CN113024658B - 一种纯化利拉鲁肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纯化利拉鲁肽的方法，包括以下步骤：将粗肽溶解并过滤，然后用反相HPLC进行纯化，纯化的过程中，先用流动相为低pH值的缓冲盐A1和B冲洗，严格控制此时的制备柱温和流动相的温度，梯度洗脱一定时间后，保持样品在制备柱上不被洗脱；而后更换流动相为高pH值的A2和B冲洗，同时改变制备柱温和梯度，并严格控制此时的制备柱温和流动相的温度，以B梯度洗脱，收集合格的馏分；将收集的合格馏分进行脱盐，浓缩后冻干。本发明能够一步纯化达到最大除杂效果，只用一步纯化即可以收集到合格的样品，提高产品的质量和收率，同时能够减少废液，绿色环保，有利于工业化生产。

Description

一种纯化利拉鲁肽的方法

技术领域

本发明属于纯化方法技术领域，具体涉及一种纯化利拉鲁肽的方法。

背景技术

利拉鲁肽是一种长效治疗II型糖尿病的胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物，属于GLP-1受体激动剂，是首个为II型糖尿病治疗开发的人高血糖素样多肽-1(GLP-1)类似物。由诺和诺德公司开发研制，并于2010年1月25日获得FDA批准上市，于2011年3月4日获SFDA批准在中国上市。利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，不仅作用时间长，而且充分保留了天然GLP-1的多项生理活性，可安全有效降糖并可能对多种心血管危险因素有保护作用，为2型糖尿病的治疗带来了新的选择。临床治疗效果令人鼓舞。

利拉鲁肽为三十一肽，氨基酸序列如下：

NH₂-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH。

人类GCG基因(HGNC：4191)编码多种相关肽，包括胰高血糖素，胰高血糖素样肽1(GLP-1)和胰高血糖素样肽2(GLP-2)。它们之间具有相当大的序列同源性，参与控制血糖稳态，肠细胞增殖和饱腹感。GLP-1功能异常与肥胖，餐后反应性低血糖和2型糖尿病有关。因此，GLP-1类似物在药物研究中具有相当大的意义。在吉拉毒蜥(Helodermasuspectum)中发现的肽激素exendin-4的变体和衍生物以及GLP-1肽本身的变体和衍生物正受到广泛研究。市场上已有的这类药物包括艾塞那肽(Exenatide)和利西拉来(Lixisenatide)，两者均自exendin-4肽衍生，以及自GLP-1衍生的利拉鲁肽。

利拉鲁肽(N-ε-(γ-Glu(N-α-hexadecanoyl)))-Lys26Arg34-GLP-1(7-37)，也称为NN2211，已被批准用于治疗2型糖尿病和治疗有相关合并症的成人肥胖症。

该物质通过重组技术可以工业规模生产。WO 1998/008871披露了使重组表达的亲本肽与Nα-十六烷酰基-Glu(ONSu)-OtBu反应以获得利拉鲁肽。

人们期望有完全化学合成的方法大规模制备胰高血糖素样肽如利拉鲁肽。肽的化学合成已在文献中广泛记载。化学肽合成可以区分为两种标准方法，即液相肽合成(LPPS)和固相肽合成(SPPS)。此外，还可以利用混合方法，即首先通过上述技术之一合成片段，然后使用另一种技术将片段连接在一起。LPPS，也称为溶液肽合成，在均相反应介质中进行，连续偶联产生所需的肽。在SPPS中，经连续加入构成给定序列的受保护氨基酸而组装成C-末端锚定在不溶性聚合物树脂上的肽。因为生长的肽链与不溶性载体结合，所以可以通过简单过滤除去过量的试剂和可溶性副产物。然而，特别是对于大肽的合成，除了在脱保护期间或由于降解而形成的副产物之外，树脂结合的副产物也会累积。结果，最终产品的纯化可能非常具有挑战性。胰高血糖素样肽的纯化由于其聚集倾向而变得特别困难。已知胰高血糖素和胰高血糖素样肽在酸性pH下倾向于聚集(例如，European J.Biochem.11(1969)37-42)。现有的纯化工艺会分别使用酸性和碱性的纯化流动相，这会导致在酸性条件下出现的聚集杂质，降低产品的收率和纯度，且现有的纯化工艺会使用两种或两种以上的固定相，这也会导致纯化成本上升。目前也有不少针对纯化利拉鲁肽的方法以及相关的专利，但步骤繁琐并且收率很低。

