DE2721027A1

DE2721027A1 - Verfahren zur reinigung von glucagon

Info

Publication number: DE2721027A1
Application number: DE19772721027
Authority: DE
Inventors: Richard Lee Indianapolis Ind. Jackson; John George Indianapolis Ind. Stilz
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1975-12-17
Filing date: 1977-05-10
Publication date: 1978-11-16
Also published as: GB1576344A; CA1089448A; SE443512B; FR2389598A1; SE7705162L; NL7703758A; FR2389598B1; US4033941A

Description

PFENNING - MAAS MEINIG - LEMKE - SPOTT

6CHLEISSHEIMERSTr. 299 6000 MÜNCHEN 40

X-4567

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A.

Verfahren zur Reinigung von Glucagon

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. 5.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von Glucagon.

Kurz nach der Entdeckung des Insulins im Jahre 1921 durch Banting und Best stellten mehrere Forscher /J. Biol. Chem. 56, 252 (1923) und J. Biol. Chem. 58, 337 (1924)_/ fest, daß bestimmte Pancreasextrakte von Insulin hyperglykämisch wirksam sind. Der für diese Hyperglykämie verantv/ortliche Faktor wurde als Glucagon bezeichnet. Nachfolgende Forschungsarbeiten führten zur Reinigung und Kristallisation von Glucagon (Science 117, 628 (1953) und J. Biol. Chem. 214, 619 (1955)). In seiner Struktur ist Glucagon eine einzelne Polypeptikette aus 29 Aminosäure. Die Aminosäuresequenz von Schweineglucagon ist in J. Am. Chem. Soc. 79, 2807 (1957) beschrieben.

Wie bereits oben angeführt, verursacht Glucagon eine Hyperglykämie, nämlich eine Erhöhung der Glycosekonzentration im Blut. Glucagon steht diesbezüglich somit im dynamischen Gegensatz zu Insulin, das hypoglykämisch wirkt, nämlich die Konzentration an Blutglucose erniedrigt. Ein wichtiges Anwendungsgebiet von Glucagon besteht daher in der Behandlung von insuliniduzierter Hypoglykämie, wenn man keine hypertonische Glucoselösung hat.

Es ist ferner bekannt, daß Glucagon einen positiven inotropen Effekt aufweist (J. Pharmacol.Exptl. Therap. 29, 49 (196O)). Die Verabreichung von Glucagon führt daher zu einer Steigerung der Kontraktionskraft des Herzens. Aus diesem Grund wird Glucagon umfangreich zur Behandlung hypodynamischer Herzerkrankungen verwendet, bei denen eine Erhöhung der Herzkontraktionskraft erforderlich ist /Amer. Heart J. 79, 481 (19701/.

Das Glucagon ist ferner auch in verschiedener anderer Hinsicht biologisch wirksam. So wird Glucagon beispielsweise zur Entspannung des Duodenums für eine Röntgenuntersuchung bei der

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hypotonischen Duodenographie verwendet /Radiology 108, 35 (1973]/. Glucagon wirkt ferner auch diuretisch/ bronchodilatorisch/ magensäureabscheidungssenkend und blutlipid- sowie blutcholesterinspiegelsenkend. Ferner wird Glucagon auch zur Behandlung von Pancreatitis verwendet /Pharmakotherapie in Kürze 116, 69 (1974)_/.

Die oben beschriebenen anerkannten praktischen Einsatzmöglichkeiten für Glucagon stellen erhöhte Anforderungen an die Gewinnung und Reinigung von Glucagon.

Sowohl Insulin als auch Glucagon werden bekanntlich in der Bauchspeicheldrüse gebildet. Die Isolierung und Reinigung von Insulin hat bereits einen hohen Entwicklungsstand erreicht. Demgegenüber bereiten die bekannten Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Glucagon noch immer verschiedene Probleme, und zwar insbesondere in bezug auf die Reinheit des erhältlichen Produkts, den Abbau des Glucagons und die Produktausbeute. Diese Probleme sind teilweise auf die enge Verwandtschaft zwischen Insulin und Glucagon zurückzuführen. Verbesserungen bei den Verfahren zur Reinigung von Insulin haben den Beitrag derartiger Probleme aus den Insulinreinigungsverfahren jedoch ausgeschaltet oder wesentlich verringert.

In der heutigen Zeit bereiten daher vorwiegend die bekannten Verfahren zur Reinigung von Glucagon derartige Probleme. So wird beispielsweise die Fibrillenbildung bei niedrigem pH-Wert, normalerweise bei etwa pH 2,0, und somit in einer Umgebung durchgeführt, die zu einer erhöhten Glucagonhydrolyse beiträgt. Die dabei anfallenden Hydrolyseprodukte sind im allgemeinen weniger wirksam. Das Deamidoglucagon besitzt beispielsweise lediglich etwa 60 % der hormonalen Wirksamkeit von Glucagon. Ferner ist die Fibrillenbildung auch abhängig von der Reinheit des Glucagons, und die Fibrillenbildung wird daher mit abnehmender Glugaconreinheit immer schwieriger oder sogar unmöglich.

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• T-

Aufgrund der Neigung des Glucagons, in sauren Lösungen Gele und Fibrillen zu bilden, ist bei chromatographischen Verfahren unter Verwendung saurer Glucagonlösungen mit Glucagonverlusten durch Gelierung und Ausfällung von Glucagon in der Säule zu rechnen. Ferner neigt Glucagon auch zu einer Aggregatbildung in sauren Lösungen, wodurch sich die Selektivität und die Wirksamkeit einer Gelfiltration (Gelausschlußchromatographie unter sauren Bedingungen) stark erniedrigen.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Reinigung von Glucagon, das die bei den bekannten Reinigungsverfahren auftretenden Probleme umgeht oder möglichst gering hält. Es soll dabei ein Reinigungsverfahren für Glucagon unter milderen Bedingungen geschaffen werden, das jedoch selektiver und in höherer Glucagonausbeute verläuft als die bekannten Verfahren. Insbesondere soll dies durch ein Reinigungsverfahren für Glucagon erreicht werden, das von einer Gelfiltration Gebrauch macht, ohne daß dabei die den bekannten Verfahren anhaftenden üblichen Probleme auftreten.

