KR101514904B1 - 사이클릭 리포펩타이드 화합물 또는 그의 염의 정제방법 - Google Patents

사이클릭 리포펩타이드 화합물 또는 그의 염의 정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 사이클릭 리포펩타이드 화합물 또는 그의 염의 정제방법을 개시하였으며, 상기 방법에는 (1) 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 발효액에 유기용매를 가하여 추출하고 여과 또는 원심분리를 통해 제1 추출액을 얻는 단계; (2) 상기 제1 추출액을 희석 또는 진공농축하여 유기용매의 함량을 감소시켜 제2 추출액을 얻는 단계; (3) 상기 제2 추출액을 매크로다공성 흡착수지에 주입하는 단계; (4) 물, 유기용매, 또는 유기용매와 물의 혼합액을 세척액으로 사용하여 매크로다공성 수지를 세척하는 단계; 및 (5) 물, 유기용매 또는 유기용매와 물의 혼합액을 용리액으로 사용하여 매크로다공성 수지로부터 화학식 Ⅰ의 화합물을 용리시키는 단계가 포함된다. 상기 정제방법은 기존 방법에 비해 유기용제의 사용량의 적고 실리카겔을 사용하지 않으며, 환경에 대한 위해성이 적은 장점을 가지고 있으며, 수집하여 얻은 화학식 Ⅰ의 화합물의 순도도 개선되었다.
[화학식 Ⅰ]

Description

사이클릭 리포펩타이드 화합물 또는 그의 염의 정제방법{Method for purifying cyclic lipopeptide or salt thereof}
본 발명은 유기화학 분야에 관한 것이며, 화학식 Ⅰ로 표시된 폴리펩타이드 화합물 또는 그의 염의 정제방법에 관한 것이다.
진균감염은 이미 면역결핍 환자의 발병률 및 사망률을 높이는 주요 원인이 되고 있다. 지난 20년간 곰팡이균의 발병률도 현저히 제고되었다. 진균감염의 주요한 발병 대상은 중환자, 외과환자 및 HIV 감염, 백혈병 및 기타 종양질병 환자이다. 인체기관 이식 환자 역시 진균감염의 위험 대상이 되고 있다.
에치노칸딘(Echinocandins)은 일종의 신규 항진균 물질이며, 칸디다균 또는 누룩곰팡이에 의한 감염 치료에 효과가 뛰어나다. 이러한 약물에는 또한 카스포푼진 및 미카푼진 등이 있다. 에치노칸딘계 약물은 1，3-β 글리코시드 결합의 형성을 억제하는 것을 통해 진균을 억제하여 인체에 대한 손상을 진일보 막아준다. 효과적인 동시에 부작용도 감소시켜 사용과정에 있어서 전통적인 항진균약물에 비해 더 안전하다.
FK463(미카푼진)은 화학식 Ⅲ으로 표시된 화합물이며, 효소를 이용하여, 전구체인 화학식 Ⅰ의 화합물 FR901379 (M0)의 측쇄를 자르는 방법을 통해 화학식 Ⅱ의 화합물 FR179642(M1)을 얻은 후, 다시 화학적 수식을 통해 얻는다. 즉, 고 순도의 미카푼진을 얻기 위하여는 순도가 높은 화학식 Ⅰ의 화합물을 얻는 것이 중요하다.
Figure 112013037299514-pct00001

EP0431350 B1에는 화학식 Ⅰ의 화합물을 정제하는 방법이 기재되어 있으며, 직접 아세톤으로 발효액을 추출하고, 여과 농축하여 아세톤을 제거한 후, 에틸 아세테이트로 세척하고, n-부탄올로 추출하여 얻는다. 그 다음, 이소부탄올 상을 건조시켜 실리카겔 컬럼을 통과시켜 화학식 Ⅰ의 화합물을 얻는다. 이 방법에는 대량의 용매가 필요한 동시에 실리카겔과 같은 분해되지 않는 물질을 사용하여 환경에 대한 오염이 심해 환경보호에도 적합하지 않다. 또한 조작 인원의 건강을 심하게 해치며, 산업화 대규모 생산에도 적합하지 않다.
이리하여, 본 분야에서는 대량의 용매가 필요 없고 실리카겔을 사용하지 않는 정제방법을 급히 필요로 하며, 상기 기존기술에 존재하는 결함을 극복하는 동시에 화학식 Ⅰ의 화합물의 순도를 개선시켜야 한다.