专利申请CN-A 103275208公开了利拉鲁肽的纯化方案，包括使用C18柱的反相高效色谱(RP-HPLC)，流动相由0.1％三氟乙酸(TFA)溶液和乙腈组成，或由1％乙酸水溶液和乙腈组成，总产量为20.2％。因为在酸性条件纯化，所以无法避免分子间聚集的问题。

WO2011/161007公开了一种纯化GLP-1衍生物的方法。该方法涉及二维RP-HPLC，其中流动相中的有机溶剂是乙腈，第二维使用pH8.0-11.0的碱性缓冲液进行。在优选的实施方案中，C18柱与pH值为2.4的磷酸铵/乙腈一起用作第一维的流动相，pH为9.5的乙酸铵/乙腈或碳酸铵/乙腈作为第二维的流动相。报告的最大纯度为97.4％。因此，纯度不如所希望的那么高，并且肽在碱性缓冲液中获得，可能有不利于肽储存的缺点，特别是因为WO2011/161007中使用的碱性缓冲剂是不可蒸发的。去除其碱性缓冲剂可能需要额外的脱盐步骤。

EP-A 2813514公开了一种纯化利拉鲁肽的方法。该方法包括三维RP-HPLC纯化，其中辛基硅烷键合的二氧化硅作为固定相，水性异丙醇/TFA/乙腈体系作为第一维的流动相；氰基硅烷键合二氧化硅作为固定相，高氯酸/乙腈体系作为第二维流动相；辛基硅烷键合的二氧化硅作为固定相，氨水/乙腈体系作为第三维流动相。虽然在这个费力的程序中三个后续HPLC纯化步骤各自使用不同固相和完全不同的流动相，但报道的最大纯度却为98.7％。

WO2014/199397公开了使用C8柱和TFA/甲醇/乙腈系统作为流动相，通过RP-HPLC对经混合方法合成的粗利拉鲁肽进行纯化。获得的组合物包含大量有毒甲醇。据报道，所得纯度高于97％。

WO2010/066734公开了逆流色谱用于肽纯化的用途。反相和阴离子交换柱用作固定相。这里，这种基于反离子的方法是相当理论性的描述。这种方法相当复杂。

WO2000/055203和WO2000/055184公开了通过离子交换色谱法纯化肽。类似地，WO2005/019261公开了通过离子交换色谱法从外消旋污染物中分离利拉鲁肽的方法由这些方法获得的组合物含有相当大量的盐，其通常高于所需的盐，必须在进一步的纯化步骤中除去。

WO2011/107447公开了通过RP-HPLC纯化各种肽，其中流动相的pH保持在肽的等电点的1个单位内，并且洗脱优选用酸性范围的pH梯度实现。

EP-B 1664109公开了通过RP-HPLC纯化肽，其中流动相包含醇和缓冲剂，其在选自pH4-10的设定点处严格控制pH值。

WO2016/005960公开了利拉鲁肽的两步纯化方案，其描述了使用不规则C18二氧化硅介质(10微米粒径)和流动相(包含pH8.0的10mM Tris)的第一纯化步骤。第二步使用5微米粒径的C18RP-HPLC介质和包含0.1％TFA的流动相。用乙腈的逐步梯度进行洗脱。合并级分的平均纯度为97％，因此不如所希望的高。而且，使用两种不同的固定相是不经济的。可见，尽管有大量现有技术，仍然需要改进方法，能够工业化生产高纯度利拉鲁肽。有鉴于此，本发明提供一种纯化利拉鲁肽的方法。该方法能够避免上述技术的不利因素，避免纯化过程中的分子间聚集，缩短制备的流程和时间，降低纯化的成本，减少废液排放，提高产品质量和收率，有利于工业化生产。