Die obige Aufgabe wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Reinigung von Glucagon dadurch gelöst, daß man

(A) ein Gel, das in trockenem Zustand über eine Wasserrückaufnahme von wenigstens etwa 4 Gewichtsprozent verfügt und Teilchendurchmesser von weniger als etwa 100 Mikron hat, aufquillt,

(B) mit dem aufgequollenen Gel eine Säule bepackt,

(C) die bepackte Säule mit einer wässrigen Lösung, die einen pH-Wert von etwa 9 bis etwa 11 hat, von Glucagon mit einer Reinheit von wenigstens etwa 0,1 % versetzt, wobei diese Glucagonlösung wenigstens etwa 0,01 mg Glucagon pro ml Lösung enthält und weniger als etwa 10 Gewichtsprozent pro Volumen Gesamtproteinfeststoffe aufweist, und

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wobei man auf die Säule eine solche Gesamtmenge Glucagon aufgibt, daß sich eine Säulenbeladung von etwa 0,01 bis etwa 5 g pro Liter Bettvolumen ergibt, und

(D) das Glucagon von der Säule bei einer Temperatur von etwa 4 bis 40 ⁰C mit einem wässrigen Eluiermittel, das über einen pH-Wert innerhalb des gleichen Bereiches wie die GIucagonbeschickungslösung verfügt, eluiert.

Die in den vorliegenden Ausführungen verwendeten Angaben Reinigen oder Reinigung und dergleichen sind ganz breit aufzufassen, nämlich so zu verstehen, daß das ungereinigte Glucagon unabhängig von seiner jeweiligen Form, nämlich unabhängig davon, ob es als Feststoff oder in wässriger Lösung vorliegt, in bezug auf die Gesamtproteinfeststoffe bezüglich des Glucagongehalts angereichert wird. Es kommt somit hierbei zu einer Erhöhung der Reinheit des Glucagons, wenn man diese Reinheit als das Verhältnis von Glucagon zu Gesamtproteinfeststoffen definiert (was gewöhnlich als prozentuale Reinheit bezeichnet wird). überraschenderweise bereitet nun eine Hydrolyse von Glucagon zu Monodesamidoglucagon bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kein Problem, was wegen der bekannten leichten Hydrolysierbarkeit von Glucagon unter alkalischen Bedingungen überraschend ist /Acta Endocrinologica 77, 706 (1974]_/.

Aus der anliegenden Zeichnung geht das Elutlonsdlagramm oder Elutionsprofil hervor, das für das in Beispiel 1 beschriebene erfindungsgemäße Verfahren charakteristisch ist. Das Diagram stellt eine Auftragung von sowohl der optischen Dichte des Eluats als auch dem Glucagongehalt gegen das Abstromvolumen oder das Eluatvolumen dar.

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Unter einer Gelfiltration wird kurz gesagt ein chromatographisches Verfahren zur Auftrennung von Materialien, wie Proteinen, auf Basis der verschiedenen Molekulargröße verstanden. Nach diesem Verfahren werden Materialien auf einer Säule voneinander getrennt, die ein Gel enthält, das derart vernetzt ist, daß innerhalb eines jeden Gelteilchens Poren gebildet werden. Diese Poren haben ein bestimmtes meßbares Volumen, das zum Ausmaß der Quellung des Gels direkt proportional und zum Ausmaß der Vernetzung umgekehrt proportional ist. Da kleinere Moleküle leichter in diese Poren gelangen können als größere Moleküle, wird der Durchgang der kleineren Moleküle durch die Säule im Verhältnis zu dem Durchgang der größeren Moleküle, die nur teilweise oder überhaupt nicht in die Poren eindringen können, gebremst.

Im allgemeinen läßt sich beim erfindungsgemäßen Verfahren jedes in Wasser aufquellbare Gel verwenden, das sich zusammen mit Proteinlösungen einsetzen läßt. Ein solches Gel sollte jedoch in trockenem und nichtgequollenem Zustand über eine Wasserrückaufnahme von wenigstens etwa 4 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht des Gels, verfügen und einen Teilchendurchmesser von weniger als etwa 100 Mikron haben. Vorzugsweise sollte die Wasseraufnahme des Gels im Bereich von etwa 4 bis 98 %, insbesondere etwa 5 bis 20 %, liegen. Die trockenen Gelteilchen sollten vorzugsweise Durchmesser von weniger als etwa 80 Mikron, insbesondere Durchmesser von etwa 20 bis 80 Mikron, haben.

Beispiele erfindungsgemäß geeigneter Gele sind unter anderem Stärke (unter Einschluß von Maisstärke), vernetztes Galaktomannan, vernetztes Dextran, Agar oder Agarose, Polyacrylamide, Copolymere aus Acrylamid und Methylenbisacrylamid, Copolymere aus Acrylamid und Methylenbisacrylamid, Copolymere aus Methylenbisacrylamid mit Vinyläthylcarbinol und mit Vinylpyrrolidon.

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Die bevorzugten Gele sind vernetzte Dextrane, wie beispielsweise die Sephadex-Reihen von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N. J.

Die Art der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Säule ist nicht kritisch. Auswahl von Säulenhöhe, Säulendurchmesser und Säulenkonfiguration sind abhängig von den jeweils gewünschten Verfahrensparametern. Mit zunehmender Säulenhöhe nimmt natürlich die Strömungsgeschwindigkeit ab. In anderen Worten bedeutet dies, daß der Säulenrückdruck direkt proportional zur Säulenhöhe ist. Aus diesem Grund wird eine zusammengesetzte Säulenkonfiguration bevorzugt, wie beispielsweise die aus mehreren Sektionen bestehende Säule Pharmacia Sectional Column KS-370. Für normale Produktionszwecke reicht eine Säule aus 4 bis 6 Sektionen aus.

Eine zufriedenstellende Reinigung von Glucagon läßt sich in etwa mit einer Säulenbeladung von etwa 0,08 bis etwa 3,1 g Glugacon pro Liter Bettvolumen erreichen, und dieser Bereich wird besonders bevorzugt. Die Säulenbeladungen können jedoch im allgemeinen von etwa 0,01 bis 5 g pro Liter Bettvolumen reichen. Optimale Bedingungen für jede bestimmte Säule lassen sich ohne weiteres ermitteln.

