CN114656550A - 一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法及应用 - Google Patents

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Abstract

一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法及应用，属于药物纯化技术领域。本发明纯化方法包括：(1)取粗肽，溶解于溶剂中，加入乙腈，过滤后收集样品液；(2)进行两次反相HPLC纯化，收集合格馏分；(3)加入等体积水稀释，以制备柱脱盐，收集脱盐馏分；(4)低温处理并保持温度，调节pH，使目的肽沉淀析出后静置，过滤，真空干燥，得到精肽粉末。本发明CO2沉淀析出目的肽，即纯化后的合格馏分无需进行减压浓缩或超滤，冷冻干燥等操作，省去旋蒸的耗时，纯化过程简便易行，耗时短，能耗少，可用于规模化、工业化生产，大大降低了生产成本，提高了生产效率。对利拉鲁肽或者索玛鲁肽的纯化馏分均适用，效果显著。

Description

一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法及应用
技术领域
本发明属于药物纯化技术领域，具体涉及一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法及应用。
背景技术
糖尿病是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足以及胰岛素利用障碍引发机体糖、蛋白质、脂质等一系列代谢紊乱性疾病。糖尿病主要分为特殊类型糖尿病、I型糖尿病和II型糖尿病。我国95％以上的糖尿病患者患有II型糖尿病，该类型的糖尿病患者表现为胰岛素进行性分泌不足和胰岛素抵抗两者兼有。
目前，市场上针对II型糖尿病的降糖药种类很多，包括二甲双胍、磺脲类药物和胰高血糖样肽-1(GLP-1)的受体激动素等，其中利拉鲁肽和索玛鲁肽均是长效的GLP-1受体激动剂，该两种药物是诺和诺德公司通过基因工程菌解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharom ycescerevisiae)发酵获得，兼具降糖及减肥功效的GLP-1降糖药。
利拉鲁肽的化学表述为Arg 34Lys 26-[N-ε-(γ-Glu-(N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37，分子式为C172H265N43O51，相对分子质量3751.2，CAS登记号为204656-20-2，氨基酸序列如下：NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH。索玛鲁肽的分子式为C187H291N45O59，其对应的分子量为4111.1，肽序列结构如下：H-His7-Ala8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic-Acid-Mono-tert-butylester)-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Arg34-Gly35-Arg36-Gly37-OH。与天然GLP-1相比，该两种药物的药效相当且作用时间更长。
目前，利拉鲁肽和索玛鲁肽主要采用基因重组技术结合微生物发酵或逐步偶联的固相合成方法进行制备。采用基因重组技术合成利拉鲁肽时，由于Arg34-GLP-1(7-37)-OH的侧链处于未保护状态，与N-α-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应时会产生较多的杂质；采用逐步偶联的固相合成方法制备利拉鲁肽和索玛鲁肽时，由于利拉鲁肽的序列中有较多的疏水氨基酸，逐步偶联时树脂收缩严重，反应不完全，导致收率偏低，同时粗肽中与产品性质相近的杂质较多，纯化比较困难；另外，由于索玛鲁肽的肽链上Lys[[N6-[N-(17-carboxy(R3)-1-oxoheptadecyl-L-γ-glutamyl[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl]]基团的存在，使得后续的氨基酸在偶联的时候十分困难，往往导致偶联不完全，缺失肽、杂肽大量产生。索玛鲁肽化学合成专利申请号CN201410784161.4公开了使用多种大量有机溶剂，对环境不友好，且步骤繁琐不利于大规模工业放大，工艺杂质多，总收率低。此外，对于长肽的合成，除了在脱保护期间或由于降解而形成的副产物之外，树脂结合的副产物也会累积，导致最终粗肽产品的纯化难度很大。因此，提供一种简单、高效的利拉鲁肽或索玛鲁肽的纯化方法具有重要的现实意义。已公开的纯化专利中，对于纯化后的合格馏分的处理方式大同小异，且处理时间长，延长了产品的生产周期，同时耗能多，大大提高了纯化成本。