본 발명의 목적은 화학식 Ⅰ의 화합물을 정제하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명에서는 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 염의 정제방법을 제공하며, 이 방법에는 하기 단계가 포함된다.
(1) 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 발효액과 유기용매를 혼합하여 추출하고 여과 또는 원심분리를 통해 제1 추출액을 얻는 단계;
(2) 상기 제1 추출액을 희석 또는 진공농축하여 유기용매의 함량을 감소시켜 제2 추출액을 얻는 단계;
(3) 상기 제2 추출액을 매크로다공성 흡착수지에 주입하는 단계;
(4) 물, 유기용매, 또는 유기용매와 물의 혼합 용액을 세척액으로 사용하여 매크로다공성 수지를 세척하는 단계; 및
(5) 물, 유기용매 또는 유기용매와 물의 혼합 용액을 용리액으로 사용하여 매크로다공성 수지로부터 화학식 Ⅰ의 화합물을 용리시키는 단계.
[화학식 Ⅰ]
Figure 112013037299514-pct00002

본 발명에서 제공하는 정제방법에서, 상기 단계 (3)은 제2 추출액을 매크로다공성 수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피에 통과시키거나 또는 흡착수지를 직접 화학식 Ⅰ의 화합물의 추출액에 투입하고 5 내지 120분 동안 교반시켜 화학식 Ⅰ의 화합물의 추출액을 매크로다공성 흡착수지에 주입하는 단계이다. 상기 통과 속도는 시간 당 0.1 내지 10개 컬럼상 체적이다.
본 발명에서 제공하는 정제방법에 있어서, 단계 (1)에서 상기 발효액에는 발효액을 여과 또는 원심분리시켜 얻은 균체가 포함된다.
본 발명에서 제공하는 정제방법에 있어서, 단계 (2)에서, 제2 추출액의 총 부피에 대한 유기용매의 부피 백분비는 0 내지 40％이다.
본 발명에서 제공하는 정제방법에 있어서, 단계 (3)에서, 화학식 Ⅰ의 조 화합물과 매크로다공성 흡착수지의 중량 체적비는 0.1 내지 1.0:100（g/ml）이다.
본 발명에서 제공하는 정제방법에 있어서, 단계 (4)에서, 세척액의 총 부피에 대한 유기용매의 부피 백분비는 0 내지 40％, 바람직하게는 20% 내지 40%이다.
본 발명에서 제공하는 정제방법에 있어서, 단계 (5)에서, 용리액의 총 부피에 대한 유기용매의 부피 백분비는 40 내지 90％, 바람직하게는 40% 내지 60%이다.
본 발명에서 제공하는 상기 정제방법에 있어서, 상기 매크로다공성 흡착수지는 스티렌과 디비닐벤젠(divinylbenzene)의 중합으로 얻은 비극성 방향족 흡착수지, 또는 메타크릴레이트 단위구조를 포함하는 중간 극성의 메타크릴산 흡착수지로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 흡착수지는 XAD-1, XAD-2, XAD-3, XAD-4, XAD-5, XAD-16, XAD-16HP, HP-10, HP-20, HP-20ss, HP-21, HP-30, HP-40, HP-50, SP-825, SP-850, SP-70, SP-700, SP-207, SP207ss, XAD-6, XAD-7, XAD-7HP, XAD-8, HP-2MG, 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
본 발명에서 제공하는 정제방법에서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 부탄온 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
즉, 본 발명에서는 대량의 용매가 필요 없고 실라카겔을 사용하지 않는 정제방법을 제공하였으며, 기존기술에 존재하는 결함을 극복한 동시에, 화학식 Ⅰ의 화합물의 순도를 개선시켰다.
도 1은 실시예 1의 화학식 Ⅰ의 화합물의 추출액의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 실시예 4에서 정제를 통해 얻은 화학식 Ⅰ의 화합물의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다.
깊은 연구 및 반복적인 탐색을 통해 여러 차례 실패를 거쳐, 본 발명자는 화학식 Ⅰ의 화합물의 간단한 정제방법을 발견하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 제공하는 화학식 Ⅰ의 화합물의 정제방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 발효액에 유기용매를 가하여 추출하고 여과 또는 원심분리를 통해 제1 추출액을 얻는 단계;
(2) 상기 제1 추출액을 희석 또는 진공농축하여 유기용매의 함량을 감소시켜 제2 추출액을 얻는 단계;
(3) 상기 제2 추출액을 매크로다공성 흡착수지에 주입하는 단계;
(4) 물, 유기용매, 또는 유기용매와 물의 혼합액을 세척액으로 사용하여 매크로다공성 수지를 세척하는 단계; 및
(5) 물, 유기용매 또는 유기용매와 물의 혼합액을 용리액으로 사용하여 매크로다공성 수지로부터 화학식 Ⅰ의 화합물을 용리시키는 단계.