发明内容

为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种纯化利拉鲁肽的方法。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种纯化利拉鲁肽的方法，包含以下步骤：

步骤1：将粗肽溶解并过滤，然后用反相HPLC进行纯化，纯化的过程中，先用流动相为低pH值的缓冲盐A1和B冲洗，严格控制此时的制备柱温和流动相的温度，梯度洗脱一定时间后，保持样品在制备柱上不被洗脱；而后更换流动相为高pH值的A2和B冲洗，同时改变制备柱温和梯度，并严格控制此时的制备柱温和流动相的温度，以B梯度洗脱，收集合格的馏分；

步骤2：将步骤1收集的合格馏分进行脱盐，浓缩后冻干。

进一步地，步骤1中粗肽溶解所用的溶剂为碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸铵、碳酸钠或碳酸钾其中的任意一种，或多种任意比例的混合，并以碱液调节pH为8.0～10.0，所用的碱为氨水、氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，固体盐的浓度为50～500mmol/L。

进一步地，步骤1中所使用的制备柱的填料为反相C18、反相C8或反相C4，填料粒径小于等于10μm，填料孔径为

进一步地，A1相为碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸铵、碳酸钠或碳酸钾其中的任意一种，或多种任意比例的混合，B相为乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇其中的任意一种，或多种任意比例的混合，B相的洗脱梯度为20％-60％；

A2相为碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸铵、碳酸钠或碳酸钾其中的任意一种，或多种任意比例的混合，B相为乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇其中的任意一种，或多种任意比例的混合，B相的洗脱梯度为20％-60％，梯度洗脱前先采用5％-15％B冲洗5-15min。

进一步地，步骤1中A1以二氧化碳调节pH值，pH值为4.5～7.5。

进一步地，步骤1中A2以氨水、氢氧化钠或氢氧化钾调节pH值，pH值为8.0～11.0。

进一步地，步骤1中A1或A2的固体缓冲盐的浓度为50～500mM。

进一步地，步骤1中的流动相温度为15～50℃；步骤1中的制备柱温为15～50℃。

进一步地，步骤1中合格的馏分为纯度≥99.0％，单杂≤0.10％。

进一步地，步骤2中脱盐采用与步骤1同一根制备柱，以水或二氧化碳的水溶液为A相，以乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇为B相；B相的洗脱梯度为10％-80％；梯度洗脱前先采用5％-15％B冲洗5-15min。

进一步地，步骤2中脱盐采用的二氧化碳的浓度为1-100mmol/L。

本发明的有益效果为：(1)样品先用低pH的流动相洗脱，控制柱温，使样品在制备柱上达到前杂与主峰分离，但是保持样品不被洗脱；而后改用高pH值流动相洗脱，并改变柱温，分离后杂，同时收集合格馏分。即只使用一种固定相，一套制备纯化系统，一步纯化收集到纯度≥99.0％、杂质≤0.10％的合格馏分，提高产品的质量和收率，缩短生产的周期，同时能够减少废液，绿色环保，有利于工业化生产。

(2)转盐纯化使用同一根制备柱，减少了操作，简化了流程。

(3)转盐使用饱和二氧化碳调节pH值，使样品可以有效洗脱，增加转盐的回收率。

附图说明

图1为实施例1的利拉鲁肽精肽的UPLC检测色谱图；

图2为实施例2的利拉鲁肽精肽的UPLC检测色谱图；

图3为实施例3的利拉鲁肽精肽的UPLC检测色谱图；

图4为对比例1的利拉鲁肽精肽的UPLC检测色谱图；

图5为对比例2的利拉鲁肽精肽的UPLC检测色谱图；

图6为对比例3的利拉鲁肽精肽的UPLC检测色谱图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。

实施例1：利拉鲁肽的制备

第一步，利拉鲁肽纯化

取100.0g利拉鲁肽粗肽，含利拉鲁肽76.8g，溶解于4.5L的碳酸氢铵(100mM)溶液中，加入0.5L乙腈，0.45μm过滤后，滤液分两次以10μm的C18制备柱(内径15cm，柱长30cm，填料孔径为

