CN104447961B - 棘白菌素b母核的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棘白菌素B母核的提取方法，包括以下步骤：（1）去除棘白菌素B母核的转化液中的固体物质，得滤液，调节滤液pH至3‑5，上大孔吸附树脂，用pH3‑5的无机酸水溶液洗脱，再用含脂肪醇的无机酸水溶液洗脱，收集洗脱液A；（2）将洗脱液A浓缩，调节pH至3‑5，得浓缩液；（3）将浓缩液上十八烷基键合硅胶层析柱、八烷基键合硅胶层析柱或圆形微球树脂层析柱，用pH3‑5的无机酸水溶液洗脱，再用含脂肪醇的无机酸水溶液洗脱，得洗脱液B；（4）将洗脱液B浓缩。本发明的棘白菌素B母核的提取方法色素去除率达95%以上，产品的收率在70%，棘白菌素B母核的纯度为97%以上。
Description
技术领域
本发明涉及棘白菌素B母核的提取方法。
背景技术
棘白菌素类是21世纪上市的一种新型的抗真菌抗生素，其作用靶点为β-1，3-葡聚糖合成酶，该酶特异性的存在于真菌中，因此能够抑制真菌细胞壁的合成导致真菌细胞溶解死亡。目前已经上市的阿尼芬净是由棘白菌素B (Echinocandin B，简称ECB)通过微生物转化得到棘白菌素B母核 (Echinocandin B Nucleus简称ECBN)，再通过化学合成加入特定侧链基团制备获得。
棘白菌素B母核作为生产阿尼芬净的中间体，其分离方法文献报道较少。中国专利CN102336817A公开了棘白菌素B母核的分离方法，该分离方法也是使用树脂吸附再洗脱的方法，但是该方法使用了较大量的溶剂冲洗，且终产品色素残留多，纯度和收率偏低等缺点，极大的制约了棘白菌素B母核的发展。而现有技术中尚未有纯度高和色素残留少的棘白菌素B母核的制备方法及其制得的产品的相关报道，该现象亟待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中棘白菌素B母核提取时使用溶剂量大，终产品色素残留多，纯度和收率偏低等的缺点，提供一种棘白菌素B母核的提取方法。本发明的棘白菌素B母核的制备方法使用溶剂少，方法操作简便，收率高，适用于工业化生产；制得的棘白菌素B母核色素几乎完全被去除，色素去除率达95％，产品的收率在70％左右，最终棘白菌素B母核的纯度为97％左右。
本发明的目的在于，提供一种棘白菌素B母核的提取方法，所述的提取方法包括以下步骤：
(1)去除棘白菌素B母核的转化液中的固体物质，得滤液，调节滤液 pH至3-5，上大孔吸附树脂，用pH3-5的无机酸水溶液洗脱，再用含脂肪醇的无机酸水溶液洗脱，收集含脂肪醇的无机酸水溶液的洗脱液，得洗脱液A；
(2)将步骤(1)中的洗脱液A浓缩，并调节pH至3-5，得浓缩液；
(3)将步骤(2)中的浓缩液上十八烷基键合硅胶层析柱、八烷基键合硅胶层析柱或圆形微球树脂层析柱，用pH3-5的无机酸水溶液洗脱，再用含脂肪醇的无机酸水溶液洗脱，收集含脂肪醇的无机酸水溶液的洗脱液，得洗脱液B；
(4)将步骤(3)中的洗脱液B浓缩，即可。
步骤(1)中，所述的棘白菌素B母核的转化液为本领域常规的棘白菌素B母核的转化液；较佳的，所述含棘白菌素B母核的转化液的制备方法包括以下步骤：将培养好的转化用菌体放入pH为6.0-7.0的磷酸缓冲液悬浮，加入棘白菌素B精制品，混合均匀，25-30℃下转化反应3-5小时，得到含棘白菌素B母核的转化液。
步骤(1)中，所述的去除棘白菌素B母核的转化液中的固体物质的方法为本领域常规的方法，所述的去除棘白菌素B母核的转化液中的固体物质的方法较佳的为抽滤。
步骤(1)中，较佳的，调节所述的滤液pH至3.5-4.5；更佳的，调节所述的滤液pH至4-4.5。
步骤(1)中，所述的大孔吸附树脂为本领域常规的大孔吸附树脂；所述的大孔吸附树脂较佳的为聚苯乙烯-二乙烯苯型大网格中等极性树脂，更佳的为上海华震树脂公司的HZ806型树脂、上海华震树脂公司的HZ-816型树脂、上海华震树脂公司的HZ-803型树脂、罗门哈斯公司的XAD-4型树脂、罗门哈斯公司的XAD-2型树脂或罗门哈斯公司的XAD-18型树脂，进一步更佳的为罗门哈斯公司XAD-4型树脂。
步骤(1)中，所述的上大孔吸附树脂的上柱流速为本领域常规的上柱流速，所述的上大孔吸附树脂的上柱流速较佳的为0.5％-2％CV/min，更佳的为1％CV/min；所述的柱体积为大孔吸附树脂的柱体积。
步骤(1)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液为本领域常规的酸水溶液；所述的pH3-5的无机酸水溶液中的酸水溶液较佳的为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中的一种或多种，更佳的为硫酸水溶液；所述的pH3-5的无机酸水溶液的制备方法较佳的为：将无机酸与纯水混合，并用pH试纸比对，获得相对应的pH值的无机酸水溶液，即可。
步骤(1)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液的用量为本领域常规的用量，所述的酸水溶液的用量以大孔吸附树脂的柱体积计较佳的为1-4CV，更佳的为2-3CV。
对于步骤(1)中含脂肪醇的无机酸水溶液的说明如下：
步骤(1)中，所述的脂肪醇为本领域常规的脂肪醇；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇较佳的为乙醇和/或甲醇，更佳的为乙醇；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇的含量为本领域常规的脂肪醇的含量，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇的含量较佳的为8％-20％，更佳的为12％，所述百分比为体积百分比。
步骤(1)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液较佳的为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中的一种或多种，更佳的为硫酸水溶液。
步骤(1)中，较佳的，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液为pH3-5的无机酸水溶液。所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液的制备方法较佳的为：将无机酸与纯水混合，并用pH试纸比对，获得相对应的pH值的无机酸水溶液，即可。
步骤(1)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液的用量为本领域常规的用量；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液的用量以大孔吸附树脂的柱体积计较佳的为1-4CV，更佳的为2-3CV。
步骤(1)中，所述的洗脱的流速为本领域常规的流速；所述的洗脱的流速较佳的为1％-4％CV/min，更佳的为2％CV/min；所述的柱体积为大孔吸附树脂的柱体积。