Das Aufquellen des Gels und die Bepackung der Säule mit dem aufgequollenen Gel lassen sich nach irgendeinem bekannten Ver fahren durchführen. Im allgemeinen quillt man das Gel in dem zur Elution verwendeten Medium auf. Wahlweise kann man das Gel auch in 30-prozentigem wässrigem Äthanol aufquellen, die Feinstoffe dekantieren und das zum Aufquellen verwendete Medium dann durch das zum Eluieren dienende Medium ersetzen.

Es läßt sich praktisch jedes unreine Glucagon einsetzen, sofern es sich dabei um ein Material handelt, das wenigstens etwa 0,1 Gewichtsprozent, vorzugsweise wenigstens etwa 1 Gewichtsprozent, Glucagon enthält. Das Glucagonausgangsmaterial kann daher von rohen Pancreasproteinfraktionen bis zu teilweise gereinigten Glucagonkristallen reichen.

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Das unreine Glucagon läßt sich in saurem Wasser, beispielsweise Wasser mit einem pH-Viert von 3, lösen. Im Anschluß daran stellt man den pH-Wert gewünschtenfalls mit verdünnter wässriger Base oder einem organischen Puffer auf 9 bis 11 ein. Wahlweise und vorzugsweise löst man das unreine Glucagon in einem alkalischen wässrigen Medium bei einem pH-Wert von 9 bis 11. Beispiele hierzu geeigneter Basen sind Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid oder Ammoniumhydroxid. Natriumhydroxid wird bevorzugt. Beispiele geeigneter organischer Puffer sind Glycin-Natriumhydroxid sowie Tris(hydroxymethyl)-aminomethan. Eventuell vorhandenes unlösliches Material läßt sich erforderlichenfalls in irgendeiner Weise gewinnen. Der pH-Wert der Glucagonbeschickungslösung für die Säule bewegt sich, wie bereits angegeben, zwischen etwa 9 und 11. Bevorzugt wird für diese Lösung ein pH-Bereich von etwa 9,0 bis etwa 10,5. Der pH-Wert der Glucagonbeschickungs lösung und der pH-Wert des Eluiermittels braucht zwar nicht identisch zu sein, doch soll man vorzugsweise starke diesbezügliche Unterschiede vermeiden.

Die auf diese Weise erhaltene Glucagonbeschickungslösung für die Säule sollte wenigstens etwa 0,01 mg, vorzugsweise wenigstens 0,05 mg, und insbesondere wenigstens etwa 0,5 mg, Glucagon pro ml Lösung enthalten. Ferner sollte diese Lösung auch weniger als etwa 10 % (Gewicht pro Volumen) Gesamtproteinfeststoffe aufweisen. Die Menge an Gesamtproteinfeststoffen beträgt vorzugsweise weniger als etwa 8 Gewichtsprozent, insbesondere weniger als etwa 6 Gewichtsprozent, pro Volumen. Gewünschtenfalls kann man die Glucagonbeschickungs lösung für die Säule entsprechend puffern, doch ist eine solche Pufferung nicht unbedingt notwendig. Wahlweise und vorzugsweise enthält die Glucagonbeschickungslösung für die Säule ein Gelatbildungsmittel für zweiwertige Metallionen sowie ein Stabilisierungsmittel, und hierauf wird später im Zusammenhang mit dem Eluiermittel noch näher eingegangen.

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Zur Erzielung zufriedenstellender Ergebnisse sollte man das unreine Glucagon in einem Lösungsmittelvolumen lösen, das kleiner ist als das zur Abtrennung verwendete Volumen, und hierauf wird im folgenden näher eingegangen.

Der Verteilungskoeffizient K, wird in der Chromatographie als das Verhältnis der Konzentration des gelösten Stoffs in der mobilen Phase zu der Konzentration des gelösten Stoffs in der stationären Phase definiert. Bei der Gelfiltration ist die mobile Phase das Lösungsmittel, das sich im Leerraum zwischen den Gelteilchen bewegt, während die stationäre Phase dasjenige Lösungsmittel darstellt, das in den Gelteilchen zurückgehalten wird, nämlich in den Poren eines jeden Gelteilchens gefangen ist. Der Verteilungsfaktor K, gibt daher denjenigen Bruchteil an festgehaltenem Lösungsmittel an, der von einem gelösten Stoff durchdringbar ist. Das Elutionsvolumen V eines gelösten Stoffes läßt sich daher unter Zuhilfenahme des Verteilungskeoffizienten K, durch folgende Gleichung ausdrücken:

V = V + K * V. e ο d ι

Hierin bedeutet V das Leervolumen der Säule und V. das

ο i

Volumen des gebundenen Lösungsmittels. Löst man die obige Gleichung nach K, auf, dann ergibt sich folgendes:

^Kd^{= (V}e - ^Vo>/^Vi

Nimmt man die Dichte des Wassers als Einheit an, nämlich unter Zugrundelegung von V. = aW_r, wobei a das Gewicht des Trockengels ist und W die Wasserrückaufnahme bedeutet, dann ergibt sich für den Verteilungskoeffizienten folgende Gleichung

^Kd ^{= (V}e - V^/aWr

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und diesen Zusammenhang kann der Fachmann ohne weiteres experimentell bestimmen.

Geht man nun von der Annahme aus, daß eine Lösung zwei gelöste Stoffe enthält, dann läßt sich das Elutionsvolumen für einen jeden gelösten Stoff durch folgende Gleichungen

ausdrücken: , _{= + χ}

e ο d ι

V '' = V + K '¹V. e ο α ι

Das Abtrennvolumen V stellt die Differenz zwischen den

Elutionsvolumina der beiden gelösten Stoffe dar und läßt sich aus folgenden Gleichungen ermitteln:

Aus obigen Ausführungen ergibt sich, daß das Ausmaß der Trennung zweier (oder mehrerer) gelöster Stoffe zum Teil abhängig ist von der Säulenbeladung. Da sich die Menge des niedermolekularen gelösten Stoffes dem Grenzwert der verfügbaren Poren nähert, muß die Auftrennung der beiden gelösten Stoffe zwangsläufig abnehmen. Innerhalb der angegebenen erfindungsgemäßen Beladungsgrenzwerte kann das Ausmaß der Auftrennung schwanken. In bestimmten Fällen kann man auch mit einer höheren Säulenbeladung arbeiten, um die Auftrennung gegen die Produktivität zu balancieren.

