KR102322423B1 - 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법을 이용하면 염치환 과정 중 불순물의 발생 및 누적을 최소화할 수 있고, 고순도의 제품을 고수율로 수득하는 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다.

Description

팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법 {The Salt Exchange Method for Palmitoyl Tripeptide-1}

본 발명은 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법에 관한 것이다.

대부분의 화장품 펩타이드는 초산염의 형태로 사용된다. 그러나 일반적으로 펩타이드는 제조과정에서 삼불화 초산염의 형태로 얻어지지만 강산인 삼불화 초산염의 독성으로 인한 부작용을 최소화 하기 위하여, 최종 제품은 초산염의 형태로 사용되므로 이의 치환 방법의 확립은 당 산업에서 매우 중요하다고 할 수 있다.

펩타이드의 염치환 방법에는 강염기를 사용하여 삼불화 초산을 제거한 다음 초산 수용액으로 펩타이드를 용출하여 얻는 방법이 있을 수 있으며, 또한 펩타이드를 상업용 정제 컬럼에 Loading한 다음 Buffer를 사용하여 삼불화 초산염을 제거하고 이후 적절한 방법으로 펩타이드를 용출시켜 초산염의 펩타이드를 수득하는 방법 등이 알려졌다.

펩타이드를 초산염으로 치환하는 종래의 방법은 다음과 같다.

유럽특허 "EP 2163558 A2"는 다양한 펩타이드를 정제용 컬럼에 로딩(loading)한 다음 염치환하는 방법을 개시하였으나, 공정이 복잡할 뿐만 아니라 펩타이드에 결합된 삼불화 초산을 제거하기 위해 많은 양의 초산암모늄염 용액을 사용하기에, 대량 생산 시 적용이 용이하지 않는 문제점을 내포하고 있다.

또한, 논문 "Journal of Peptide Science 2008; 14: 354-359"에는 HPLC를 이용하는 방법과 강 음이온 레진(Strong Anion Resin, AG1-X8, quaternary ammonium)을 이용하여 염 치환하는 방법이 기술되어 있다. 그러나 HPLC를 이용한 염치환 방법에서는 역시 번거로운 공정을 포함하고 있으며, 강 음이온 레진을 사용하는 경우에는 레진에 펩타이드를 흡착시킨 다음 염치환을 수행하고 펩타이드를 용출시켜 수득하는 방법으로 레진에 흡착된 펩타이드의 회수율이 낮아 상업적 대량 생산에 적용이 어려운 단점이 있다.

이상에서 언급한 바와 같이 펩타이드의 염치환을 위한 종래의 기술들은 상업적 대량 생산에의 적용에 있어 개선되어야 하는 많은 문제점들을 내포하고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 노력한 결과, 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염) 용액의 pH를 특정 범위로 조절할 경우, 삼불화 초산이 제거된 팔미토일 트라이펩타이드-1를 얻을 수 있고, 여기에 초산 수용액을 처리할 경우 팔미토일 트라이펩타이드-1(초산염)을 간단하게 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 공정이 간단하여, 대량생산에 적용이 가능한 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 비정제(Crude) 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 정제하여 화학식 I로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 얻는 단계; (b) 상기 화학식 I로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)에 pH 조정시약을 처리하여 삼불화 초산이 제거된 화학식 Ⅱ로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1을 얻는 단계; 및 (c) 화학식 Ⅱ로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1을 초산 수용액에 용해한 다음 동결 건조하여 화학식 Ⅲ으로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1(초산염)을 얻는 단계를 포함하는 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법을 제공한다.

[화학식 I]

Pal-Gly-His-Lys-OH(TFA)

[화학식 Ⅱ]

Pal-Gly-His-Lys-OH

[화학식 Ⅲ]

Pal-Gly-His-Lys-OH(AcOH)