公开号为CN 105017381A的专利公开了利拉鲁肽的纯化方案。将转盐后的所有肽溶液，进行减压浓缩至20mg/mL，浓缩温度不超过40℃，然后冷冻干燥得纯度大于98.0％的利拉鲁肽。公开号为CN 107903318A和CN 108794618A的专利申请中公开的利拉鲁肽纯化方案以及公开号为201810663478.0和201811482820.3的专利申请公开的索玛鲁肽纯化方案中均报道了将合格的利拉鲁肽馏分或索玛鲁肽馏分用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在～0.09MPa以下除去部分乙腈，得到纯化的利拉鲁肽或索玛鲁肽溶液。工业化生产时，收集到纯化的利拉鲁肽馏分体积非常庞大，用旋转蒸发器处理馏分的方式效率低下，耗时长，且长时间的旋蒸易对目的肽的稳定性造成影响。
公开号为CN 109503705 A的专利申请公开了一种纯化利拉鲁肽的方法，将二步纯化之后的样品经过超滤膜进行脱盐、低温浓缩、去除硫酸盐，回收得到高浓度样品。冷冻、干燥：将样品放进冻干盘，进行冷冻干燥。但是采用超滤的方式浓缩馏分的体积，截留在超滤膜上的利拉鲁肽逐渐增多，浓度越来越多，导致目的肽发生聚合，不可避免的产生聚合杂质。
公开号为CN 109311960A的专利申请公开了一种纯化利拉鲁肽的方法。报道了为了避免肽质量的降低，技术人员会仔细且常规地优化包括样品储存的纯化步骤的条件。为此，可以将馏分合并，沉淀，喷雾灭菌，冷冻干燥，冷冻，冷藏，稀释，浓缩，和/或与稳定缓冲剂，碱，酸或其他物质混合。该专利虽然提到通过调节pH沉淀析出馏分中的目的肽，但沉淀需要重新溶解再冷冻干燥，不仅引入了新的盐杂质，而且工业生产所用冻干机，耗能高，大大提高了生产成本。因此，现有的纯化方案，仍然需要进一步的完善，以期达到快速且高效的处理大体积目的肽馏分，同时减少生产成本。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法及应用。本发明通过调节目的馏分的pH，使目的肽结晶析出，析出的固体通过真空干燥即可拿到合格的固体精肽粉末。本发明方法能够避免现有技术的不利因素，避免纯化过程中的分子间聚集，无需旋蒸浓缩和冷冻干燥，能够显著缩短生产周期，减少生产成本，提高产品质量和收率，有利于工业化生产。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取粗肽，溶解于溶剂中，加入乙腈，过滤后收集样品液；
(2)将上述步骤(1)得到的样品液进行两次反相HPLC纯化，收集合格馏分；
(3)将上述步骤(2)得到的合格馏分中加入等体积水稀释，以制备柱脱盐，收集脱盐馏分；(4)将上述步骤(3)得到的脱盐馏分低温处理并保持温度，加入CO2至饱和后加纯水调节pH或者加入酸性试剂调节pH，使目的肽沉淀析出后静置，过滤，真空干燥，得到精肽粉末。
所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(1)中溶剂包括碳酸氢铵溶液，所述粗肽与溶剂的质量体积比为1：30～50，所述乙腈的加入量为5％～20％。
所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(2)中反相HPLC纯化的具体操作为：以C18作为制备柱，设置流动相A为A1，流动相B为乙腈，第一次调节pH，控制A1所处密封压力罐的压力，进行第一次反相HPLC纯化30～50min，停止流速，更换洗脱条件，设置流动相A为A2，第二次调节pH，控制A2所处密封压力罐的压力，进行第二次反相HPLC纯化，收集目标馏分，将纯度≥99.0％，单杂≤0.10％作为合格馏分，将90.0％≤纯度≤99.0％的目标馏分再一次回收纯化。
所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述A1包括碳酸氢铵、碳酸氢钠中的一种或多种，第一次调节pH至7.3～7.7，控制A1所处密封压力罐的压力为0.1～0.5Mpa，所述第一次反相HPLC纯化的条件：流速为500～600mL/min，洗脱梯度为37％B-42％B，40min，控制流动相A1和B为20～30℃，柱温为20～30℃。
所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述A2包括碳酸氢铵、碳酸氢钠中的一种或多种，第二次调节pH为9.3～9.7，控制A2所处密封压力罐的压力为0.1～0.5Mpa，所述第二次反相HPLC纯化的条件为：流速500～600mL/min，采用90％A2+10％B冲洗10min，进行梯度洗脱，洗脱梯度为35％B-45％B，100min，控制流动相A2和B为20～30℃，柱温为20～30℃。