단계 (3)은 화학식 Ⅰ의 화합물을 함유한 추출액과 매크로다공성 흡착수지를 접촉시켜 실현할 수 있다. 상기 접촉은 a. 흡착수지를 직접 화학식 Ⅰ의 화합물을 함유한 추출액에 투입한 후, 5 내지 120분 동안 교반하거나, 또는 b. 흡착수지로 컬럼 크로마토그래피 등 크로마토그래피 장치를 충진한 후, 화학식 Ⅰ의 화합물의 추출액을 컬럼 크로마토그래피에 시간 당 0.1 내지 10개 컬럼상 체적(column bed volume)의 유속으로 통과시키는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 정제방법은 하기 단계를 포함한다.
A．화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 발효액에 유기용매를 가하여 추출하고 여과 또는 원심분리를 통해 제1 추출액을 얻는 단계;
B. 상기 제1 추출액을 희석 또는 진공농축하여 유기용매의 함량을 감소시켜 제2 추출액을 얻는 단계;
C. 흡착수지를 직접 화학식 Ⅰ의 화합물을 함유한 제2 추출액에 투입하고 5 내지 120분 동안 교반하는 단계;
D．화학식 Ⅰ의 화합물을 함유한 제2 추출액과 상기 수지를 분리하는 단계;
E. 물, 유기용매, 또는 유기용매와 물의 혼합액을 세척액으로 사용하여 단계 D에서 얻은 매크로다공성 수지를 세척하는 단계;
F．물, 유기용매 또는 유기용매와 물의 혼합액을 용리액으로 사용하여 단계 E에서 얻은 세척을 거친 매크로다공성 수지를 용리시켜 화학식 Ⅰ의 화합물을 함유한 용리액을 수집하여 정제된 화학식 Ⅰ의 화합물을 얻는 단계.
단계 D에서, 상기 분리는 여과, 원심분리 등의 방법을 통해 수지와 여과액을 분리하는 것을 포함한다.
본 발명에서 제공하는 정제방법에서, 단계 (1)의 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 발효액은 본 분야의 기존 방법에 의해 얻을 수 있다. EP0431350 B1의 실시예 1에 기재된 방법을 참고로 하여 Coleophoma empetri . F-11899（FERM BP2635）발효를 통해 얻을 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 제공하는 정제방법에서, 단계 (1)의 추출은 발효액에 직접 유기용매를 가하여 추출하거나 또는 발효액을 여과하여 균체를 얻고 여기에 다시 유기용매를 넣어 추출하는 것을 의미한다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 부탄온 또는 이들의 혼합물로부터 선택되며, 바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들의 혼합물이다.
본 발명에서 제공하는 정제방법 중, 단계 (2)에서는 단계 (1)에서 얻은 제1 추출액에 대해 물을 가하여 희석하거나 또는 진공농축하는 방식으로 추출액 중의 유기용매의 함량을 감소시켜 제2 추출액 중의 유기용매의 함량을 ≤40%, 바람직하게는 20% 내지 40%(제2 추출액의 총 부피에 대하여)에 달하게 한다.
본 발명에서 제공하는 정제방법 중, 단계 (4)와 (5)에서, 상기 유기용매는 C1-4알코올, C1 - 4케톤 또는 이들의 혼합물로부터 선택되며, 바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 부탄온 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
본 발명에서 제공하는 상기 정제방법에서, 상기 흡착수지는 스티렌과 디비닐벤젠의 중합으로 얻은 비극성 방향족 흡착수지, 또는 메타크릴레이트 단위구조를 포함하는 중간 극성의 메타크릴산 흡착수지에서 선택된다. 바람직하게는, 미국 RohmHaas회사에서 생산한 XAD계열 흡착수지, 및 일본미쓰비시(MITSUBISHI) 화학회사에서 생산한 Diaion HP계열 흡착수지에서 선택한다. 더 바람직하게는, XAD-1, XAD-2, XAD-3, XAD-4, XAD-5, XAD-6, XAD-7, XAD-7HP, XAD-8, XAD-16, XAD-16HP, HP-10, HP-20, HP-20ss, HP-21, HP-30, HP-40, HP-50, HP-2MG, SP-825, SP-850, SP-70, SP-700, SP207, SP207ss 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다. 더 바람직하게는, HP20, XAD－16, 또는 XAD－16HP, 또는 SP207로부터 선택된다.