Das Eluiermittel soll, wie bereits angegeben, einen pH-Wert im Bereich von etwa 9 bis etwa 11 haben. Bevorzugt wird hierfür ein pH-Wert von etwa 9,0 bis etwa 10,5, insbesondere ein pH-Wert von 9,5. Das Eluiermittel ist gewöhnlich eine wässrige Lösung der gleichen Base oder des gleichen organischen Puffers wie man sie auch zur Herstellung der GIucagonbeschickungslösung für die Säule verwendet, wobei wässriges Ammoniumhydroxid bevorzugt wird.

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. AU-

Wahlweise und vorzugsweise enthält das Eluiermittel bis zu etwa 0,01 Mol eines Gelatbildungsmittels für zweiwertige Metallionen pro Liter und/oder bis zu etwa 0,5 Volumprozent Butanol als Stabilisator. Bevorzugt wird eine Butanolmenge von 0,1 Volumprozent.

Geeignete Geliermittel obiger Art haben die folgende allgemeine Formel:

m—/cH\— (CH:_;) p—

-N-(CHz) ΓΙ R₄

worin die Substituenten R₁ und R₁- unabhängig für Carboxymethyl, Carboxyäthyl, C.-Cg-Alkyl oder C₁-Cg-Hydroxyalkyl stehen, die Substituenten R^ und R_fi unabhängig Carboxymethyl oder Carboxyäthyl bedeuten, der Substituent R Wasserstoff, Hydroxy oder C.-C-.-Alkyl ist, der Substituent R. Wasserstoff, Carboxymethyl oder Carboxyäthyl darstellt, m für eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 6 steht·., η den Wert 0 oder 1 hat, ρ für die Zahl 0 oder 1 steht, r eine ganze Zahl von 2 bis einschließlich 6 darstellt und s eine Zahl von 0 bis einschließlich 2 ist.

Einzelbeispiele geeigneter gelatbildender Mittel aus obiger allgemeiner Formel sind u.a. Äthylendiamin-Ν,Ν,Ν¹,N'-tetraessigsäure, 1 ^-Diaminopropan-NfN^' ,N*-tetraessigsäure, 1 ,3-Diamino-2-hydroxypropan-Ν,Ν,Ν',N¹,tetraessigsäure, DiäthylentriamintetraessigsMure, Diäthylentriaminpentaessigsäure, Hexamethylendiamin-Ν,Ν,Ν¹ ,N'-tetraessigsäure, N-Butyläthylendiamin-Ν,Ν,Ν¹,N'-triaessigsäure, N,N'-Dimethyltetramethylendiamin-N,N'-diessigsäure, N-(2-HydroxyäthyDäthylendiamin-N^^N'-triessigsäure oder Äthylendiamin-Ν,Ν,Ν¹ ,N'-tetrapropionsäure. Bevorzugte gelatbildende Mittel sind Polymethylendiamintetraessigsäure,

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und insbesondere wird als gelatbildendes Mittel Äthylendiamin-Ν,Ν,Ν¹,N'-tetraessigsäure (EDTA) verwendet. Das gelatbildende Mittel läßt sich entweder in Form der freien Säure oder in Form eines Alkali- oder Ammoniumsalzes hiervon verwenden. Die Konzentration an gelatbildendem Mittel beträgt vorzugsweise 0,001 Mol.

Die Elution der Säule wird bei Temperaturen im Bereich von etwa 4 bis etwa 40 ⁰C durchgeführt. Vorzugsweise liegt die Elutionstemperatur bei Umgebungstemperatur oder darunter.

Der Verlauf der Elution wird durch irgendeine geeignete Weise verfolgt. Ein hierzu besonders vorteilhaftes Verfahren besteht in einer Messung der Ultraviolettabsorption bei 280 nm einer jeden Fraktion. Diejenigen Fraktionen, die das gewünschte gereinigte Glucagon enthalten werden vereinigt und weiter verarbeitet, wodurch man hochreine Glucagonkristalle erhält.

Die Wahl der Weiterbehandlungsmaßnahmen ist im allgemeinen abhängig von der Reinheit und Konzentration des im Eluat enthaltenen Glucagons und kann dem Fachmann Überlassen bleiben. In der Regel wird das Glucagon direkt aus dem Eluat kristallisiert falls das eluierte Glucagon eine Reinheit von mehr als etwa 10 % (Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtlösungsfeststoffe) hat und die Glucagonkonzentration im Eluat größer ist als etwa 300 meg pro ml Eluat. Am besten kristallisiert man Glucagon direkt aus dem Eluat bei einem sauren pH-Wert, nämlich bei pH-Werten von 4,8 bis 5,2, vorzugsweise bei pH 5,0. Eine andere Methode einer derartigen Kristallisation von Glucagon besteht in einer Zinkkristallisation bei pH 7,5. Liegt die Reinheit des im Eluat enthaltenen Glucagons bei weniger als etwa 1O %, dann läßt sich das Glucagon aus dem Eluat durch eine 20-prozentige Salzfällung unter anschließender Umkristallisation

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.4-

unter sauren Bedingungen kristallisieren, wobei man vor dieser Umkristallisation gegebenenfalls eine zweite Gelfiltration durchführen kann. Das dabei jeweils erhaltene GIucagon verfügt über eine mittlere Reinheit und muß gewöhnlich weiter gereinigt werden. Eine solche weitere Reinigung läßt sich durch Umkristallisieren aus einem leicht alkalischen Medium, nämlich bei pH 7 bis 8, Ionenaustauschchromatographie oder eine Kombination dieser beiden Maßnahmen erreichen. Ein besonders geeignetes und bevorzugtes Verfahren besteht in einer Wiederauflösung des teilweise gereinigten Glucagons und Durchführung einer zweiten erfindungsgemäßen Gelfiltration mit der dabei erhaltenen GIucagonlösung, worauf sich eine Kristallisation des Glucagons aus dem Eluat unter sauren oder leicht alkalischen Bedingungen anschließt. Auf diese Weise kann man ohne weiteres zu Glucagon mit einer Reinheit von über 90 % gelangen. Dieses bevorzugte Verfahren wird im folgenden weiter erläutert.