步骤(1)结束后，得到棘白菌素B母核初制品，所述的棘白菌素B母核初制品的收率一般为80％-90％，纯度一般为80％-90％。
步骤(2)中，所述的浓缩的方法为本领域常规的方法。较佳的，所述的浓缩为减压浓缩或纳滤膜浓缩。所述的减压浓缩的压力较佳的为 0.05-0.15MPa，所述的减压浓缩的时间较佳的为4-5小时。
步骤(2)中，所述的浓缩的终点的判断方法为本领域常规的判断方法，较佳的为：当浓缩液在步骤(3)中上所述的十八烷基(C18)键合硅胶层析柱或八烷基(C8)键合硅胶层析柱时，所述的浓缩液的体积为所述的十八烷基(C18)键合硅胶层析柱或八烷基(C8)键合硅胶层析柱的1/15-1/5CV，更佳的为所述的浓缩液的体积为十八烷基(C18)键合硅胶层析柱或八烷基 (C8)键合硅胶层析柱的1/10CV；当浓缩液在步骤(3)中上圆形微球树脂层析柱时，所述的浓缩液的体积为所述的圆形微球树脂层析柱的1/2-1CV。
步骤(2)中的调节pH至3-5对于步骤(3)中的上柱过程影响较大。 pH低于3时，吸附效果较差，会导致上柱失败；pH大于5时，棘白菌素B 母核会变得不稳定，易导致破坏。较佳的，调节所述的pH至3.5-4.5。
步骤(3)中，所述的十八烷基(C18)键合硅胶层析柱中的十八烷基(C18) 键合硅胶填料较佳的为球形亲水型填料或球形非亲水型填料，更佳的为球形亲水型填料；所述的十八烷基(C18)键合硅胶填料的特征孔径为调和粒径为10-70μm；所述的十八烷基(C18)键合硅胶填料较佳的为苏州赛分科技有限公司的填料GP-C18、苏州赛分科技有限公司的填料HP-C18、上海大有色谱技术服务有限公司的填料DYB71306和上海大有色谱技术服务有限公司填料的DYB71326中的一种或多种。
步骤(3)中，所述的八烷基(C8)键合硅胶层析柱中的八烷基(C8) 键合硅胶填料较佳的为球形亲水型填料或球形非亲水型填料，更佳的为球形亲水型填料；所述的八烷基(C8)键合硅胶填料的特征孔径为调和粒径为10-70μm。所述的八烷基(C8)键合硅胶填料较佳的为苏州赛分科技有限公司的填料HP-C8、上海大有色谱技术服务有限公司的填料 DYB71336和上海大有色谱技术服务有限公司填料的DYB72194中的一种或多种。
步骤(3)中，所述的圆形微球树脂层析柱中的圆形微球树脂为本领域常规的圆形微球树脂，较佳的，所述的圆形微球树脂为苏州纳微科技公司的型号为NM100的大孔吸附微球树脂。
步骤(3)中，所述的十八烷基(C18)键合硅胶层析柱、八烷基(C8) 键合硅胶层析柱或圆形微球树脂层析柱的上柱流速为本领域常规的上柱流速；所述的十八烷基(C18)键合硅胶层析柱、八烷基(C8)键合硅胶层析柱或圆形微球树脂层析柱的上柱流速较佳的为0.5％-2％CV/min，更佳的为 1％CV/min；所述的柱体积为骤(3)中的层析柱的柱体积。
步骤(3)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液为本领域常规的无机酸水溶液；所述的pH3-5的无机酸水溶液较佳的为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中的一种或多种，更佳的为硫酸水溶液；所述的pH3-5的无机酸水溶液中的无机酸水溶液的制备方法较佳的为将无机酸与纯水混合，并用pH 试纸比对，获得相对应的pH值的无机酸水溶液，即可。
步骤(3)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液的用量为本领域常规的用量，所述的pH3-5的无机酸水溶液的用量以步骤(3)中的层析柱的柱体积计较佳的为1-4CV，更佳的为2-3CV。
对于步骤(3)中含脂肪醇的无机酸水溶液的说明如下：
步骤(3)中，所述的脂肪醇为本领域常规的脂肪醇；所述的脂肪醇较佳的为甲醇、乙醇、丙酮或异丙醇中的一种或多种，更佳的为甲醇和/或乙醇，进一步更佳的为甲醇；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇的含量为本领域常规的脂肪醇的含量，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇的含量较佳的为1％-30％，更佳的为3％-25％，所述百分比为体积百分比。
步骤(3)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液为本领域常规的酸水溶液；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的酸水溶液较佳的为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中的一种或多种，更佳的为硫酸水溶液。
步骤(3)中，较佳的，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液为pH3-5的无机酸水溶液。所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液的制备方法较佳的为：将无机酸与纯水混合，并用pH试纸比对，获得相对应的pH值的无机酸水溶液，即可。
步骤(3)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液的用量为本领域常规的用量；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液的用量以步骤(3)中的层析柱的柱体积计较佳的为0.5-2.5CV，更佳的为1-2CV，进一步更佳的为1.5CV。
步骤(3)中，所述的洗脱的流速为本领域常规的流速；所述的洗脱的流速较佳的为1％-4％CV/min，更佳的为2％CV/min；所述的柱体积为骤(3) 中的层析柱的柱体积。
步骤(4)中，所述的浓缩的方法为本领域常规的方法。较佳的，所述的浓缩为减压浓缩或纳滤膜浓缩。所述的减压浓缩的压力较佳的为 0.05-0.15MPa，所述的减压浓缩的时间较佳的为4-5小时。
步骤(4)中，所述的浓缩的终点较佳的为浓缩至脂肪醇的含量1％以下，更佳的为浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，所述百分比为脂肪醇占浓缩后浓缩物的质量百分比。
步骤(4)中，较佳的，所述的减压浓缩后，冻干或者喷雾干燥。所述的冻干的方法和条件为本领域常规的方法和条件，较佳的，所述的冻干为在 -70℃～-80℃条件下冻干。
本发明，所述的含棘白菌素B母核的转化液的制备方法可以参考中国专利CN102336817A第4页的记载，具体的为：
菌种：游动放线菌(Actinoplanes utahensis)保藏号为NRRL 12052。
菌体培养条件：