본 발명에서 제공하는 정제방법의 단계 (4)에서, 상기 세척액 중 유기용매의 함량은 ≤40%， 바람직하게는 20% 내지 40%이다.
본 발명에서 제공하는 정제방법의 단계 (5)에서, 상기 용리 완충액 중의 유기용매의 함량은 40 내지 90%, 바람직하게는 40 내지 60%이다.
본 발명에 기재된 "화학식 Ⅰ로 표시된 화합물" 또는 "화학식 Ⅰ의 화합물"은 서로 교환 사용 가능하며 모두 하기 구조식을 가진 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 나타낸다.
[화학식 Ⅰ]
Figure 112013037299514-pct00003

본 명세서에 기재된 "약학적으로 허용가능한 염"은 염기와 함께 형성된 염류이다. 상기 염기는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 알루미늄 등 무기염기, 메틸아민, 에틸아민, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥산올아민, 리신, 오르니틴 등 또는 기타 약학적으로 허용가능한 염과 관련된 염기에서 선택된다.
본 명세서에 기재된 "화학식 Ⅰ로 표시된 화합물의 순도", "화학식 Ⅰ의 화합물의 순도" 또는 "화학식 Ⅰ의 화합물의 HPLC 순도"는 교환사용 가능하며, 모두 본 발명에서 제공한 고성능 액상크로마토그래피(HPLC)의 측정 조건하에서 측정한 화학식 Ⅰ의 화합물의 피크의 면적과 모든 피크의 피크면적 합의 백분비이다.
본 명세서에 기재된 "주입"은 화학식 Ⅰ의 조 화합물을 함유한 추출액과 매크로다공성 흡착수지를 접촉시켜 화학식 Ⅰ의 화합물이 매크로다공성 흡착수지에 흡착하게 하는 과정을 가리킨다. 상기 접촉은 매크로다공성 흡착수지를 직접적으로 용액에 투입한 후 교반시켜 흡착시키는 방법, 및 매크로다공성 흡착수지를 컬럼 크로마토그래피 장치에 충진한 후, 용액을 컬럼 크로마토그래피에 통과시키는 방법을 포함한다.
매크로다공성 흡착수지의 "세척"은 적당한 완충액을 매크로다공성 흡착수지 중 또는 상에 통과시키는 것을 가리킨다.
본 명세서에 기재된 "세척 완충액"은 목적한 식Ⅰ의 화합물을 용리하기 전에 매크로다공성 흡착수지를 세척(주로는 유기상)하기 위한 완충액을 가리킨다. 편리하게, 세척 완충액과 시료주입 완충액은 동일한 극성을 가질 수 있으나 꼭 필요한 것은 아니다.
매크로다공성 흡착수지에서 분자를 "용리"한다는 것은 매크로다공성 흡착수지 주위의 완충액의 극성을 변화시켜 매크로다공성 흡착수지로부터 상기 분자를 제거하는 것을 가리키며, 이러한 극성으로 인하여 완충액과 분자가 매크로다공성 흡착수지 상의 흡착부위를 경쟁할 수 있다.
본 명세서에 기재된 "용리 완충액"은 목적한 화학식 Ⅰ의 화합물을 고상으로부터 용리시키는데 사용한다. 용리 완충액은 목적한 화학식 Ⅰ의 화합물을 매크로다공성 흡착수지로부터 용리시킬 수 있다.
목적한 화학식 Ⅰ의 화합물과 1종 또는 여러 종의 비목적 화합물의 조성물 중에서 화학식 Ⅰ의 화합물을 "정제"한다는 것은 조성물 중에서 (완전히 또는 부분적으로) 적어도 1종의 비목적 화합물을 제거하여 조성물 중의 화학식 Ⅰ의 화합물의 순도를 개선하는 것을 가리킨다.
본 발명에 기재된 상기 특징 또는 실시예에 기재된 특징은 임의로 조합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 모든 특징은 임의의 조합 형식으로 사용할 수 있으며, 명세서에 기재된 각 특징은 상동하거나 균등하거나 또는 유사한 목적을 제공할 수 있는 교체성 특징으로 교체될 수 있다. 특별한 설명이 없는 경우, 기재된 특징은 균등하거나 유사한 특징의 일반적인 예이다.