Für die großtechnische Reinigung von Glucagon durch das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man im allgemeinen Glucagon mit einer Reinheit von etwa 2 bis 5 Gewichtsprozent. Glucagon mit solcher Reinheit besteht gewöhnlich aus Pancreasproteinfraktionen, wie man sie bei der technischen Isolierung und Reinigung von Insulin aus Rinder- und Schweinepancreasdrüsen erhält, und diese Fraktionen werden gewöhnlich als glucaconhaltiges Protein bezeichnet. Dieses unreine Glucagon, nämlich das glucagonhaltige Protein, löst man in saurem Wasser mit einem pH-Wert von etwa 3, dessen Volumen etwa 10 % des Bettvolumens der zu verwendenden Säule ausmacht. Die so erhaltene Glucagonbeschickungslösung für die Säule enthält etwa 3 bis 4 g Feststoffe pro Liter Bettvolumen und etwa 0,06 bis 0,2 g Glucagon pro Liter Bettvolumen. Die Säule äquilibriert man in verdünntem wässrigem Ammoniak, das über einen pH-Wert von etwa 9,0 bis 10,5 verfügt und

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0,001 Mol EDTA sowie 0,1 Volumprozent Butanol enthält, wobei man bei einer Temperatur von 25 ⁰C arbeitet. Das bevorzugteste Gel ist Sephadex G-50F (Pharmacia Pine Chemicals, Inc., Piscataway, N. J.).

Der pH-Wert der Glucagonbeschickungslösung für die Säule wird dann mit verdünnter wässriger Base oder einem organischen Puffer auf 9 bis 11 eingestellt. Vor Aufgabe dieser Lösung auf die Säule kann man gewünschtenfalls das eventuell vorhandene unlösliche Material abfiltrieren. Sodann gibt man die Glucagonbeschickungslösung auf die Säule auf und eluiert anschließend in der oben beschriebenen Weise bei einem pH-Wert von 9,5 mit wässrigem Ammoniak/EDTA/ Butanol. Das Glucagon taucht bei einem K,-Wert von etwa 0,78 bis 0,82 in einem Volumen Eluiermittel auf, das etwa 20 bis 25 % des Bettvolumens entspricht. Die Glucagonkonzentration in dem glucagonhaltigen Eluat beträgt vorzugsweise etwa 400 bis 700 mcg/ml, wobei dieses Glucagon eine Reinheit von über etwa 10 % hat. Möchte man mit der Weiterverarbeitung dieses Eluats warten, dann säuert man das glucagonhaltige Eluat zur Lagerung mit verdünnter Chlorwasserstoff säure etwa auf pH 3 an. Eluatfraktionen, die man vor (Voreluatfraktionen) und nach (Nacheluatfraktionen) dem Ablaufen des glucagonhaltigen Eluats gesammelt hat, werden aufgehoben und zur Gewinnung von weiterem Glucagon rückgeführt.

Zur weiteren Verarbeitung stellt man den pH-Wert des glucagonhaltigen Eluats dann entweder mit verdünnter Phosphorsäure oder mit verdünnter wässriger Natrium- oder Kaliumhydroxid lösung auf etwa 5 ein. Anschließend wird die Lösung auf etwa 60 C erhitzt und dann filtriert. Zur Einleitung einer Glucagonkristallisation kühlt man das FiI-trat hierauf auf etwa 5 ⁰C ab. Die Glucagonkristalle

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werden dann in irgendeiner geeigneten Weise, beispielsweise durch Zentrifugieren, geerntet und nachfolgend mit kalter 0,001-prozentiger Kochsalzlösung gewaschen. Alle Mutterlaugen und Waschlaugen werden für eine erneute Verarbeitung aufgehoben.

Die in obiger Weise erhaltenen Glucagonkristalle löst man dann in einem Gemisch aus wässrigem Ammoniak/EDTA/Butanol mit einem pH-Wert von 9,5 unter Bildung einer Lösung, die etwa 2 bis 6 % (Gewichtprozent/Volumen) solcher Kristalle enthält, etwa 0,26 5 bis 0,75 g Feststoffe pro Liter Bettvolumen aufweist und etwa 0,1 bis 1,875 g Glucagon pro Liter Bettvolumen enthält. Das gesamte Lösungsvolumen beträgt etwa 2,5 bis 7,5 % des Bettvolumens. Die auf diese Weise erhaltene zweite Glucagonbeschickungslösung für die Säule bringt man dann auf eine zweite Säule aus Sephadex-G-5OF auf, deren Bettvolumen etwa 20 % größer ist als das der ersten Säule. Im Anschluß daran eluiert man die Säule in der bereits oben beschriebenen Weise. Die Konzentration an Glucagon in dem glucagonhaltigen Eluat liegt hier gewöhnlich bei etwa 500 bis 3500 mcg/ml. Nach Einstellen des pH-Wertes des Eluats auf etwa 7 bis etwa 8 kristallisiert das Glucagon aus diesem Eluat bei einer Temperatur von etwa 5 bis 10 ⁰C aus. Die Glucagonkristalle werden dann in üblicher Weise gewonnen. Auch hier werden wiederum alle Mutterlaugen und Waschlaugen für eine erneute Verarbeitung aufgehoben.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert. Beispiel 1 zeigt eine bevorzugte Durchführung der Reinigung von Glucagon in der oben beschriebenen Weise, und bei diesem Verfahren kommen zwei Gelfiltrationsstufen zur Anwendung. Die Beispiele 2 und 3 sind Vergleichsverfahren und auf ein bekanntes Verfahren zur

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Reinigung von Glucagon mit und ohne der erfindungsgemäßen Gelfiltration gerichtet. Bei jedem Beispiel verwendet man die gleiche Quelle für unreines Glucagon. Dieses als Ausgangsmaterial verwendete Glucagon stammt von zwei Proteinfraktionen: (1) der amorphen Proteinfraktion, wie man sie während der Herstellung von Zinkinsulinkristallen isoliert, und (2) dem Protein, das nach einer dazwischenliegenden Zinkinsulinkristallisation in der citratgepufferten Mutterlauge zurückbleibt, welches man durch Fällung mit Zink isoliert hat. Die beiden Proteinfraktionen werden vereinigt, worauf man das Ganze bei einem pH-Wert von etwa 6,2 in Gegenwart von 0,75 % Natriumchlorid und 0,5 % Phenol, jeweils auf Gewicht pro Volumen bezogen, einer fraktionierten Fällung unterzieht. Nach entsprechender Untersuchung auf den Glucagongehalt hin vereinigt man mehrere Anteile eines solchen fraktioniert gefällten Proteins unter Bildung eines Gemisches aus glucagonhaltigem Protein, das 3,60 Gewichtsprozent Glucagon aufweist.

