

jo einer Konzentration von etwa 6% aufgenommen, wobei der wäßrigen Lösung etwa 10% HÄS beigefügt sind. Der Lösung wird weiterhin eine wäßrige Aufschlemmung von Bentonit SF(Hauptkomponente: Montmoril-Ionit; Körnung kleiner als 80 μ; Hersteller: SERVA

J5 Feinbiochemika, Heidelberg) beigefügt. Die Lösung enthält anschließend 2,5 Gew.-% Bentonit und wird gut gerührt Anschließend wird die Lösung 6 Stunden bei einer Temperatur von 15° C ±2° stehengelassen. Dann wird das Bentonit zusammen mit den unerwünschten Bestandteilen nach Zugabe von C0% Pv.lyäthylenglykol durch Zentrifugieren entfernt.

c) Überführung in «ine physiologische
Kochsalzlösung

Der bei dem Zentrifugieren erhaltene Überstand enthält die erwünschten als Lösung vorliegenden Gammaglobulin-Bestandteile. Der Überstand wird mit 0,1 NaOH auf pH 7,2 gebracht und mit 20 Gew.-% PÄG versetzt Dabei scheidet sich ein Niederschlag aus

so reinem Gammaglobulin ab. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen und in einer physiologischen Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 5,2% Eiweiß gebracht und anschließend sterilfiltriert. Hiernach steht er zur therapeutischen Anwendung bereit.

Beispiel 2

Die Schritte a) und c) sind gleich denen des Beispieles 1. Schritt b) wird wie folgt abgewandelt:
Der Gammaglobulin-Niederschlag wird in einer gepufferten, wäßrigen Lösung mit einem pH von 7,4 in einer Konzentration von etwa 4 Gew,-% aufgenommen, wobei der wäßrigen Lösung etwa 8% HÄS beigefügt sind. Der Lösung wird weiterhin eine wäßrige Aufschlämmung von feinvermahlenem (Teilchengröße kleiner 80 μ) Vermiculit bis zu einem Anteil von 5 Gew.-% beigefügt. Das ganze wird kräftig verrührt. Anschließend wird die Lösung 8 Stunden bei einer Temperatur von 15° ±2"C stehengelassen. Der Lösung

wird danach etwa 10 Gew,-% HAS zugegeben. Anschließend wird das Vermiculit zusammen mit den unerwünschten Bestandteilen durch Zentrifugieren entfernt.
H ieran schließt sich der Schritt c) an,

Claims

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Gewinnung von jv-verträglichen Gammaglobulinen aus einem Gammaglobulin-Roh- ·> niederschlag von Blut, der mittels üblicher Fällmethoden, wie durch Cryo-Äthanol-Fraktionierung gewonnen wurde, durch Unlöslichmachen des antikomplementären Gammaglobulin-Anteils in einer wäßrigen Lösung des Rohniederschlags durch in Bindung desselben an ein wasserlösliches Polymer und anschließendes Ausfällen der unlöslichen Bestandteile, in dem als wasserlösliches Polymer Hydroxyäthylstärke verwendet wird, welche in einem Molekulargewicht von 1000—900 000 und in einer Konzentration von 1-30 Gew.-% in der Lösung vorliegt, die einen pH-Bereich von 3,5-8,0 aufweist, nach Patent 25 00 076, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Gammaglobulin enthaltende Lösung zusätzlich mit einer Aufschlämmung von glimmerartigen Schichtsilicaten in einer Konzentration im Bereich von 0,2—10 Gew.-% versetzt wird und daß die Reaktion bei einer Temperatur von +4°—20⁰C, bei einem pH-Wert der Lösung von 4,0—7,6 während einer Reaktionszeit zwischen 3 und 10 Stunden stattfindet, worauf nach Hinzufügen eines Fällungsmediums, wie Polyäthylenglykol, der auszuscheidende Gammaglobulin-Anteil zusammen mit den Schichtsilicaten entfernt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Schichtsilicat Beiuonit mit der Hauptkomponente Montmorillonit verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Schichtsilicate die Mineralien Batavit oder Vermiculit verwendet werden.