본 발명의 장점은 하기와 같다.
1. 본 발명은 원가가 저렴한 사이클릭 리포펩타이드 화합물, 특히는 에치노칸딘계 화합물의 신규 정제 방법을 제공한다.
2. 본 발명에서 제공하는 방법은 정제단계에 있어서, 경로가 짧고, 조건이 온화하고, 정제효율이 높으며, 처리가 간단하고, 환경오염이 적은 등 특징을 가지고 있으며, 조작 및 설비에 대한 요구를 대폭 감소시켰으며, 생산원가를 절감시켰다.
3. 본 발명에서 제공한 방법을 통해 안정한 목적 생성물을 얻을 수 있으며, 최종 제품의 품질의 조절에 유리하며, 산업화 대규모의 생산에 유리하다.
4. 본 발명에서 제공한 방법으로 생산한 목표화합물은 화합물 II로 전환시키는 요구를 만족시킬 수 있으며, 화합물 II의 대규모의 생산, 나아가서는 최종 산물의 화합물 Ⅲ의 생산에 유리하다.
이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 더욱 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하지는 않는다. 실시예에 표기되지 않은 구체적인 실험조건은 통상의 실험조건 또는 제조사에서 제공한 조건에 따라 실시한다. 특별한 설명이 없는 경우, 백분비, 비율, 비례, 또는 분수는 중량으로 계산한다.
본 발명에서, 중량체적 백분비의 단위는 본 분야의 당업자가 숙지하고 있는 것이며, 예를 들면, 100ml의 용액 중의 용질의 중량이다.
특별한 정의가 없는 경우, 본 명세서에 기재된 전문용어 및 과학용어는 본 분야의 당업자가 숙지하고 있는 의미와 동일하다. 그외에, 기재된 내용과 비슷하거나 균등한 방법 및 재료는 모두 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 비교적 바람직한 실시방법과 재료는 예시에 불과하다.
하기 실시예 중 화학식 I의 화합물의 HPLC측정에서 사용한 방법:
Waters 분석성(analytic) HPLC 시스템을 통해 분석한다. 역상 HPLC분석은FR901379, 뉴모칸딘(Pneumocandin) B0 및 기타 유사물의 측정에 사용된다. 역상 분석은 CALESIL ODS 컬럼 크로마토그래피（입경 5 ㎛，4.6mmi.d×250mm）를 사용하였으며，동시에 35℃를 유지한다. 50% 아세토니트릴/0.5% 인산이수소암모늄을 유동상으로 사용하여, 유속 1ml/분으로，210nm의 UV에서 측정하였다.
실시예 1
EP0431350 B1의 실시예 1에 기재된 방법을 참고로 하여, 2200L의 화학식 I의 화합물을 포함한 발효액을 얻은 후, 여과하여 습한 균체 650kg을 얻었다. 그 중에서 65kg을 취하고 100L의 에탄올을 가하여 추출하였다. 가압엽상여과(plate-frame pressure filtration)를 통해 여과 후, 필터 케이크를 세척하여 160L의 화학식 I의 화합물을 함유한 제1 추출액을 얻었으며, 이 중에 화학식 I의 화합물의 함량은 0.11g/L이었으며，HPLC 순도가 74.08%이었으며，HPLC 스펙트럼은 도 1과 표 1을 참고로 한다.
50L의 화학식 I의 화합물을 함유한 제1 추출액을 취하였다. 그중 화학식 I의 화합물은 총 5.5g이었다. 물로 에탄올 농도를 33%로 희석하여, 100L의 화학식 I의 화합물을 포함한 제2 추출액을 얻었다.
상기 단계에서 얻은 화학식 I의 화합물을 함유한 제2 추출액을 550ml HP20ss수지로 충진한 컬럼 크로마토그래피에 주입하였다. 주입 유속은 시간 당 3개 컬럼상 체적이었다. 주입이 끝난 후, 33%의 에탄올을 사용하여 2개 컬럼상 체적으로 세척하였으며, 세척 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 세척이 끝난 후, 1800ml 60%의 에탄올을 용리액으로 사용하여 용리하였으며, 용리 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 화학식 I의 화합물을 함유한 부분을 수집하여 혼합하였다. 수집액에 대한 HPLC 측정 결과, 화학식 I의 화합물의 함량은 5.2g(수율 94.5%)이었으며, 순도는 90.3%이었다. HPLC 스펙트럼은 도 2와 표 2를 참고로 한다.