将保存在冷冻管中的游动放线菌NRRL12052在28℃条件下接入斜面培养基中培养7天，斜面培养基的组成为(％)：酵母提取物0.3、麦芽浸出物0.3、蛋白陈0.5、葡萄糖1.0、琼脂2.7，pH7.0；培养7天后将斜面上长出的菌体按10％接种量接种到转化培养基中培养4天，培养温度为30℃，转化培养基的组成为(％)：蔗糖2.0、燕麦片2.0、麦芽浸出物0.5、酵母0.2、K2HPO4 0.1、KCl 0.05、MgSO4·7H2O 0.05，FeS04·7H2O 0.0002，pH7.0；培养4天后，将转化菌体用3倍体积的去离子水洗涤次后离心，倒去上清液，留作转化用。
菌体转化条件：
转化底物：纯度为95％的棘白菌素B精制品，此精制品的制备工艺详见中国专利CN101659692A“制备棘球康定B的方法”中的记载；
转化条件：将培养好的转化用菌体放入新鲜的pH为6.8、浓度0.1M磷酸缓冲液悬浮，加入底物混匀，30℃、250r/min进行转化反应3小时，得含棘白菌素B母核的转化液。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：与现有的棘白菌素B母核的分离纯化工艺相比，本发明的棘白菌素B母核的提取方法能够很好的去除色素，色素去除率达95％以上，同时产品的收率在70％左右，最终棘白菌素B母核的纯度为97％以上。同时，本发明的棘白菌素B母核的提取方法首次将反相硅胶填料用于棘白菌素B母核的纯化，以便得到高纯度的产品；整个分离过程中所用的有机溶剂量较少。
附图说明
图1为实施例2的方法制得的棘白菌素B母核的高效液相色谱(HPLC) 图谱。
图2为原始棘白菌素B母核发酵液照片(a)以及经过实施例1中的方法提取得到的棘白菌素B母核(b)的照片。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中，所述的棘白菌素B母核的转化液的制备方法参考中国专利CN102336817A第4页的记载为：
菌种：游动放线菌(Actinoplanes utahensis)保藏号为NRRL 12052。
菌体培养条件：
将保存在冷冻管中的游动放线菌NRRL12052在28℃条件下接入斜面培养基中培养7天，斜面培养基的组成为(％)：酵母提取物0.3、麦芽浸出物0.3、蛋白陈0.5、葡萄糖1.0、琼脂2.7，pH7.0；培养7天后将斜面上长出的菌体按10％接种量接种到转化培养基中培养4天，培养温度为30℃，转化培养基的组成为(％)：蔗糖2.0、燕麦片2.0、麦芽浸出物0.5、酵母0.2、K2HPO4 0.1、KCl 0.05、MgSO4·7H2O 0.05，FeS04·7H2O 0.0002，pH7.0；培养4天后，将转化菌体用3倍体积的去离子水洗涤次后离心，倒去上清液，留作转化用。
菌体转化条件：
转化底物：纯度为95％的棘白菌素B精制品，此精制品的制备工艺详见中国专利CN101659692A“制备棘球康定B的方法”中的记载；
转化条件：将培养好的转化用菌体放入新鲜的pH为6.8、浓度0.1M磷酸缓冲液悬浮，加入底物混匀，30℃、250r/min进行转化反应3小时得含棘球白素B母核的转化液。
实施例1
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2L滤液，调节滤液pH 为pH4，上高径比5:1、柱体积1.5L的大孔吸附树脂柱(上海华震树脂公司的HZ-806)，上柱流速为0.5％CV/min，上柱吸附后用pH4的盐酸水溶液2CV 洗脱，再用含10％乙醇的pH4盐酸水溶液1CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为1％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素B 母核初制品)，其收率为90％，纯度为88％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至20mL，并调节pH至3，得浓缩液；浓缩的压力为0.05MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比8:1、柱体积200mL的十八烷基(C18)键合硅胶层析柱(苏州赛分科技有限公司的填料GP-C18)，上柱流速为0.5％CV/min，然后用pH4的盐酸水溶液2CV冲洗，最后用含3％的甲醇的pH4盐酸水溶液2CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为 1％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为78％，纯度为96.7％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，减压浓缩的压力为0.05MPa，时间为4小时，45℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为提取得到的棘白菌素B母核。
利用高效液相色谱法对上述棘白菌素B母核进行检测，测量其纯度和总收率。其检测条件为：
色谱柱：ODS-C18(5u)；
检测波长：222nm；
流动相：乙酸铵缓冲液:乙腈＝95:5；
流速：0.7mL/min；
出峰时间为9.983分钟；检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为96.7％。
由最终获得的棘白菌素B母核的质量/刚开始转化液中棘白菌素B母核的质量来计算得到棘白菌素B母核的总收率。在本实施例中得到的棘白菌素 B母核的总收率为72％。
经过实施例1中的方法提取得到的棘白菌素B母核(白色)的照片如图2(b)所示，原始棘白菌素B母核发酵液(黄色)照片如图2(a)所示，图2(a)和(b)比较可以看出，经过实施例1中的方法提取得到的棘白菌素B母核的色度有明显的下降。
实施例2
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2.4L滤液，调节滤液pH 为pH3，上高径比4:1、柱体积1.5L大孔吸附树脂柱(罗门哈斯公司的 XAD-4)，上柱流速为2％CV/min，上柱吸附后用pH为4.5的硫酸水溶液2CV 洗脱，再用含12％乙醇的硫酸水溶液1.5CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为4％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)，其收率为85％，纯度为87％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至10mL，并调节pH至5，得浓缩液；浓缩的压力为0.05MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比10:1、柱体积200mL的十八烷基(C18)键合硅胶层析柱(苏州赛分科技有限公司的填料HP-C18)，上柱流速为1.25％CV/min，然后用pH为4.5的硫酸水溶液2CV冲洗，最后用6％的甲醇的pH4硫酸水溶液2CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为2.5％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为81％，纯度为97.1％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，42℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为提取得到的棘白菌素B母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，得到的棘白菌素B母核的高效液相色谱(HPLC)图谱如图1所示。出峰时间为9.983分钟。结果为：棘白菌素B母核的纯度为97.1％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为68％。