所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中制备柱脱盐的方法为：设置流动相A为纯水，流动相B为乙腈，全部上样后以90％A+10％B冲洗15min，以20％B-80％B，30min梯度洗脱，收集脱盐馏分。
所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(4)中低温处理的温度为-5℃～10℃，调节pH至2.0～6.0，优选pH值为4.0～6.0。
所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(4)中所述酸性试剂包括碳酸、甲酸、乙酸、磷酸、盐酸、硫酸和高氯酸中的一种或多种，优选酸性试剂为碳酸。
任一所述的利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法制备得到的利拉鲁肽或索马鲁肽。
任一所述的利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法在大量、精细制备利拉鲁肽/索马鲁肽中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明CO2沉淀析出目的肽，即纯化后的合格馏分无需进行减压浓缩或超滤，冷冻干燥等操作，省去旋蒸的耗时，纯化过程简便易行，耗时短，能耗少，可用于规模化、工业化生产，大大降低了生产成本，提高了生产效率。对利拉鲁肽或者索玛鲁肽的纯化馏分均适用，效果显著。
2、本发明通过加入酸性调节剂能够快速的从大体积的馏分中分离得目的肽，且CO2有助于精肽样品的干燥，即析出的固体不用冷冻干燥，只需真空干燥即可，该技术方案省时高效、耗能少。
附图说明
图1为实施例1的利拉鲁肽精肽检测图谱；
图2为实施例1的利拉鲁肽高分子杂质检测图谱；
图3为实施例2的利拉鲁肽精肽检测图谱；
图4为实施例2的利拉鲁肽高分子杂质检测图谱；
图5为实施例3的索玛鲁肽精肽检测图谱；
图6为实施例3的索玛鲁肽高分子杂质检测图谱；
图7为实施例4的索玛鲁肽精肽检测图谱；
图8为实施例4的索玛鲁肽高分子杂质检测图谱；
图9为实施例5的利拉鲁肽精肽检测图谱；
图10为实施例5的利拉鲁肽高分子杂质检测图谱；
图11为实施例6的利拉鲁肽精肽检测图谱；
图12为实施例6的利拉鲁肽高分子杂质检测图谱；
图13为对比例1的利拉鲁肽精肽检测图谱；
图14为对比例1的利拉鲁肽高分子杂质检测图谱；
图15为对比例2的利拉鲁肽精肽检测图谱；
图16为对比例2的利拉鲁肽高分子杂质检测图谱；
图17为对比例3的索玛鲁肽精肽检测图谱；
图18为对比例3的索玛鲁肽高分子杂质检测图谱；
图19为对比例4的索玛鲁肽精肽检测图谱；
图20为对比例4的索玛鲁肽高分子杂质检测图谱。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：利拉鲁肽的分离纯化
一、粗肽预处理
取100.0g利拉鲁肽粗肽，含利拉鲁肽76.8g，溶解于4.5L的碳酸氢铵(100mM)溶液中，加入0.5L乙腈，过0.45μm微孔滤膜后得到样品液。
二、精制纯化
将上述样品液以10μm的C18制备柱(内径15cm，柱长30cm)纯化，共分两次进行。先设定流动相A为A1，200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，二氧化碳调节pH为7.5，流动相A1处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为37％B-42％B(40min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，洗脱至40min时，停止流速，更换洗脱条件。
此时流动相A切换为A2，200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，氢氧化钠调节pH为9.5，流动相A2处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，先用90％A2+10％B冲洗10min，然后进行梯度洗脱，洗脱梯度为35％B-45％B(100min)，控制流动相A2和B为20℃、柱温为20℃，收集目标馏分，将纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤99.0％的样品回收纯化，共回收一次。
三、转盐
将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以上述精制纯化的制备柱脱盐，流动相A纯水，流动相B为乙腈。全部上样，上样后90％A+10％B冲洗15min，而后梯度洗脱，20％B-80％B(30min)，收集馏分。