Das zur Ermittlung des Glucagongehalts verwendete Verfahren ist eine dem Insulinimmunoversuch entsprechend angepaßte Arbeitsweise (J. Clin. Endocr. 25, 1375 (1965)) unter Einsatz einer radioaktiven Verdünnung sowie von beschichteter Aktivkohle. Die Reinheit des Glucagons wird als die gewichtsprozentuale Glucagonmenge angesehen, die bezogen auf die Gesamtfeststoffe vorhanden ist. Der Gesamtfeststoff gehalt wird in bekannter Weise ermittelt. Unter der Ausbeute an Glucagon wird diejenige prozentuale Menge an Glucagon verstanden, die in dem als Gucagonquelle verwendeten gesamten Glucagon vorhanden ist.

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Beispiel 1

A. Herstellung einer Glucagonbeschickungslösung für die

Säule

Man löst 200 g als Glucagonquelle dienendes Protein in 5 Liter wässriger Chlorwasserstoffsäure mit einem pH-Wert von 3,0. Sodann stellt man den pH-Wert der Lösung zur Erleichterung der Auflösung des Proteins mit 3 normaler wässriger Natriumhydroxidlösung auf etwa 11 ein. Anschließend wird der pH-Wert mit 3 normaler wässriger Chlorwasserstoffsäure auf 9,5 eingestellt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird abschließend durch Filtrieren geklärt. Das Endvolumen beträgt 5,675 Liter.

B. Erste Gelfiltration

Eine in Abschnitte unterteilte Chromatographiersäule, die aus 4 Pharmacia KS-370/15-Einheiten (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) besteht, wird mit Sephadex G-50F (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) bepackt und dann bei einer Temperatur von 25 C mit wässrigem Ammoniumhydroxid, das einen pH-Wert von 9,5 aufweist und 0,001 Mol EDTA sowie 0,1 % Butanol enthält, äquilibriert. Hierauf gibt man die Glucagonbeschickungslösung auf die Säule auf und eluiert anschließend unter Verwendung des obigen Gemisches aus wässrigem Ammoniak/EDTA/ Butanol mit einem pH-Wert von 9,5 als Eluiermittel bei einer Geschwindigkeit von 300 bis 400 ml/Minute. Zum Auffinden des Proteins im Säulenabstrom mißt man die prozentuale Durchlässigkeit des Eluats bei 280 nm unter Verwendung eines LKB Uvicord II Absorptiometers (LBK Produkter AB, Stockholm, Schweden). Nach Auffangen von 90,6 Liter Eluat (dieses Volumen entspricht dem Leervolumen der Säule) sammelt man

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eine Fraktion von 22,4 Liter, die höhermoluekulare Proteine enthält. Im Anschluß daran fängt man wie folgt drei weitere Fraktion auf:

(1) eine Vorlaufeluatfraktion mit einem Volumen von 2 Litern,

(2) ein glucagonhaltiges Eluat mit einem Volumen von 11 Litern und

(3) eine Nachlaufeluatfraktion mit einem Volumen von 4 Litern.

Hierauf stellt man den pH-Wert des glucagonhaltigen Eluats unter Verwendung von 3 normaler wässriger Chlorwasserstoffsäure auf 5,5 ein und läßt das Eluat über Nacht bei 25 ⁰C stehen. Das Endeluatvolumen beträgt 11,O Liter. Das Eluat enthält 50,6 g Gesamtfeststoffe, was einer Konzentration von 4,6 mg/ml entspricht, der Glucagongehalt beträgt 6,058 g, was eine Konzentration von 551 mcg/ml ergibt. Die Reinheit des Glucagons liegt bei 11,97 %, und die Glucagonausbeute macht 84,14 % aus, bezogen auf einen Glucagongehalt von 7,20 g in dem als Glucagonquelle verwendeten Protein.

C. Zwischenkristallisation

Das in obiger Weise erhaltene glucagonhaltige Eluat erhitzt man unter Rühren auf 60 ⁰C, worauf man den pH-Wert mit 3 normaler wässriger Chlorwasserstoffsäure auf 5,0 einstellt. Anschließend filtriert man die Lösung in noch heißem Zustand und kühlt das Filtrat 24 Stunden auf etwa 5 ⁰C, wodurch Glucagon auskristallisiert und sich absetzt. Die Gewinnung der Glucagonkristalle erfolgt durch Dekantieren der Mutterlauge und anschließendes Zentrifugieren. Die Mutterlauge wird für eine weitere Aufarbeitung aufgehoben. Die erhaltenen Glucagonkristalle löst man in dem bereits beschriebenen

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Gemisch aus wässrigem Ammoniak/EDTA/Butanol vom pH 9,5 und filtriert die dabei erhaltene Lösung dann. Die fertige Lösung hat ein Volumen von 1,65 Liter und enthält 6,27 g Gesamtfeststoffe, was einer Konzentration von 3,8 mg/ml enspricht. Der Glucagongehalt der Lösung beträgt 3,82 g, was eine Konzentration von 2,322 mcg/ml ausmacht. Die Reinheit des Glucagons liegt nun bei 61,1 %, und die Glucagonausbeute beträgt 5 3,1 %.

D. Zweite Gelfiltration

In ähnlicher Weise wie oben beschrieben stellt man eine aus fünf Abschnitten bestehende Chromatographiesäule zusammen. Sodann gibt man die aus der Zwischenkristallisation erhaltene Lösung auf die Säule auf und eluiert die Säule anschließend mit dem angegebenen Eluat aus wässrigem Ammoniak/EDTA/Butanol vom pH 9,5 unter einer Geschwindigkeit von 500 ml pro Minute. Die Elution der Säule erfolgt im wesentlichen genauso wie dies oben unter der Verfahrensstufe B beschrieben worden ist. Das glucagonhaltige Eluat besteht in diesem Fall aus 14,0 Liter Flüssigkeit. Dieses glucagonhaltige Eluat enthält Ξ,6 g Gesamtfeststoffe, was einer Konzentration von 0,40 mg/ml entspricht. Der Glucagongehalt beträgt 3,40 g, was einer Konzentration von 243 mcg/ml entspricht. Die Reinheit des Glucagons liegt bei 60,7 %, und die Glucagonausbeute beträgt 47,22 %. Wegen der verschiedenen Einstellungen des pH-Wertes ist der Gehalt des Eluats an anorganischen Salzen natürlich stark gestiegen. Da diese anorganischen Salze einen etwa dem des Glucagons entsprechenden K,-Wert haben, werden diese Salze vom Glucagon nicht durch Gelfiltration entfernt. Nachdem die Reinigung des Glucagons jedoch auf den vorhandenen Gesamtfeststoffen beruht scheint diese zweite Gelfiltration zu überhaupt keiner Reinigung zu führen.