본 발명에 있어서, 상기 고성능액체크로마토그래피(HPLC)는 (a) 0.1% 삼불화초산을 함유한 정제수와 아세토니트릴이 8~9: 2~1 부피%로 혼합된 용액; 및 (b) 0.1% 삼불화초산을 함유한 아세토니트릴과 정제수가 8~9: 2~1 부피%로 혼합된 용액을 이동상으로 하여 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 pH 조정시약은 암모늄아세테이드 (Ammonium acetate), 테트라메틸암모늄아세테이트 (Tetramethylammonium acetate), 테트라에틸암모늄아세테이트 (Tetraethylammonium acetate), 테트라부틸암모늄아세테이트 (Tetrabutylammonium acetate), 암모니아수(Ammonium hydroxide), 소듐하이드록시드 (Sodium hydroxide), 리튬하이드록시드 (Lithium hydroxide), 칼슘하이드록시드 (Calcium hydroxide) 및 칼륨하이드록시드 (Potassium hydroxide)로 구성된 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 pH 조정시약은 화학식 Ⅱ로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1가 석출될 수 있는 pH 7.0~12.0가 되도록 처리되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 pH 조정시약의 농도는 10mM ~ 1M인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 초산 수용액의 농도는 1% ~ 20%인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법을 이용하면 염치환 과정에서 불순물의 발생 및 누적을 최소화할 수 있고, 또한 삼불화 초산이 제거된 고순도의 제품을 고수율로 수득하는 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 공정을 나타낸 모식도이다.

본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회 (Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다 (Biochemistry, 11:1726-1732(1972); Pure & Appl. Chem., Vol. 56, No. 5, pp. 595-624, 1984).

본 명세서에서 사용한 보호기 및 아미노산의 약어는 다음과 같다:

TFA: 트라이플루오로아세틱 엑시드 (Trifluoroacetic acid)

AcOH: 아세틱 엑시드 (Acetic acid)

NH₄OAc: 암모늄아세테이트 (Ammonium acetate)

Pal: 팔미토일 (Palmitoyl)

Gly: 글라이신 (Glycine)

His: 히스티딘 (Histidine)

Lys: 라이신 (Lysine)

HPLC: 고성능액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography)

본 발명에서는 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염) 용액의 pH를 특정 범위로 조절할 경우, 팔미토일 트라이펩타이드-1를 얻을 수 있고, 여기에 초산 수용액을 처리할 경우 팔미토일 트라이펩타이드-1(초산염)을 간단하게 제조할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는 비정제(Crude) 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 정제하여 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 제조한 다음, pH 조정시약으로 pH를 7.0 ~ 12.0로 조정하여 팔미토일 트라이펩타이드-1를 석출시키고, 이를 초산 수용액으로 용해시키고 동결건조함으로써 팔미토일 트라이펩타이드-1(초산염)을 제조하였다. 그 결과, 팔미토일 트라이펩타이드-1(초산염)을 상업적 대량 생산이 가능할 정도의 고수율(113%)로 수득할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 비정제(Crude) 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 정제하여 화학식 I로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 얻는 단계; (b) 상기 화학식 I로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)에 pH 조정시약을 처리하여 삼불화 초산이 제거된 화학식 Ⅱ로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1을 얻는 단계; 및 (c) 화학식 Ⅱ로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1을 초산 수용액에 용해한 다음 동결 건조하여 화학식 Ⅲ으로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1(초산염)을 얻는 단계를 포함하는 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법에 관한 것이다.

[화학식 I]

Pal-Gly-His-Lys-OH(TFA)

[화학식 Ⅱ]

Pal-Gly-His-Lys-OH

[화학식 Ⅲ]

Pal-Gly-His-Lys-OH(AcOH)

이하, 도 1을 참조로 하여 본 발명의 염치환 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.

(a) 화학식 I로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 I로 표시되는 펩타이드는 당 업계에서 통상적으로 사용하는 산업용 HPLC로 비정제(Crude) 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 분리 정제한 다음 용액의 pH를 조절함으로써 석출시켜 얻는다. 즉, Crude 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 정제수에 용해한 다음 C18 실리카 충진제로 충진된 컬럼에 펩타이드 용액을 주입하여 로딩(loading)한 다음 (a) 0.1% 삼불화초산을 함유한 정제수와 아세토니트릴이 8~9:2~1 부피%로 혼합된 용액; 및 (b) 0.1% 삼불화초산을 함유한 아세토니트릴과 정제수가 8~9:2~1 부피%로 혼합된 용액을 이동상으로 하여 30분 동안 조성비율 비로 흘려 줌으로써 화학식 I로 표시되는 고순도로 정제된 팔미토일 트라이펩타이드-1 용액을 제조한다.

(b) 화학식 II로 표시되는 펩타이드의 수득

고순도로 정제된 팔미토일 트라이펩타이드-1 용액을 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 다음 pH 조정시약을 첨가하여 pH를 7.0 ~ 12.0으로 맞춰 TFA염이 제거된 화학식 II로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1을 석출 시킨다.