)纯化，即每次上样50.0g。先设定流动相A为A1，200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，二氧化碳调节pH为7.5，流动相A1处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为40％B-55％B(100min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，洗脱至100min时，停止流速，更换洗脱条件。

此时流动相A切换为A2，200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，氢氧化钠调节pH为9.5，流动相A2处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，先用90％A2+10％B冲洗10min，然后进行梯度洗脱，洗脱梯度为42％B-57％B(100min)，控制流动相A2和B为20℃、柱温为20℃，收集目标馏分，将纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤99.0％的样品回收纯化，共回收一次，定量后合格馏分为58.6g。

第二步，转盐纯化

将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以上述精制纯化的制备柱脱盐，流动相A为30mM二氧化碳水溶液，流动相B为乙腈。全部上样，上样后90％A+10％B冲洗15min，而后梯度洗脱，20％B-80％B(30min)，收集馏分，旋蒸冻干得54.5g，总收率为54.5％。冻干精肽的UPLC检测图谱见图1，纯度为99.79％，最大单杂为0.06％。

实施例2：利拉鲁肽的制备

第一步，利拉鲁肽纯化

取100.0g利拉鲁肽粗肽，含利拉鲁肽76.8g，溶解于4.5L的碳酸氢钠(80mM)溶液中，加入0.5L乙腈，0.45μm过滤后，滤液分两次以10μm的C8制备柱(内径15cm，柱长30cm，填料孔径为

)纯化，即每次上样50.0g。先设定流动相A为A1，100mM碳酸氢铵+100mM碳酸氢钾，二氧化碳调节pH为7.5，流动相A1处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为40％B-55％B(100min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，洗脱至100min时，停止流速，更换洗脱条件。

此时切换流动相A为A2，50mM碳酸氢铵+200mM碳酸氢钾，氢氧化钾调节pH为9.5，流动相A2处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，先用90％A2+10％B冲洗10min，然后进行梯度洗脱，洗脱梯度为42％B-55％B(100min)，控制流动相A2和B为20℃、柱温为20℃，收集目标馏分，将纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤99.0％的样品回收纯化，共回收两次，定量后合格馏分为60.0g。

第二步，转盐纯化

将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以上述精制纯化的制备柱脱盐，流动相A为20mM二氧化碳水溶液，流动相B为乙腈。全部上样，上样后90％A+10％B冲洗15min，而后梯度洗脱，20％B-80％B(30min)，收集馏分，旋蒸冻干得56.5g，总收率为56.5％。冻干精肽的UPLC检测图谱见图2，纯度为99.86％，最大单杂为0.05％。

实施例3：利拉鲁肽的制备

第一步，利拉鲁肽纯化

取100.0g利拉鲁肽粗肽，含利拉鲁肽76.8g，溶解于4.5L的碳酸氢钾(200mM)溶液中，加入0.5L乙腈，0.45μm过滤后，以10μm的C4制备柱(内径15cm，柱长30cm，填料孔径为

)纯化，共分两次进行。先设定流动相A为A1，100mM碳酸氢铵+100mM碳酸氢钾，二氧化碳调节pH为7.50，流动相A1处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为37％B-45％B(100min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，洗脱至100min时，停止流速，更换洗脱条件。

此时切换流动相A为A2，50mM碳酸氢铵+200mM碳酸氢钾，氢氧化钾调节pH为9.5，流动相A2处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，先用90％A2+10％B冲洗10min，然后进行梯度洗脱，洗脱梯度为40％B-50％B(100min)，控制流动相A2和B为20℃、柱温为20℃，收集目标馏分，将纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤99.0％的样品回收纯化，共回收两次，定量后合格馏分为62.0g。