实施例3
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2.7L滤液，调节滤液pH 为pH5，上高径比4:1、柱体积1.5L大孔吸附树脂柱(罗门哈斯公司的 XAD-18)，上柱流速为1.25％CV/min，上柱吸附后用pH为5的硫酸水溶液 3CV洗脱，再用含14％乙醇的pH5的硫酸水溶液2CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为2.5％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)，其收率为85％，纯度为85％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至40mL，并调节pH至4，得浓缩液；浓缩的压力为0.1MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比10:1、柱体积200mL的八烷基(C8)键合硅胶层析柱(苏州赛分科技有限公司的填料HP-C8)，上柱流速为2％CV/min，然后用pH5的硫酸水溶液2.5CV冲洗，最后用含10％的甲醇的pH5的硫酸水溶液1.5CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为4％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为84％，纯度为96.7％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，减压浓缩的压力为0.1MPa，时间为5小时，45℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为提取得到的棘白菌素B母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为96.7％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为69％。
实施例4
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2L滤液，调节滤液pH 为pH4，上高径比4:1、柱体积1.5L大孔吸附树脂柱(罗门哈斯公司的 XAD-2)，上柱流速为2％CV/min，上柱吸附后用pH为4的硫酸水溶液1.5CV 洗脱，再用含16％乙醇的pH4硫酸水溶液1.5CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为2.5％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)，其收率为88％，纯度为86％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至15mL，并调节pH至4，得浓缩液；浓缩的压力为0.15MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比12:1、柱体积200mL的十八烷基(C18)键合硅胶层析柱(上海大有色谱技术服务有限公司的填料 DYB71306)，上柱流速为1.25％CV/min，然后用pH为4的硫酸水溶液2CV 冲洗，最后用含13％甲醇的硫酸水溶液1CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为4％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为82％，纯度为97％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，减压浓缩的压力为0.15MPa，时间为4.5，43℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为棘白菌素B母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，其检测条件参照实施例1，检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为97％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为67％。
实施例5
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2.5L滤液，调节滤液pH 为pH4.5，上高径比4:1、柱体积1.5L大孔吸附树脂柱(上海华震树脂公司的HZ-816)，上柱流速为1.5％CV/min，上柱吸附后用pH为3的磷酸水溶液 2CV洗脱，再用含18％乙醇的pH4.5磷酸水溶液1.2CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为3％CV/min，得洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)，其收率为84％，纯度为85％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至25mL，并调节pH至3.5得浓缩液；浓缩的压力为0.15MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比14:1、柱体积200mL的十八烷基(C18)键合硅胶层析柱(上海大有色谱技术服务有限公司填料的 DYB71326)，上柱流速为1.5％CV/min，然后用pH为4.5的去离子水冲洗2CV，最后用含16％甲醇的pH4.5磷酸水溶液0.8CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为3％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B 母核中制品)；中制品的收率为89％，纯度为96.8％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，减压浓缩的压力为0.05MPa，时间为4.5小时，43℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为棘白菌素B 母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为96.8％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为66％。