四、等电点沉淀析出精肽，真空干燥
将上述收集的馏分经低温处理至-5℃(并确保该馏分在之后的处理中保持在该温度)，通CO2至饱和，加纯水至馏分pH为4.0，利拉鲁肽沉淀析出，过滤(以0.1L/min的流速持续通CO2至过滤完成)，经UPLC分析检测，利拉鲁肽的沉淀回收率为96.3％；沉淀经真空干燥得到精肽60.1g，总回收率为60.1％。真空干燥精肽和高分子杂质的检测图谱分别如图1和2所示。
实施例2：利拉鲁肽的分离纯化
一、粗肽预处理
取100.0g利拉鲁肽粗肽，含利拉鲁肽76.8g，溶解于4.5L的碳酸氢铵(100mM)溶液中，加入0.5L乙腈，过0.45μm微孔滤膜后得到样品液。
第二步，精制纯化
将上述样品液以10μm的C18制备柱(内径15cm，柱长30cm)纯化，共分两次进行。先设定流动相A为A1，200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，二氧化碳调节pH为7.5，流动相A1处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为37％B-42％B(40min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，洗脱至40min时，停止流速，更换洗脱条件。
此时流动相A切换为A2，200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，氢氧化钠调节pH为9.5，流动相A2处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，先用90％A2+10％B冲洗10min，然后进行梯度洗脱，洗脱梯度为35％B-45％B(100min)，控制流动相A2和B为20℃、柱温为20℃，收集目标馏分，将纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤99.0％的样品回收纯化，共回收一次。
三、转盐
将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以上述精制纯化的制备柱脱盐，流动相A纯水，流动相B为乙腈。全部上样，上样后90％A+10％B冲洗15min，而后梯度洗脱，20％B-80％B(30min)，收集馏分。
四、等电点沉淀析出精肽，真空干燥
将上述收集的馏分经低温处理至0℃(并确保该馏分在之后的处理中保持在该温度)，通CO2至饱和，加纯水至馏分pH为5.0，静置1h，使精肽肽充分析出，过滤(以0.1L/min的流速持续通CO2至过滤完成)，经UPLC分析检测，利拉鲁肽的沉淀回收率为95.1％；沉淀经真空干燥得到精肽57.1g，总回收率为57.1％。真空干燥精肽和高分子杂质的检测图谱如图3和4所示。
实施例3：索玛鲁肽的分离纯化
一、粗肽预处理
取100.0g索玛鲁肽粗肽，含精肽56.8g，溶解于3.5L的碳酸氢铵(100mM)溶液中，加入0.35L乙腈，过0.45μm微孔滤膜后得到样品液。
二、精制纯化
将上述样品液以10μm的C8制备柱(内径15cm，柱长30cm)纯化，共分两次进行。先设定流动相A为A1，100mM碳酸氢铵，二氧化碳调节pH为6.5，流动相A1处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为25％B-45％B(60min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，洗脱至40min时，停止流速，更换洗脱条件。
此时流动相A切换为A2，200m M碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，氢氧化钠调节pH为9.5，流动相A2处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，先用90％A2+10％B冲洗10min，然后进行梯度洗脱，洗脱梯度为35％B-45％B(100min)，控制流动相A2和B为20℃、柱温为20℃，收集目标馏分，将纯度≥99.0％，单杂≤0.15％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤99.0％的样品回收纯化，共回收一次。
三、转盐
将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以上述精制纯化的制备柱脱盐，流动相A纯水，流动相B为乙腈。全部上样，上样后95％A+5％B冲洗15min，而后等度洗脱，50％B(30min)，收集馏分。
四、等电点沉淀析出精肽，真空干燥