第二步，脱盐纯化

将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以上述精制纯化的制备柱脱盐，流动相A为60mM二氧化碳水溶液，流动相B为乙腈。全部上样，上样后90％A+10％B冲洗15min，而后梯度洗脱，20％B-80％B(30min)，收集馏分，旋蒸冻干得59.5g，总收率为59.5％。冻干精肽的UPLC检测图谱见图3，纯度为99.78％，最大单杂为0.07％。

对比例1：利拉鲁肽的制备

1，粗肽溶解过滤

取100.0g利拉鲁肽粗肽，含利拉鲁肽76.8g，溶解于4.5L的水，再加入0.5L乙腈，以氨水调节pH为7.5，全部溶解后以0.45μm过滤。

2，第一步纯化

将上述粗肽溶液以10μm的C18制备柱(内径15cm，柱长25cm，填料孔径为

)纯化，共分三次进行。流动相A1为200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，氢氧化钠调节pH为8.5，流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为40％B-55％B(80min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，收集主峰，以UPLC检测馏分的纯化。将纯度≥96.0％的馏分视为一步纯化的合格馏分，待进行二步纯化；将85％＜纯度＜96.0％进行一步回收纯化，共进行两次回收纯化，合格馏分定量得54.5g。

3，第二步纯化

将上述合格馏分加入等体积的水稀释，将样品分作三份，分别进行第二步纯化。流动相A2为1.0％磷酸，以氢氧化钠调节pH为2.5，流动相B为乙腈，控制流动相A2和B为25℃、柱温为25℃，流速为620mL/min，洗脱梯度为40％B-55％B(80min)，收集目标馏分，将纯度≥98.0％，单杂≤0.30％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤98.0％的样品回收纯化，共回收两次，定量后合格馏分为45.0g。

4，脱盐

将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以聚合物柱(纳微UniPMM-60μm-

柱内径为15cm，柱长25cm)脱盐，流动相A3为纯水，流动相B为乙腈。分两次上样，上样后90％A3+10％B冲洗30min，而后梯度洗脱，20％B-80％B(30min)，收集馏分，旋蒸冻干得33.5g，总收率为33.5％。冻干精肽的UPLC检测图谱见图4，纯度为99.35％，最大单杂为0.27％。

对比例2：利拉鲁肽的制备

1，粗肽溶解过滤

取100.0g利拉鲁肽粗肽，含利拉鲁肽76.8g，溶解于4.5L的水，再加入0.5L乙腈，以氨水调节pH为7.5，全部溶解后以0.45μm过滤。

2，第一步纯化

将上述粗肽溶液以10μm的C8制备柱(内径15cm，柱长25cm，填料孔径为

)纯化，共分三次进行。流动相A1为200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，氢氧化钠调节pH为9.0，流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为38％B-48％B(80min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，收集主峰，以UPLC检测馏分的纯化。将纯度≥96.0％的馏分视为一步纯化的合格馏分，待进行二步纯化；将85％＜纯度＜96.0％进行一步回收纯化，共进行两次回收纯化，合格馏分定量得57.8g。

3，第二步纯化

将上述合格馏分加入等体积的水稀释，将样品分作三份，分别进行第二步纯化。流动相A2为1.0％磷酸，以氢氧化钠调节pH为2.5，流动相B为乙腈，控制流动相A2和B为25℃、柱温为25℃，流速为620mL/min，洗脱梯度为38％B-48％B(60min)，收集目标馏分，将纯度≥98.0％，单杂≤0.30％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤98.0％的样品回收纯化，共回收两次，定量后合格馏分为46.5g。

4，脱盐

将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以聚合物柱(纳微UniPMM-60μm-

柱内径为15cm，柱长25cm)脱盐，流动相A3为纯水，流动相B为乙腈。分两次上样，上样后90％A3+10％B冲洗30min，而后梯度洗脱，20％B-80％B(30min)，收集馏分，旋蒸冻干得35.7g，总收率为35.7％。冻干精肽的UPLC检测图谱见图5，纯度为99.19％，最大单杂为0.43％。