实施例6
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2.2L滤液，调节滤液pH 为pH5，上高径比3:1、柱体积1.5L大孔吸附树脂柱(罗门哈斯公司的 XAD-4)，上柱流速为2％CV/min，上柱吸附后用pH为5的硫酸水溶液2CV 洗脱，再用含20％乙醇的pH5的硫酸水溶液1CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为1％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素 B母核初制品)，其收率为90％，纯度为84％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至28mL，并调节pH至4.5，得浓缩液；浓缩的压力为0.1；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比8:1、柱体积200mL十八烷基(C18)键合硅胶层析柱(苏州赛分科技有限公司的填料HP-C18)，然后用pH为4.5的硫酸水溶液2CV冲洗，最后用含20％的甲醇的pH4.5的硫酸水溶液0.5CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为2％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为75％，纯度为96.5％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1以下，减压浓缩的压力为0.05MPa，时间为5，45℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为棘白菌素B母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为96.5％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为65％。
实施例7
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2.5L滤液，调节滤液pH 为pH4，上高径比6:1、柱体积1.5L大孔吸附树脂柱(罗门哈斯公司的 XAD-18)，上柱流速为1％CV/min，上柱吸附后用pH为3的盐酸水溶液3CV 洗脱，再用含8％甲醇的pH4的盐酸水溶液2CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为2％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素 B母核初制品)，其收率为80％，纯度为86％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至700mL，并调节pH至5，得浓缩液；浓缩的压力为0.05MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比8:1、柱体积800mL的圆形微球树脂层析柱(苏州纳微科技公司的型号为NM100的大孔吸附微球树脂)，上柱流速为1％CV/min，然后用pH为4的盐酸水溶液2CV冲洗，最后用含16％乙醇的pH4的盐酸水溶液0.5CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为3％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为82％，纯度为92％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，减压浓缩的压力为0.05MPa，时间为4小时，45℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为棘白菌素B母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为92％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为65％。
实施例8
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2.6L滤液，调节滤液pH 为pH4.5，上高径比5:1、柱体积1.5L大孔吸附树脂柱(罗门哈斯公司的 XAD-18)，上柱流速为0.5％CV/min，上柱吸附后用pH为4.5的硫酸水溶液 3CV洗脱，再用含10％甲醇的pH4.5硫酸水溶液2CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为4％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品))，其收率为90％，纯度为85.5％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至600mL，并调节pH至5，得浓缩液；浓缩的压力为0.05MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比10:1、柱体积800mL的圆形微球树脂层析柱(苏州纳微科技公司的型号为NM100的大孔吸附微球树脂)，上柱流速为2％CV/min，然后用pH4.5的硫酸水溶液2CV冲洗，最后用含20％乙醇的pH4.5硫酸水溶液0.5CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为4％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为75％，纯度为93％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，减压浓缩的压力为0.05MPa，时间为4.5小时，42℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为棘白菌素B 母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为93％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为66％。
实施例9