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Es wurde jedoch eine gewisse Abtrennung von Nichtglucagonprotein von Glucagon erreicht. Mit anderen Worten ausgedrückt würde somit jede Stufe eine Erhöhung der Glucagonreinheit ergeben, wenn man diese Reinheit nicht auf den Gesamtfeststoff gehalt, sondern auf die Gesamtproteinfeststoffe bezieht.

E. Glucagonendkristallisation

Das aus der zweiten Gelfiltration erhaltene glucagonhaltige Eluat stellt man mit 20 ml 10-prozentiger wässriger Phosphorsäure auf pH 7,5 ein. Die Lösung wird sodann zur Ermöglichung einer maximalen Glucagonkristallisation 18 Stunden bei einer Temperatur von 5 C gerührt, worauf man sie etwa 72 Stunden absetzen läßt. Die Abtrennung der Mutterlauge erfolgt durch Dekantieren und Zentrifugieren, und sie wird für eine weitere Verarbeitung aufgehoben. Die dabei erhaltenen Glucagonkristal-Ie werden der Reihe nach einmal mit 0,001-prozentiger Kochsalzlösung, zweimal mit absolutem Alkohol und einmal mit wasserfreiem Äther gewaschen. Anschließend werden die Kristalle über Nacht unter Vakuum getrocknet. Die auf diese Weise erhaltenen Glucagonkristalle wiegen 3,455 g. Aufgrund einer Aminosäureanalyse sowie einer Analyse durch Kationenaustauschchromatographie verfügt dieses Glucagon über eine Reinheit von 91,1 %. Die Glucagonkristalle enthalten demzufolge 3,13 g reines Glucagon, was einer Ausbeute von 43,5 % entspricht.

Beispiel 2 A. Herstellung einer Glucagonlösung

4000 g eines als Glucagonquelle dienenden Proteins, das 144 g Glucagon enthält, löst man in 250 Liter wässriger Chlorwasserstoffsäure mit einem pH-Wert von 2,8. Zur

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besseren Auflösung rührt man das Ganze 1 Stunde bei 25 °C, worauf man die Lösung filtriert. Anschließend versetzt man die Lösung mit 550 Liter Wasser und soviel 3 normaler wässriger Chlorwasserstoffsäure, daß sich ein pH-Wert von 2,1 ergibt. Das Endvolumen der Lösung beträgt 800 Liter.

B. Fibrillenbildung.

Die in obiger Weise erhaltene Lösung versetzt man mit 3,2 Liter einer 0,1 molaren EDTA-Lösung und 4,8 Liter 50-gewichtsprozentigem wässrigem Ammoniumsufat. Die auf diese Weise erhaltene Lösung hat einen pH-Wert von 2,3. Die Lösung wird zur Einleitung einer Fibrillenbildung 48 Stunden bei 27 ⁰C gerührt. Die dabei entstandenen Fibrillen trennt man dann von der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren ab. Hierauf suspendiert man die Fibrillen in 120 Liter wässriger Chlorwasserstoffsäure mit einem pH-Wert von 2,0, die 0,2 %, Gewicht pro Volumen, Phenol enthält, worauf man den pH-Wert mit 10-prozentiger wässriger Kaliumhydroxidlösung auf 10 einstellt. Die Endlösung besteht aus 122 Liter und enthält 683,2 g Gesamtfeststoffe, was einer Konzentration von 5,6 mg/ml entspricht. Die Lösung enthält 98,088 g Glucagon, was eine Glucagonkonzentration von 804 mcg/ml ergibt. Die Glucagonreinheit liegt bei 14,36 %, und die Glucagonausbeute beträgt 68,12 %.

C. Zwischenkristallisation

Der pH-Wert der Glucagonfibrillenlösung wird unter Verwendung von 10-prozentiger wässriger Phosphorsäure auf 7,0 eingestellt. Die Lösung versetzt man dann unter Erhitzen auf 60 ⁰C derart mit Wasser, daß sich ein Volumen von insge-

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samt 137 Litern und eine Feststoffkonzentration von 5,0 mg/ml ergibt. Hierauf wird die Lösung durch Zusatz von weiterer 10-prozentiger wässriger Phosphorsäure auf pH 5,0 eingestellt und anschließend heiß filtriert. Sodann kühlt man das Filtrat 72 Stunden auf etwa 5 ⁰C. Hierauf wird die Mutterlauge durch Dekantieren und Zentrifugieren entfernt, die man zur weiteren Aufarbeitung aufhebt. Die Glucagonkristalle werden in 9,0 Liter wässrigem Ammoniak vom pH 9,5 gelöst, worauf man die Lösung filtriert. Eine Teilmenge von 1 Liter dieser Lösung wird für das später folgende Beispiel 3 abgezogen, und diese Teilmenge entspricht 11,1 % der Lösung. Das Gesamtvolumen der Glucagonlösung von 9 Liter enthält 99,0 g Gesamtfeststoffe, was eine Konzentration von 11,0 mg/ml ergibt. Die Lösung enthält ferner 42,11 g Glucagon, was 4,679 mcg/ml entspricht. Die Glucagonreinheit liegt bei 42,54 %, und die Glucagonausbeute beträgt 29,2 4 %.

D. Gelfiltration

Die verbleibenden 8 Liter der Glucagonlösung gibt man auf eine aus 5 Abschnitten bestehende Säule der in Beispiel 2 D beschriebenen Art auf, worauf man die Säule in der bereits beschriebenen Weise bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 350 bis 500 ml/Min, eluiert. Die Elution verläuft in der bereits angegebenen Weise. Die glucagonhaltige Eluatfraktion besteht aus 30 Litern und enthält 66,0 g Gesamtfeststoffe, was einer Konzentration von 2,2 mg/ml entspricht. Der Glucagongehalt beträgt 36,84 g, was eine Konzentration von 1,228 mcg/ml ausmacht. Die Gucagonreinheit liegt bei 55,8 %, und die Ausbeute (durch die entfernte Teilmenge korrigiert) beträgt 28,78 %.