将上述收集的馏分经低温处理至5℃(并确保该馏分在之后的处理中保持在该温度)，通CO2至饱和，加纯水至馏分pH为5，静置1h，使精肽肽充分析出，过滤(以0.1L/min的流速持续通CO2至过滤完成)，经UPLC分析检测，索玛鲁肽的沉淀回收率为95.6％；沉淀经真空干燥得到精肽38.3g，总回收率为38.3％。真空干燥精肽和高分子杂质的检测图谱分别如图5和6所示。
实施例4：索玛鲁肽的分离纯化
一、粗肽预处理
取100.0g索玛鲁肽粗肽，含精肽56.8g，溶解于3.5L的碳酸氢铵(100mM)溶液中，加入0.35L乙腈，过0.45μm微孔滤膜后得到样品液。
二、精制纯化
将上述样品液以10μm的C8制备柱(内径15cm，柱长30cm)纯化，共分两次进行。先设定流动相A为A1，100mM碳酸氢铵，二氧化碳调节pH为6.5，流动相A1处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，洗脱梯度为25％B-45％B(60min)，控制流动相A1和B为25℃、柱温为25℃，洗脱至40min时，停止流速，更换洗脱条件。
此时流动相A切换为A2，200mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，氢氧化钠调节pH为9.5，流动相A2处于密封的压力罐中，控制压力为0.1～0.5Mpa；流动相B为乙腈。流速为620mL/min，先用90％A2+10％B冲洗10min，然后进行梯度洗脱，洗脱梯度为35％B-45％B(100min)，控制流动相A2和B为20℃、柱温为20℃，收集目标馏分，将纯度≥99.0％，单杂≤0.15％的样品待转盐，90.0％≤纯度≤99.0％的样品回收纯化，共回收一次。
三、转盐
将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以上述精制纯化的制备柱脱盐，流动相A纯水，流动相B为乙腈。全部上样，上样后95％A+5％B冲洗15min，而后等度洗脱，50％B(30min)，收集馏分。
四、等电点沉淀析出精肽，真空干燥
将上述收集的馏分经低温处理至10℃(并确保该馏分在之后的处理中保持在该温度)，通CO2至饱和，加纯水至馏分pH为6.0，静置1h，使精肽肽充分析出，过滤(以0.1L/min的流速持续通CO2至过滤完成)，经UPLC分析检测，索玛鲁肽的沉淀回收率为95.1％；沉淀经真空干燥得到精肽35.7g，总回收率为35.7％。真空干燥精肽和高分子杂质的检测图谱分别如图7和8所示。
实施例5：利拉鲁肽的分离纯化
其他步骤与实施例1相同，与实施例1的区别在于：将上述收集的馏分用磷酸(85％)调pH至5.0，4℃条件静置2h，利拉鲁肽结晶析出，离心，固液分离。经UPLC分析检测，利拉鲁肽的沉淀回收率为95.7％；沉淀经1M氢氧化钠复溶至澄清(pH＝8.0±0.2)，后冷冻干燥得到精肽58.2g，总回收率为58.2％。冷冻干燥精肽和高分子杂质的检测图谱分别如图9和10。
实施例6：利拉鲁肽的分离纯化
其他步骤与实施例1相同，与实施例1的区别在于：将上述收集的馏分用冰醋酸调pH至4.5，4℃条件静置3h，利拉鲁肽结晶析出，离心，固液分离。经UPLC分析检测，利拉鲁肽的沉淀回收率为94.6％；沉淀经1M氢氧化钠复溶至澄清(pH＝8.0±0.2)，后冷冻干燥得到精肽56.9g，总回收率为56.9％。冷冻干燥精肽和高分子杂质的检测图谱分别如图11和12。
实施例7：利拉鲁肽的分离纯化
其他步骤与实施例1相同，与实施例1的区别在于：上述收集的馏分不做经低温处理，常温下通CO2至饱和，加纯水分别调馏分pH至5.0和6.0(pH无法下降至4.0)，4℃条件静置2h，利拉鲁肽结晶析出，过滤(以0.1L/min的流速持续通CO2至过滤完成)，经UPLC分析检测，利拉鲁肽的沉淀回收率为分别为93.5％和90.8％；沉淀经真空干燥分别得精肽50.3g和46.9g，总回收率分别为50.3％和46.9％。
实施例8：利拉鲁肽的分离纯化
其他步骤与实施例1相同，与实施例1的区别在于：上述收集的馏分分别经低温处理至-5℃和4℃(并确保该馏分在之后的处理中保持在该温度)，通CO2至饱和，加纯水分别调馏分pH至5.0，静置2h，利拉鲁肽结晶析出，过滤(以0.1L/min的流速持续通CO2至过滤完成)，经UPLC分析检测，利拉鲁肽的沉淀回收率为分别为96.7％和94.8％；沉淀经真空干燥分别得精肽62.0g和58.9g，总回收率分别为62％和58.9％。
对比例1：利拉鲁肽的分离纯化
一、粗肽溶解过滤
将100g粗肽(含76.8g利拉鲁肽)用pH为9且含10％乙腈的稀氨水溶解超声，用0.45μm的有机滤膜过滤得到粗品溶液。
二、第一步纯化