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2L滤液，调节滤液pH 为pH5，上高径比5:1、柱体积1.5L大孔吸附树脂柱(罗门哈斯公司XAD-4)，上柱流速为1％CV/min，上柱吸附后用pH5的盐酸水溶液2CV洗脱，再用含12％甲醇的pH5的盐酸水溶液2CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为2％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)，其收率为87％，纯度为86％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至400mL，并调节pH至4.5，得浓缩液；浓缩的压力为0.1MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比10:1、柱体积800mL的圆形微球树脂层析柱(苏州纳微科技公司的型号为NM100的大孔吸附微球树脂)，上柱流速为0.5％CV/min，然后用pH为5的盐酸水溶液冲洗2CV，最后用含24％乙醇的pH5的盐酸水溶液1.5CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为1％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为78％，纯度为92.5％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，减压浓缩的压力为0.1MPa，时间为4.5小时，43℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为棘白菌素B 母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为92.5％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为64％。
实施例10
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2.4L滤液，调节滤液pH 为pH4，上高径比5:1、柱体积1.5L大孔吸附树脂柱(上海华震树脂公司的 HZ-816)，上柱流速为0.5％CV/min，上柱吸附后用pH3.5的磷酸水溶液2.3CV 洗脱，再用含14％甲醇的pH4磷酸水溶液2CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为1％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素B 母核初制品)，其收率为86％，纯度为84％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至400mL，并调节pH至3，得浓缩液；浓缩的压力为0.15MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比12:1、柱体积800mL的圆形微球树脂层析柱(苏州纳微科技公司的型号为NM100的大孔吸附微球树脂)，上柱流速为1.25％CV/min，然后用pH为4的磷酸水溶液冲洗2CV，最后用含25％甲醇的pH4的磷酸水溶液2.0CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为2.5％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为80％，纯度为93.5％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，减压浓缩的压力为0.05MPa，时间为5小时，42℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为棘白菌素B母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，检测结果为：纯度为93.5％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B 母核的总收率为66％。
实施例11
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到3L滤液，调节滤液pH 为pH4.5，上高径比5:1、柱体积1.5L的大孔吸附树脂柱(上海华震树脂公司的HZ-803型树脂)，上柱流速为0.5％CV/min，上柱吸附后用pH为4.5 的硫酸水溶液3CV洗脱，再用含16％甲醇的pH4.5硫酸水溶液2.5CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为1％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)，其收率为90％，纯度为84％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至800mL，并调节pH至3，得浓缩液；浓缩的压力为0.15MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比10:1、柱体积800mL的圆形微球树脂层析柱(苏州纳微科技公司的型号为NM100的大孔吸附微球树脂)，上柱流速为1％CV/min，然后用pH为3硫酸水溶液2CV冲洗，最后用含28％甲醇的pH3的硫酸水溶液0.8CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为4％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为84％，纯度为92.3％；
(4)减压浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，减压浓缩的压力为0.1MPa，时间为4.5小时，喷雾干燥，得纯白色无定形粉末，即为棘白菌素B母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为92.3％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为65％。
实施例12
(1)棘白菌素B母核的转化液的制备方法如上所示；
将制得的棘白菌素B母核的转化液抽滤，得到2L滤液，调节滤液pH 为pH5，上高径比5:1、柱体积1.5L的大孔吸附树脂柱(罗门哈斯公司的 XAD-18)，上柱流速为0.5％CV/min，上柱吸附后用pH5的盐酸水溶液2CV 洗脱，再用含18％甲醇的盐酸水溶液2CV将棘白菌素B母核集中冲洗下来，洗脱的流速为4％CV/min，收集洗脱液，得洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)，其收率为90％，纯度为84.5％；
(2)将步骤(1)中得到的洗脱液A(即棘白菌素B母核初制品)减压浓缩至200mL，并调节pH至5，得浓缩液；浓缩的压力为0.05MPa；