보류시간 면적 픽의 높이 %면적
1 7.380 17747 824 0.63
2 8.196 86433 5744 3.07
3 9.627 11782 965 0.42
4 10.531 28138 2048 1.00
5 11.364 69799 3534 2.48
6 11.020 2087596 117791 74.08
7 12.473 32176 2002 1.14
8 13.444 34705 1437 1.23
9 14.137 316897 16282 11.25
10 15.273 33033 1676 1.17
11 16.332 40054 1779 1.42
12 23.203 59506 2471 2.11
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1 8.145 4472 428 0.15
2 9.100 57767 4639 1.99
3 10.500 22462 1475 0.77
4 11.732 2617300 169214 90.30
5 13.500 20314 1138 0.71
6 14.121 120749 6234 3.82
7 14.744 14455 855 0.49
8 15.332 40897 1993 1.42
실시예 2
EP0431350 B1의 실시예 1에 기재된 방법을 참고로, 2200L의 화학식 I의 화합물을 함유한 발효액을 얻은 후, 동일 부피의 메탄올을 가하여 추출하였으며, 여과하여 화학식 I의 화합물을 함유한 제1 추출액을 얻었다. 그중, 화학식 I의 화합물의 함량은 0.051g/L이었으며，HPLC 순도는 74.5%이었다. 100L의 화학식 I의 화합물의 제1 추출액을 취하였으며, 여기에는 화학식 I의 화합물 5.1g이 포함되어 있었다. 물로 메탄올의 농도를 40%로 희석하여 200L의 화학식 I의 화합물을 함유한 제2 추출액을 얻었다.
상기 단계에서 얻은 화학식 I의 화합물의 제2 추출액을 700ml XAD-16수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피에 주입하였으며, 주입 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 주입이 끝난 후, 40%의 메탄올을 사용하여 2개 컬럼상 체적으로 세척하였으며, 세척 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 세척이 끝난 후, 1800ml 50%의 메탄올을 용리액으로 사용하여 용리하였으며, 용리 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 화학식 I의 화합물을 함유한 부분을 수집하여 균일하게 혼합하였으며, 수집액에 대한 HPLC 측정 결과, 화학식 I의 화합물의 함량은 4.7g(수율 92.2%)이었으며，순도는 89.2%이었다.
실시예 3
EP0431350 B1의 실시예 1에 기재된 방법을 참고로, 2200L의 화학식 I의 화합물을 함유한 발효액을 얻은 후, 동일 부피의 아세톤을 가하여 추출하였으며, 여과하여 화학식 I의 화합물을 함유한 제1 추출액을 얻었다. 그중, 화학식 I의 화합물의 함량은 0.051g/L이었으며，HPLC 순도는 74.5%이었다. 40L의 화학식 I의 화합물의 제1 추출액을 취하였으며, 여기에는 화학식 I의 화합물 2.04g이 포함되어 있었다. 물로 아세톤의 농도를 20%로 희석하여 80L의 화학식 I의 화합물을 함유한 제2 추출액을 얻었다.
상기 단계에서 얻은 화학식 I의 화합물을 함유한 제2 추출액을 100L의 플라스틱 흰색 통에 넣고 1000ml XAD－16HP 수지를 첨가하였다. 실온에서 120분간 교반한 후, 수지를 포함한 여과액을 여과지를 펴놓은 흡인 여과기에 부어 여과시켜 여액을 버리고 수지를 컬럼 크로마토그래피에 충진한 후, 2000ml 20%의 아세톤으로 세척하였다. 세척이 끝난 후, 60%의 아세톤으로 용리시켜 화학식 I의 화합물을 함유한 부분을 수집하고 수집액을 HPLC로 측정한 결과, 화학식 I의 화합물은 1.75g(수율 85.8%)이었으며，순도는 90.0%이었다.
실시예 4
20L의 실시예 1에서 얻은 화학식 I의 화합물을 포함한 제1 추출액을 취하였다. 그 중, 화학식 I의 화합물은 총 2.2g이었으며, 진공농축을 통해 에탄올 농도를 20%로 낮춰, 8L의 화학식 I의 화합물을 함유한 제2 추출액을 얻었다.