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E. Glucagonendkrista11isation

Die in obiger Weise erhaltene Glucagoneluatfraktion stellt man mit 0,1 Liter 10-prozentiger wässriger Phosphorsäure auf pH 7,5 ein. Die Lösung wird dann zur Glucagonkristallisation 16 Stunden bei 5 ⁰C gerührt, worauf man die entstandenen Kristalle etwa 72 Stunden absetzen läßt. Sodann wird die Mutterlauge durch Dekantieren und Zentrifugieren abgetrennt und für eine weitere Bearbeitung aufgehoben. Die Glucagonkristalle werden der Reihe nach mit 0,001-prozentiger Kochsalzlösung, absolutem Alkohol und Äther gewaschen, worauf man sie unter Vakuum trocknet. Die auf diese Weise erhaltenen Glucagonkristalle wiegen 33,654 g. Die Glucagonreinheit beträgt einer Aminosäureanalyse sowie einer Analyse durch Kationenaustauschchromatographie zufolge 84,35 %. Die Menge an gesamten reinem Glucagon liegt demnach bei 28,39 g, was einer 22,17-prozentigen Ausbeute entspricht.

Beispiel 3

Die oben von Beispiel 2 C entnommene 1 Liter-Teilmenge der Glucagonfibrillenlösung stellt ..tan bis zur leichten Schlierenbildung mit etwa 300 ml 10-prozentiger wässriger Phosphorsäure auf pH 7,8 ein. Die Lösung wird dann zuerst etwa 2 Stunden bei 25 ⁰C und anschließend etwa 16 Stunden bei 5 ⁰C gerührt. Die dabei entstandenen Glucagonkristalle läßt man etwa 72 Stunden absetzen. Die Mutterlauge wird durch Zentrifugieren abgetrennt und für eine weitere Aufarbeitung aufgehoben. Die Glucagonkristalle werden der Reihe nach mit Salzlösung, absolutem Alkohol und Äther gewaschen, worauf man sie unter Vakuum trocknet. Auf diese Weise erhält man 3,897 g Glucagon. Die Reinheit des Glucagons beträgt einer Aminosäureanalyse sowie einer Analyse durch Kationenaustauschchromatographie zufolge 81,5 %. Die tatsächliche Ausbeute an Glucagon entspricht somit 3,341 g oder 21,09 %.

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Aus obigen Beispielen wird klar, daß das erfindungsgemäße Verfahren ein höherreines Glucagon in höherer Ausbeute ergibt als das bevorzugteste bekannte Verfahren, und zwar sogar dann, wenn man dieses Verfahren mit einer Gelfiltrationsstufe koppelt.

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren läßt sich anhand der Zeichnung besser verstehen. Die Zeichnung stellt ein Elutionsdiagramm oder Elutionsprofil dar, das für jede der Gelfiltrationsstufen von Beispiel 1 charakteristisch ist. Sie zeigt eine Auftragung der Absorption bei 280 nm gegen das Eluatvolumen in Liter sowie eine Auftragung des Glucagongehalts ausgewählter Fraktionen gegen das Eluatvolumen in Liter. Das Diagramm gibt demzufolge sowohl den Proteingehalt als auch den Glucagongehalt des im Verlaufe der Elution aufgefangenen Eluats an. Es macht klar, daß es hierbei zu einer Elution des Glucagons in einem verhältnismäßig scharfen Bereich kommt, obwohl auch andere Proteine kontinuierlich durch die Säule laufen.

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Leerseite

Claims

P atenta η Sprüche

1.J Verfahren zur Reinigung von Glucagon, dadurch

gekennzeichnet , daß man

(B) mit dem aufgequollenen Gel eine Säule bepackt,

(C) die bepackte Säule mit einer wässrigen Lösung, die einen pH-Wert von etwa 9 bis etwa 11 hat, von Glucagon mit einer Reinheit von wenigstens etwa 0,1 % versetzt, wobei diese Glucagonlösung wenigstens etwa 0,01 mg Glucagon pro ml Lösung enthält und weniger als etwa 10 Gewichtsprozent pro Volumen Gesamtproteinfeststoffe aufweist, und wobei man auf die Säule eine solche Gesamtmenge Glucagon aufgibt, daß sich eine Säulenbeladung von etwa 0,01 bis etwa 5 g pro Liter Bettvolumen ergibt, und

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Gel verwendet, das über eine Wasserrückaufnahme im Bereich von etwa 4 bis etwa 98 % verfügt.

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Gel verwendet, das über eine VJasserrückaufnahme im Bereich von etwa 5 bis etwa 20 % verfügt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Gel ein vernetztes Dextran verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß dieses Gel über eine Wasserrückaufnahme von etwa 5 % verfügt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß dieses Gel Teilchendurchmesser im Bereich von etwa 20 bis etwa 80 Mikron aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , daß pan bei einer Säulenbeladung im Bereich von etwa 0,08 bis etwa 3,1 g pro Liter Bettvolumen arbeitet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Eluiermittel verwendet, das bis zu etwa 0,01 Mol pro Liter eines gelatbildenden Mittels für zweiwertige Metallionen der Formel

Ri

(CHs)m—/Cm — (CHa) p-

R3/n

—N—(CHs) ι

R4

enthält.

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worin die Substituenten R₁ und R₅ unabhängig für Carboxymethyl, Carboxyäthyl/ C.-C,-Alkyl oder C.-Cg-Hydroxyalkyl stehen, die Substituenten R- und R, unabhängig Carboxymethyl oder Carboxyäthyl bedeuten, der Substituent R₃ Wasserstoff, Hydroxy oder C₁-Cg-AIlCyI ist, der Substituent R. Wasserstoff, Carboxymethyl oder Carboxyäthyl darstellt, m für eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 6 steht, η den Wert O oder 1 hat, ρ für die Zahl O oder 1 steht, r eine ganze Zahl von 2 bis schließlich 6 darstellt und s eine Zahl von O bis einschließlich 2 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man als Gelatbildungsmittel Äthylendiamin-Ν,Ν,Ν',N'-tetraessigsäure verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Eluiermittel verwendet, das bis zu etwa 0,5 Volumenprozent Butanol als Stabilisator enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer Butanolmenge von 0,1 Volumenprozent arbeitet.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die Eluierung bei Umgebungstemperatur durchführt.

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