상기 pH 조정시약은 암모늄아세테이드 (Ammonium acetate), 테트라메틸암모늄아세테이트 (Tetramethylammonium acetate), 테트라에틸암모늄아세테이트 (Tetraethylammonium acetate), 테트라부틸암모늄아세테이트 (Tetrabutylammonium acetate), 암모니아수(Ammonium hydroxide), 소듐하이드록시드 (Sodium hydroxide), 리튬하이드록시드 (Lithium hydroxide), 칼슘하이드록시드 (Calcium hydroxide), 칼륨하이드록시드 (Potassium hydroxide) 등을 예시할 수 있다. 상기 pH 조정시약의 농도는 10mM ~ 1M인 것이 바람직하다. 농도가 10mM 미만인 경우에는 석출이 안되거나 시약을 다량 사용하여야 하는 문제가 있고, 1M을 초과할 경우에는 농도가 진한 시약을 제거하는데 문제가 있다.

석출된 펩타이드를 여과한 다음 다시 정제수로 3회 세척한 후 상온에서 감압 건조하면 화학식 II로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1을 수득한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 화학식 II의 펩타이드를 제조하는 과정은 화학식 I의 펩타이드가 포함된 액체상으로 진행해서 수득한다. 특히 중간 펩타이드인 화학식 I을 고체화하여 분리하지 않고 다음 공정을 연속적으로 수행하여 화학식 II로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1를 제조한다.

(c) 화학식 Ⅲ로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1의 수득

팔미토일 트라이펩타이드-1(초산염)은 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드로부터 초산화 공정을 수행하고 동결건조 후 얻을 수 있다. 초산화의 반응 조건으로는 초산 1~20% 범위의 수용액을 사용하여 수행된다. 상기 초산의 농도가 1% 미만인 경우에는 수용액을 많이 사용하여야 하는 문제가 있고, 20%를 초과할 경우에는 수득한 제품 중 초산이 과량 남아 있어 추가 제거공정이 필요한 문제가 있다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 거쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시 예 1 : 화학식 Ⅲ으로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1의 제조

[화학식 Ⅲ]

Pal-Gly-His-Lys-OH(AcOH)

1-1: Pal-Gly-His-Lys-OH(TFA)의 제조

Crude Pal-Gly-His-Lys(TFA) 100g을 정제수 1000mL에 용해한 다음 0.46μm membrane으로 여과하였다. 이동상 A로 0.1% 삼불화초산을 함유한 정제수와 아세토니트릴이 8~9:1~2 부피%로 혼합된 용액을 제조하고 이동상 B로 0.1% 삼불화초산을 함유한 아세토니트릴과 정제수가 8~9:1~2 부피%로 혼합된 용액을 조제하였다. 산업용 HPLC를 켜고 유속을 500mL/min으로 설정하여 컬럼을 세척한 다음, Crude Pal-Gly-His-Lys(TFA) 용해액을 주입하고 초기농도 30%로 설정하여 30분 동안 gradient 조건에서 분리 정제를 실시하였다. 제품 순도 99% 이상인 fraction을 분리하고 순도가 낮은 주 피크의 양옆 부분은 모아서 회수하였다. 정제 완료 후 정제액을 모두 모아 회전 증발기에서 감압 농축하여 아세토니트릴을 최대한 제거시켰다.

1-2: Pal-Gly-His-Lys-OH의 제조

1-1에서 얻은 농축액 전량을 10L 반응조에 투입한 다음 서서히 교반하였다. 500mM 암모늄아세테이트 용액을 준비한 다음 반응조에 서서히 투입하고 pH를 8.0 ~ 9.0으로 조정하여, 펩타이드를 석출시켰다. pH 조정 후 30분 동안 교반한 다음 반응조의 온도를 0 ~ 4℃에서 30분 동안 유지시켰다.

석출된 고체를 여과한 다음 정제수 3L로 3회 세척하고, 정제수를 감압 여과하여 최대한 제거한 다음, 고체를 진공 건조하여 Pal-Gly-His-Lys-OH 56g (순도 99.2%, 수율 56%, TFA 잔량 0.05%)을 수득하였다.

1-3: Pal-Gly-His-Lys-OH(AcOH)의 제조

1-2에서 얻은 Pal-Gly-His-Lys-OH 56g을 5% 초산 수용액 5L에 용해한 다음 0.22μm membrane으로 여과하였다. 여과액을 상온에서 30분동안 교반한 다음 동결건조기 tray에 적재하고, 건조기 trap의 온도를 -60℃로 설정하고 트레이의 온도를 -40℃ => -10℃ => 0℃ => 25℃로 설정하고, 진공도는 300mtorr로 설정하여 동결건조를 진행하였다. 4일 후에 건조를 완료하여 Pal-Gly-His-Lys-OH(AcOH) 63.3g (수율 113%, 순도 99.2%, 초산함량 13.5%)를 얻었다.