将上述滤液经反相C18柱进行分离纯化，A相为：100mmol/L碳酸氢铵溶液(pH用氨水调至8.5)，B相为：纯乙腈，梯度30-50％，检测波长为220nm，流速为70mL/min，梯度洗脱时间为60min，收集目的峰，检测并将纯度大于95％以上馏分作为第二步纯化样品。
三、第二步纯化
将上述一步纯化的合格馏分经过反相C18柱进行二步纯化，A相为50mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH用磷酸调至2.5)，B相为：纯乙腈，梯度45-60％，检测波长为220nm，流速为70mL/min，梯度洗脱时间为45min，收集目的峰，检测并将纯度大于99％以上，最大单杂小于0.1％馏分作为下一步超滤的样品。
四、超滤脱盐
将二步纯化的合格馏分经过超滤膜进行脱盐、低温浓缩、去除硫酸盐，回收得到高浓度精肽馏分。
五、冷冻干燥
冷冻、干燥：脱盐馏分经冷冻干燥，即可得纯度大于99％，最大单杂小于0.1％的精肽45.92g，总收率为45.92％。冻干精肽和高分子杂质的检测图谱分别如图13和14。
对比例2：利拉鲁肽的分离纯化
一、粗肽溶解过滤
将含76.8g精肽的粗品(粗品重量：100g)溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液为待上样液。
二、第一步纯化
将上述滤液经反相C8柱(150mm×250mm，10μm)进行分离纯化，流动相A为100mM碳酸氢铵+50mM碳酸氢钠，流动相B为乙腈，流速为500mL/min，检测波长为220nm，洗脱梯度为32～47％(50min)，收集馏分并检测，将纯度大于90％的精肽馏分用旋转蒸发器(水浴温度30℃)，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得一步纯化合格馏分。
三、第二步纯化
以Kromasil色谱填料为固定相(150mm×250mm，10μm)的C8柱；以0.1％三氟乙酸+0.05％冰醋酸为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为500mL/min，检测波长为220nm，洗脱梯度为40～60％(60min)，收取纯度大于99％的精肽馏分。
四、脱盐
将上述收集的合格馏分加入等体积的纯水稀释，以上述精制纯化的制备柱脱盐，流动相A纯水，流动相B为乙腈。全部上样，上样后95％A+5％B冲洗20min，而后等度洗脱，70％B相(30min)，收集馏分。
五、旋蒸浓缩
用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈；溶液经对照品定量含利拉鲁肽48.68g，收率达48.68％。冻干精肽和高分子杂质的检测图谱分别如图15和16。
对比例3：索玛鲁肽的分离纯化
一、粗肽溶解过滤
取100.0g索玛鲁肽粗肽，含精肽56.8g，于1％的稀氨水溶液中完全溶解，0.45μm滤膜过滤，收集滤液为待上样液。
二、第一步纯化
将上述滤液经反相C18柱进行分离纯化，A相为：100mmol/L醋酸铵溶液(pH用氨水调至8.5)，B相为：纯乙腈，梯度：10％-50％(B相，50min)，检测波长为230nm，流速为70mL/min。检测并将纯度大于90％以上的馏分用旋转蒸发器水浴温度在30℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得一步合格馏分。
三、第二步纯化
将上述一步纯化的合格馏分经过反相C8柱进行二步纯化，A相为0.1％TFA+0.1％磷酸(pH用氨水调至2.5)，B相为：纯乙腈，梯度35-65％(B相)，检测波长为230nm，流速为70mL/min，梯度洗脱时间为60min。检测并将纯度大于99％以上的馏分用旋转蒸发器水浴温度在30℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得二步合格馏分。
四、脱盐纯化
将上述收集的合格馏分加入等体积的水稀释，以上述精制纯化的制备柱脱盐，流动相A纯水，流动相B为乙腈。全部上样，上样后90％A+10％B冲洗15min，而后等度洗脱，50％B相(30min)，收集馏分，用旋转蒸发器水浴温度在30℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，冷冻干燥得精肽25.2g，总收率为25.2％。冻干精肽的检测图谱见图17，高分子杂质检测结果见图18。
对比例4：索玛鲁肽的分离纯化
一、粗肽溶解过滤
取100.0g索玛鲁肽粗肽，含精肽56.8g，用2％的稀氨水溶液(含5％乙腈)溶解完全，0.45μm滤膜过滤，收集滤液为待上样液。
二、第一步纯化