상기 단계에서 얻은 화학식 I의 화합물의 제2 추출액을 200mL SP207수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피에 주입하였으며, 주입 유속은 시간 당 3개 컬럼상 체적이었다. 주입이 끝난 후, 20%의 에탄올을 사용하여 2개 컬럼상 체적으로 세척하였으며, 세척 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 세척이 끝난 후, 1L 40%의 에탄올을 용리액으로 사용하여 용리하였으며, 용리 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 화학식 I의 화합물을 함유한 부분을 수집하여 균일하게 혼합하였으며, 수집액에 대한 HPLC 측정 결과, 화학식 I의 화합물의 함량은 1.94g(수율 88.2%)이었으며，순도는 89.5%이었다.
실시예 5
1450L의 실시예 1에서 얻은 화학식 I의 화합물을 포함한 제1 추출액을 취하였다. 그 중, 화학식 I의 화합물은 총 159.5g이었으며, 정제수로 에탄올 농도를 40%로 희석시켰으며, 2950L의 화학식 I의 화합물을 함유한 제2 추출액을 얻었다.
상기 단계에서 얻은 화학식 I의 화합물의 제2 추출액을 20L HP20수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피에 주입하였으며, 주입 유속은 시간 당 10개 컬럼상 체적이었다. 주입이 끝난 후, 40%의 에탄올을 사용하여 2개 컬럼상 체적으로 세척하였으며, 세척 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 세척이 끝난 후, 60L 50%의 에탄올을 용리액으로 사용하여 용리하였으며, 용리 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 화학식 I의 화합물을 함유한 부분을 수집하여 균일하게 혼합하였으며, 수집액에 대한 HPLC 측정 결과, 화학식 I의 화합물의 함량은 145.2g(수율 91.0%)이었으며，순도는 90.4%이었다.
실시예 6
50L의 실시예 1에서 얻은 화학식 I의 화합물을 포함한 제1 추출액을 취하였다. 그 중, 화학식 I의 화합물은 총 5.5g이었으며, 정제수로 에탄올 농도를 10%로 희석시켰으며, 화학식 I의 화합물을 함유한 제2 추출액을 얻었다.
상기 단계에서 얻은 화학식 I의 화합물의 제2 추출액을 550ml HP20수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피에 주입하였으며, 주입 유속은 시간 당 3개 컬럼상 체적이었다. 주입이 끝난 후, 10%의 에탄올을 사용하여 2개 컬럼상 체적으로 세척하였으며, 세척 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 세척이 끝난 후, 1800ml의 에탄올을 용리액으로 사용하여 용리하였으며, 용리 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 화학식 I의 화합물을 함유한 부분을 수집하여 균일하게 혼합하였으며, 수집액에 대한 HPLC 측정 결과, 화학식 I의 화합물의 함량은 5.15g(수율 93.6%)이었으며，순도는 85.4%이었다.
비교예 1
50L의 실시예 1에서 얻은 화학식 I의 화합물을 포함한 제1 추출액을 취하였다. 그 중, 화학식 I의 화합물은 총 5.5g이었으며, 정제수로 에탄올 농도를 32%로 희석시켜, 103L의 화학식 I의 화합물을 함유한 제2 추출액을 얻었다.
상기 단계에서 얻은 화학식 I의 화합물의 제2 추출액을 550ml HP20수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피에 주입하였으며, 주입 유속은 시간 당 10개 컬럼상 체적이었다. 주입이 끝난 후, 45%의 에탄올을 사용하여 2개 컬럼상 체적으로 세척하였으며, 세척 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 세척이 끝난 후, 1800ml의 50% 에탄올을 용리액으로 사용하여 용리하였으며, 용리 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 화학식 I의 화합물을 함유한 부분을 수집하여 균일하게 혼합하였으며, 수집액에 대한 HPLC 측정 결과, 화학식 I의 화합물의 함량은 2.13g(수율 38.7%)이었으며，순도는 90.4%이었다.
비교예 2
50L의 실시예 1에서 얻은 화학식 I의 화합물을 포함한 제1 추출액을 취하였다. 그 중, 화학식 I의 화합물은 총 5.5g이었으며, 정제수로 에탄올 농도를 45%로 희석시켜, 103L의 화학식 I의 화합물을 함유한 제2 추출액을 얻었다.