실시 예 2~5 :화학식 Ⅲ으로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1의 제조

pH 조정시약의 종류 및 농도, 초산 수용액의 농도를 하기 표 1과 달리한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 Pal-Gly-His-Lys-OH(AcOH)을 제조하고, 수율, 순도, 초산함량을 확인하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

항목	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
암모늄아세테이트	-	-	-	1000mM
암모니아수	-	100mM	-	-
소듐하이드록시드	10mM	-	-	-
칼륨하이드록시드	-	-	500mM	-
초산 수용액	1%	7%	10%	20%
조정 pH 범위	7.0~8.0	8.0~9.0	9.0~10.0	10.0~11.0

항목	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
수율	103%	99.8%	107.5%	104%
순도	98.7%	99.1%	99.0%	99.3%
초산함량	13.6%	14.8%	17.0%	15.5%

표 2로부터, 암모늄아세테이트, 암모니아수, 소듐하이드록시드 및 칼륨하이드록시드 pH 조정시약을 10mM~1000mM 처리하여 Pal-Gly-His-Lys-OH을 석출한 다음 1~20%의 초산 수용액을 처리한 경우에도 고수율, 고순도의 팔미토일 트라이펩타이드-1(초산염)을 제조할 수 있다는 것을 확인하였다.

비교예 1~5 : 화학식 Ⅲ으로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1의 제조

pH 조정시약의 종류 및 농도, 초산 수용액의 농도를 하기 표 3과 달리한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 Pal-Gly-His-Lys-OH(AcOH)을 제조하고, 수율, 순도, 초산함량을 확인하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5
암모늄아세테이트	500mM	5mM	1500mM	500mM	500mM
초산 수용액	5%	5%	5%	0.1%	30%
조정 pH 범위	6.0	8.0	8.0	9.0	9.0

항목	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5
수율	87.7%	101.3%	100.5%	98.5%	107.6%
순도	99.2%	99.3%	98.9%	99.0%	99.1%
초산함량	13.3%	9.8%	18.5%	11.8%	20.4%

표 4로부터, pH 조정범위가 6인 비교예 1은 수율이 낮고, 낮은 농도의 암모늄아세테이트를 처리한 비교예 2는 초산함량이 낮았으며, 높은 농도의 암모늄아세테이트를 처리한 비교예 3은 초산함량이 이론 허용량 이상이었다. 또한, 낮은 농도의 초산 수용액을 처리한 비교예 4는 역시 초산함량이 이론 허용량 이하로 확인되었으며, 높은 농도의 초산 수용액을 처리한 비교예 5는 초삼함량이 이론 허용량 이상인 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

1. (a) 비정제(Crude) 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 정제하여 화학식 I로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)을 얻는 단계;
   (b) 상기 화학식 I로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1(삼불화 초산염)에 pH 7.0~10이 되도록 500mM ~ 1000mM 농도의 암모늄아세테이트 (Ammonium acetate)를 처리하여 삼불화 초산이 제거된 화학식 Ⅱ로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1을 얻는 단계; 및
   (c) 화학식 Ⅱ로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1을 농도가 1% ~ 20%인 초산 수용액에 용해한 다음 동결 건조하여 화학식 Ⅲ으로 표시되는 팔미토일 트라이펩타이드-1(초산염)을 얻는 단계를 포함하는 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법.
   
   [화학식 I]
   Pal-Gly-His-Lys-OH(TFA)
   
   [화학식 Ⅱ]
   Pal-Gly-His-Lys-OH
   
   [화학식 Ⅲ]
   Pal-Gly-His-Lys-OH(AcOH)
   
2. 제1항에 있어서, 상기 고성능액체크로마토그래피(HPLC)는 (a) 0.1% 삼불화초산을 함유한 정제수와 아세토니트릴이 8~9: 2~1 부피%로 혼합된 용액; 및 (b) 0.1% 삼불화초산을 함유한 아세토니트릴과 정제수가 8~9: 2~1 부피%로 혼합된 용액을 이동상으로 하여 수행되는 것을 특징으로 하는 팔미토일 트라이펩타이드-1의 염치환 방법.
   
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