将上述滤液经反相聚合物填料进行分离纯化，A相为：50mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH用磷酸调至2.5)，B相为：纯乙腈，梯度：20％-40％(B相，60min)，检测波长为220nm，流速为70mL/min。收集馏分，检测并将纯度大于95％以上的馏分合并，作为二步纯化的样品。
三、第二步纯化
将上述一步纯化的合格馏分经过反相C8柱进行二步纯化，A相为100mM碳酸氢铵溶液(pH用氨水调至8.8)，B相为：纯乙腈，梯度42-62％(B相)，检测波长为220nm，流速为70mL/min，梯度洗脱时间为60min。收集馏分，检测并将纯度大于99％以上，最大单杂小于0.15％的馏分作为二步合格馏分。
四、脱盐纯化
将上述收集的合格馏分经过薄膜蒸发器进行除盐和浓缩，回收得到高浓度样品。薄膜蒸发器的真空度为-0.09MPa，蒸发温度为45℃，转速为2000r/min。浓缩液冷冻干燥得精肽27.7g，总收率为27.7％。冻干精肽的检测图谱见图19，高分子杂质检测结果见图20。

Claims (10)

1.一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取粗肽，溶解于溶剂中，加入乙腈，过滤后收集样品液；
(2)将上述步骤(1)得到的样品液进行两次反相HPLC纯化，收集合格馏分；
(3)将上述步骤(2)得到的合格馏分中加入等体积水稀释，以制备柱脱盐，收集脱盐馏分；
(4)将上述步骤(3)得到的脱盐馏分低温处理并保持温度，加入CO2至饱和后加纯水调节pH或者加入酸性试剂调节pH，使目的肽沉淀析出后静置，过滤，真空干燥，得到精肽粉末。
2.如权利要求1所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(1)中溶剂包括碳酸氢铵溶液，所述粗肽与溶剂的质量体积比为1：30～50，所述乙腈的加入量为5％～20％。
3.如权利要求1所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(2)中反相HPLC纯化的具体操作为：以C18作为制备柱，设置流动相A为A1，流动相B为乙腈，第一次调节pH，控制A1所处密封压力罐的压力，进行第一次反相HPLC纯化30～50min，停止流速，更换洗脱条件，设置流动相A为A2，第二次调节pH，控制A2所处密封压力罐的压力，进行第二次反相HPLC纯化，收集目标馏分，将纯度≥99.0％，单杂≤0.10％作为合格馏分，将90.0％≤纯度≤99.0％的目标馏分再一次回收纯化。
4.如权利要求3所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述A1包括碳酸氢铵、碳酸氢钠中的一种或多种，第一次调节pH至7.3～7.7，控制A1所处密封压力罐的压力为0.1～0.5Mpa，所述第一次反相HPLC纯化的条件：流速为500～600mL/min，洗脱梯度为37％B-42％B，40min，控制流动相A1和B为20～30℃，柱温为20～30℃。
5.如权利要求3所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述A2包括碳酸氢铵、碳酸氢钠中的一种或多种，第二次调节pH为9.3～9.7，控制A2所处密封压力罐的压力为0.1～0.5Mpa，所述第二次反相HPLC纯化的条件为：流速500～600mL/min，采用90％A2+10％B冲洗10min，进行梯度洗脱，洗脱梯度为35％B-45％B，100min，控制流动相A2和B为20～30℃，柱温为20～30℃。
6.如权利要求1所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中制备柱脱盐的方法为：设置流动相A为纯水，流动相B为乙腈，全部上样后以90％A+10％B冲洗15min，以20％B-80％B，30min梯度洗脱，收集脱盐馏分。
7.如权利要求1所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(4)中低温处理的温度为-5℃～10℃，调节pH至2.0～6.0，优选pH值为4.0～6.0。
8.如权利要求1所述的一种利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法，其特征在于所述步骤(4)中所述酸性试剂包括碳酸、甲酸、乙酸、磷酸、盐酸、硫酸和高氯酸中的一种或多种，优选酸性试剂为碳酸。
9.通过如权利要求1-8任一所述的利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法制备得到的利拉鲁肽或索马鲁肽。
10.如权利要求1-8任一所述的利拉鲁肽/索马鲁肽的纯化方法在大量、精细制备利拉鲁肽/索马鲁肽中的应用。
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