(3)将步骤(2)中得到的浓缩液上高径比10:1、柱体积800mL的圆形微球树脂层析柱(苏州纳微科技公司的型号为NM100的大孔吸附微球树脂)，上柱流速为2％CV/min，然后用pH为5的盐酸水溶液冲洗2CV，最后用含30％甲醇的盐酸水溶液0.5CV将棘白菌素B母核洗脱下来，洗脱的流速为1％CV/min；收集洗脱液，得洗脱液B(即棘白菌素B母核中制品)；中制品的收率为75％，纯度为93％；
(4)纳滤膜浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，43℃条件下冻干，得纯白色无定形粉末，即为棘白菌素B母核。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度，检测条件参照实施例 1，检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为93％。总收率的测定方法同实施例1，棘白菌素B母核的总收率为65％。
对比例1
步骤(1)中调节滤液pH至3-5，上大孔吸附树脂，用pH为6.5的酸水溶液洗脱，其余步骤同实施例(1)。此时ECBN不稳定，很容易破坏。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度和总收率；检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为85.5％；总收率为52％。
对比例2
步骤(2)中洗脱液浓缩，调节pH为2，其余步骤同实施例(1)。此时色谱柱对ECBN分离度较差。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度和总收率；检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为88％；总收率为70％。
对比例3
步骤(3)中用pH5.5的酸水溶液洗脱，其余步骤同实施例(1)。
利用高效液相色谱法检测棘白菌素B母核的纯度和总收率；检测结果为：棘白菌素B母核的纯度为90％；总收率为72％。
Claims (29)
1.一种棘白菌素B母核的提取方法，其特征在于：所述的提取方法包括以下步骤：(1)去除棘白菌素B母核的转化液中的固体物质，得滤液，调节滤液pH至3-5，上大孔吸附树脂，用pH3-5的无机酸水溶液洗脱，再用含脂肪醇的无机酸水溶液洗脱，收集含脂肪醇的无机酸水溶液的洗脱液，得洗脱液A；(2)将步骤(1)中的洗脱液A浓缩，并调节pH至3-5，得浓缩液；(3)将步骤(2)中的浓缩液上十八烷基键合硅胶层析柱或八烷基键合硅胶层析柱，用pH3-5的无机酸水溶液洗脱，再用含脂肪醇的无机酸水溶液洗脱，收集含脂肪醇的无机酸水溶液的洗脱液，得洗脱液B；(4)将步骤(3)中的洗脱液B浓缩，即可；
步骤(1)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液中的无机酸水溶液为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中的一种或多种；
步骤(1)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇为乙醇；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中的一种或多种；
步骤(3)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液中的无机酸水溶液为盐酸水溶液和/或硫酸水溶液；
步骤(3)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇为甲醇；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的去除棘白菌素B母核的转化液中的固体物质的方法为抽滤；
步骤(1)中，所述的棘白菌素B母核的转化液的制备方法包括以下步骤：将培养好的转化用菌体放入pH为6.0-7.0的磷酸缓冲液悬浮，加入棘白菌素B精制品，混合均匀，25-30℃下转化反应3-5小时，得到含棘白菌素B母核的转化液；
步骤(1)中，调节所述的滤液pH至3.5-4.5；
步骤(1)中，所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯-二乙烯苯型大网格中等极性树脂；
步骤(1)中，所述的上大孔吸附树脂的上柱流速为0.5％-2％CV/min；所述的柱体积为大孔吸附树脂的柱体积。
3.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，调节所述的滤液pH至4-4.5。
4.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的大孔吸附树脂为上海华震树脂公司的HZ806型树脂、上海华震树脂公司的HZ-816型树脂、上海华震树脂公司的HZ-803型树脂、罗门哈斯公司的XAD-4型树脂、罗门哈斯公司的XAD-2型树脂或罗门哈斯公司的XAD-18型树脂。
5.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的上大孔吸附树脂的上柱流速为1％CV/min；所述的柱体积为大孔吸附树脂的柱体积。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液的制备方法为：将无机酸与纯水混合，并用pH试纸比对，获得相对应的pH值的无机酸水溶液，即可；
步骤(1)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液的用量以大孔吸附树脂的柱体积计为1-4CV。
7.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液的用量以大孔吸附树脂的柱体积计为2-3CV。
8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇的含量为8％-20％，所述百分比为体积百分比；
步骤(1)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液为pH3-5的无机酸水溶液；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的无机酸水溶液的制备方法为：将无机酸与纯水混合，并用pH试纸比对，获得相对应的pH值的无机酸水溶液，即可；
步骤(1)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液的用量以大孔吸附树脂的柱体积计为1-4CV；
步骤(1)中，所述的洗脱的流速为1％-4％CV/min；所述的柱体积为大孔吸附树脂的柱体积。
9.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇的含量为12％，所述百分比为体积百分比。