상기 단계에서 얻은 화학식 I의 화합물을 포함한 제2 추출액을 550ml HP20 수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피에 주입하였으며, 주입 유속은 시간 당 3개 컬럼상 체적이었다. 주입이 끝난 후, 33%의 에탄올을 사용하여 2개 컬럼상 체적으로 세척하였으며, 세척 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 세척이 끝난 후, 1800ml의 60% 에탄올을 용리액으로 사용하여 용리하였으며, 용리 유속은 시간 당 1개 컬럼상 체적이었다. 화학식 I의 화합물을 함유한 부분을 수집하여 균일하게 혼합하였으며, 수집액에 대한 HPLC 측정 결과, 화학식 I의 화합물의 함량은 1.08g(수율 19.6%)이었으며，순도는 85.4%이었다.
상기 기재는 본 발명의 비교적 바람직한 실시예일 뿐이며, 본 발명의 실질적인 기술 내용의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 실질적 기술 내용은 광의적으로 본 발명의 특허청구의 범위에 기재되어 있으며, 임의의 타인에 의해 완성된 기술 실체 또는 방법이 본 발명의 특허청구의 범위에서 정의한 내용과 완전히 같거나 또는 등가의 변경일 경우, 모두 본 발명의 특허청구의 범위에 포함된다.

Claims (11)

  1. (1) 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 발효액과 유기용매를 혼합하여 추출하고 여과 또는 원심분리를 통해 제1 추출액을 얻는 단계;
    (2) 상기 제1 추출액을 희석 또는 진공농축하여 유기용매의 함량을 감소시켜 제2 추출액을 얻는 단계;
    (3) 상기 제2 추출액을 매크로다공성 흡착수지에 주입하는 단계;
    (4) 물, 유기용매, 또는 유기용매와 물의 혼합 용액을 세척액으로 사용하여 매크로다공성 수지를 세척하는 단계; 및
    (5) 물, 유기용매 또는 유기용매와 물의 혼합 용액을 용리액으로 사용하여 매크로다공성 흡착수지로부터 화학식 Ⅰ의 화합물을 용리시키는 단계
    를 포함하는, 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 염의 정제방법으로서,
    상기 매크로다공성 흡착수지가 스티렌과 디비닐벤젠의 중합으로 얻은 비극성 방향족 흡착수지, 또는 메타크릴레이트 단위구조를 포함하는 중간 극성의 메타크릴산 흡착수지로부터 선택되는 것이고;
    상기 유기용매가 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 부탄온 또는 이들의 혼합물로부터 선택되며;
    상기 단계 (4)에서, 세척액의 총 부피에 대한, 유기용매의 부피 백분비가 0 내지 40％이고; 및
    상기 단계 (5)에서, 용리액의 총 부피에 대한 유기용매의 부피 백분비가 40 내지 90％인 것을 특징으로 하는 정제방법:
    [화학식 Ⅰ]
    Figure 112014089871428-pct00008

  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (3)에서, 제2 추출액을 매크로다공성 수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피에 통과시키거나 또는 흡착수지를 직접 화학식 Ⅰ의 화합물의 추출액에 투입하고 5 내지 120분 동안 교반시켜 화학식 Ⅰ의 화합물의 제2 추출액을 매크로다공성 흡착수지에 주입하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 통과 속도가 시간 당 0.1 내지 10개 컬럼상 체적인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  4. 제1항에 있어서,
    단계 (1)에서, 발효액은 발효액을 여과 또는 원심분리하여 얻은 균체를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  5. 제1항에 있어서,
    단계 (2)에서, 제2 추출액의 총 부피에 대한 유기용매의 부피 백분비가 0 내지 40％인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  6. 제1항에 있어서,
    단계 (3)에서, 화학식 Ⅰ의 조 화합물과 매크로다공성 흡착수지의 중량체적비가 0.1 내지 1.0:100（g/ml）인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  7. 제1항에 있어서,
    단계 (4)에서, 세척액의 총 부피에 대한, 유기용매의 부피 백분비가 20% 내지 40%인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  8. 제1항에 있어서,
    단계 (5)에서, 용리액의 총 부피에 대한 유기용매의 부피 백분비가 40 내지 60%인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 흡착수지가 XAD-1, XAD-2, XAD-3, XAD-4, XAD-5, XAD-16, XAD-16HP, HP-10, HP-20, HP-20ss, HP-21, HP-30, HP-40, HP-50, SP-825, SP-850, SP-70, SP-700, SP-207, SP207ss, XAD-6, XAD-7, XAD-7HP, XAD-8, HP-2MG, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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