对比例3：利拉鲁肽的制备

1，粗肽溶解过滤

取100.0g利拉鲁肽粗肽，含利拉鲁肽76.8g，溶解于4.5L的水，再加入0.5L乙腈，以氨水调节pH为7.5，全部溶解后以0.45μm过滤。

2，第一步纯化

将上述粗肽溶液以10μm的C4制备柱(内径15cm，柱长25cm，填料孔径为

)纯化，共分三次进行。流动相A1为200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，氢氧化钠调节pH为9.0，流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为35％B-45％B(80min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，收集主峰，以UPLC检测馏分的纯化。将纯度≥96.0％的馏分视为一步纯化的合格馏分，待进行二步纯化；将85％＜纯度＜96.0％进行一步回收纯化，共进行两次回收纯化，合格馏分定量得59.0g。

3，第二步纯化

将上述合格馏分加入等体积的水稀释，将样品分作三份，分别进行第二步纯化。流动相A2为1.0％磷酸，以氢氧化钠调节pH为2.50，流动相B为乙腈，控制流动相A2和B为25℃、柱温为25℃，流速为620mL/min，洗脱梯度为35％B-45％B(60min)，收集目标馏分，将纯度≥98.0％，单杂≤0.30％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤98.0％的样品回收纯化，共回收两次，定量后合格馏分为48.5g。

4，脱盐

将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以聚合物柱(纳微UniPMM-60μm-

柱内径为15cm，柱长25cm)脱盐，流动相A3为纯水，流动相B为乙腈。分两次上样，上样后90％A3+10％B冲洗30min，而后梯度洗脱，20％B-80％B(30min)，收集馏分，旋蒸冻干得36.5g，总收率为36.5％。冻干精肽的UPLC检测图谱见图6，纯度为99.29％，最大单杂为0.20％。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤1：将粗肽溶解并过滤，然后用反相HPLC进行纯化，纯化的过程中，先用流动相为低pH值的缓冲盐A1和B冲洗，严格控制此时的制备柱温和流动相的温度，梯度洗脱一定时间后，保持样品在制备柱上不被洗脱；而后更换流动相为高pH值的A2和B冲洗，同时改变制备柱温和梯度，并严格控制此时的制备柱温和流动相的温度，以A2和B梯度洗脱，收集合格的馏分；

流动相为低pH值的缓冲盐A1和B中，所述A1相为碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸铵、碳酸钠或碳酸钾其中的任意一种，或多种任意比例的混合，B相为乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇其中的任意一种，或多种任意比例的混合，B相的洗脱梯度为20％-60％；所述A1以二氧化碳调节pH值，pH值为4.5～7.5；

流动相为高pH值的A2和B中，所述A2相为碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸铵、碳酸钠或碳酸钾其中的任意一种，或多种任意比例的混合，B相为乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇其中的任意一种，或多种任意比例的混合，B相的洗脱梯度为20％-60％，梯度洗脱前先采用5％-15％B冲洗5-15min；所述A2以氨水、氢氧化钠或氢氧化钾调节pH值，pH值为8.0～11.0；

所述流动相温度为15～50℃；制备柱温为15～50℃；

步骤2：将步骤1收集的合格馏分进行脱盐，浓缩后冻干。

2.根据权利要求1所述的纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，所述步骤1中所使用的制备柱的填料为反相C18、反相C8或反相C4，填料粒径小于等于10μm，填料孔径为

3.根据权利要求1所述的纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，所述步骤1中A1或A2的固体缓冲盐的浓度为50～500mM。

4.根据权利要求1所述的纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，所述步骤1中合格的馏分为纯度≥99.0％，单杂≤0.10％。

5.根据权利要求1所述的纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，所述步骤2中脱盐采用与步骤1同一根制备柱，以水或二氧化碳水溶液为A相，以乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇为B相；B相的洗脱梯度为10％-80％；梯度洗脱前先采用5％-15％B冲洗5-15min。

6.根据权利要求5所述的纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤2中脱盐采用的二氧化碳的浓度为1-100mmol/L。

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