10.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液的用量以大孔吸附树脂的柱体积计为2-3CV。
11.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的洗脱的流速为2％CV/min；所述的柱体积为大孔吸附树脂的柱体积。
12.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的浓缩为减压浓缩或纳滤膜浓缩；
步骤(2)中，所述的浓缩的终点的判断方法为：当浓缩液在步骤(3)中上所述的十八烷基键合硅胶层析柱或八烷基键合硅胶层析柱时，所述的浓缩液的体积为所述的十八烷基键合硅胶层析柱或八烷基键合硅胶层析柱的1/15-1/5CV。
13.如权利要求12所述的提取方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的减压浓缩的压力为0.05-0.15MPa，所述的减压浓缩的时间为4-5小时。
14.如权利要求12所述的提取方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的浓缩的终点的判断方法为：当浓缩液在步骤(3)中上所述的十八烷基键合硅胶层析柱或八烷基键合硅胶层析柱时，所述的浓缩液的体积为所述的十八烷基键合硅胶层析柱或八烷基键合硅胶层析柱的1/10CV。
15.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的十八烷基键合硅胶层析柱中的十八烷基键合硅胶填料为球形亲水型填料或球形非亲水型填料；所述的十八烷基键合硅胶填料的特征孔径为调和粒径为10-70μm；
步骤(3)中，所述的八烷基键合硅胶层析柱中的八烷基键合硅胶填料为球形亲水型填料或球形非亲水型填料；所述的八烷基键合硅胶填料的特征孔径为调和粒径为10-70μm。
16.如权利要求15所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的十八烷基键合硅胶填料为苏州赛分科技有限公司的填料GP-C18、苏州赛分科技有限公司的填料HP-C18、上海大有色谱技术服务有限公司的填料DYB71306和上海大有色谱技术服务有限公司填料的DYB71326中的一种或多种。
17.如权利要求15所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的八烷基键合硅胶填料为苏州赛分科技有限公司的填料HP-C8、上海大有色谱技术服务有限公司的填料DYB71336和上海大有色谱技术服务有限公司填料的DYB72194中的一种或多种。
18.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的十八烷基键合硅胶层析柱、八烷基键合硅胶层析柱的上柱流速为0.5％-2％CV/min；所述的柱体积为步 骤(3)中的层析柱的柱体积；
步骤(3)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液中的无机酸水溶液的制备方法为将无机酸与纯水混合，并用pH试纸比对，获得相对应的pH值的无机酸水溶液，即可；
步骤(3)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液的用量以步骤(3)中的层析柱的柱体积计为1-4CV。
19.如权利要求18所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的十八烷基键合硅胶层析柱、八烷基键合硅胶层析柱的上柱流速为1％CV/min；所述的柱体积为步 骤(3)中的层析柱的柱体积。
20.如权利要求18所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的pH3-5的无机酸水溶液的用量以步骤(3)中的层析柱的柱体积计为2-3CV。
21.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇的含量为1％-30％，所述百分比为体积百分比；
步骤(3)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的酸水溶液为pH3-5的无机酸水溶液；所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的酸水溶液的制备方法为：将酸与纯水混合，并用pH试纸比对，获得相对应的pH值的无机酸水溶液，即可；
步骤(3)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液的用量以步骤(3)中的层析柱的柱体积计为0.5-2.5CV。
22.如权利要求21所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液中的脂肪醇的含量为3％-25％，所述百分比为体积百分比。
23.如权利要求21所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液的用量以步骤(3)中的层析柱的柱体积计为1-2CV。
24.如权利要求23所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的含脂肪醇的无机酸水溶液的用量以步骤(3)中的层析柱的柱体积计为1.5CV。
25.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的洗脱的流速为1％-4％CV/min；所述的柱体积为步骤(3)中的层析柱的柱体积。
26.如权利要求25所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的洗脱的流速为2％CV/min；所述的柱体积为步 骤(3)中的层析柱的柱体积。
27.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的浓缩为减压浓缩或纳滤膜浓缩；
步骤(4)中，所述的浓缩的终点为浓缩至脂肪醇的含量1％以下，所述百分比为脂肪醇占浓缩后浓缩物的质量百分比；
步骤(4)中，所述的减压浓缩后，冻干或者喷雾干燥；所述的冻干为在-70℃～-80℃条件下冻干。
28.如权利要求27所述的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的减压浓缩的压力为0.05-0.15MPa，所述的减压浓缩的时间为4-5小时。
29.如权利要求27所述的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的浓缩的终点为浓缩至脂肪醇的含量0.1％以下，所述百分比为脂肪醇占浓缩后浓缩物的质量百分比。
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